Embryonale Stamcelcultuur en Differentiatie
Embryonaal stamcellen, of ES-cellen, hebben een aantal unieke eigenschappen die ze onderscheiden van normale volwassen cellen. Daarom hebben wetenschappers speciale kweektechnieken ontwikkeld om deze eigenschappen te behouden of te benutten. Wanneer ze goed worden gekweekt, kunnen ES-cellen zich oneindig delen om meer van zichzelf te maken. Tegelijkertijd kunnen ES-cellen, door de kweekcondities te veranderen, worden gericht om zich te differentiëren in bijna elk celtype dat in ons lichaam voorkomt; dit vermogen van ES-cellen wordt 'pluripotentie' genoemd.
In deze video leer je hoe je ES-cellen kweekt en passeert zodat ze hun unieke eigenschappen behouden, hoe je differentiatie in ES-cellen kunt induceren om specifieke celtypen te vormen, en op welke manieren ES-celkweek- en differentiatietechnieken tegenwoordig door onderzoekers worden gebruikt en verfijnd.
Voordat we ingaan op de details van de procedures voor ES-celonderhoud, is het belangrijk om eerst te begrijpen wat ES-celdifferentiatie voorkomt of stimuleert. Om hun unieke eigenschappen van pluripotentie en zelfvernieuwing te behouden, moeten ES-cellen worden gekweekt met specifieke factoren in hun groeimedium die spontane differentiatie onderdrukken.
Dit wordt meestal gedaan door ES-cellen te kweken op een laag van 'feeders', meestal muis embryonale fibroblasten, of MEF's. Feedercellen 'voeden' de ES-cellen bepaalde factoren, zoals activin A, die helpen om ES-cellen in hun ongedifferentieerde toestand te houden.
Onlangs hebben wetenschappers ook feeder-vrije kweekmethoden ontwikkeld waarbij ES-cellen worden gekweekt in media met de benodigde factoren toegevoegd in een gedefinieerd recept. Deze aanpak vermindert variabiliteit en verwijdert het niet-menselijke component uit ES-celculturen, wat een voorwaarde is voor klinische toepassingen.
Een andere eigenschap van ES-cellen is dat ze van nature in clusters of kolonies groeien, en de neiging hebben om een lage overlevingskans te hebben wanneer ze worden losgemaakt tot enkele cellen, vooral menselijke ES-cellen. Als gevolg hiervan vereist het passeren van menselijke ES-cellen over het algemeen dat ze in intacte klonters worden gehouden door mechanische 'picking'.
Wanneer ES-cellen worden gekweekt onder niet-adhesieve omstandigheden, vormen ze 3D-aggregaten die bekend staan als embryoïde lichamen, of EB's, waarin de ES-cellen zich zullen differentiëren in alle verschillende celtypen. Door de differentiatieomstandigheden te variëren, zoals het toevoegen van specifieke groeifactoren aan het medium, ontwikkelen wetenschappers methoden om ES-celdifferentiatie in specifieke celtypen te richten.
Nu je de principes achter ES-celonderhoud en differentiatie begrijpt, laten we kijken naar het kweken en passeren van ES-cellen op MEF-feeders.
MEF's worden verkregen uit vroege muisembryo's en worden vervolgens geïnactiveerd door chemicaliën of straling om te voorkomen dat ze zich verder delen. Geïnactiveerde MEF's moeten op gelatiniseerde weefselkweekschalen worden geplaatst, ten minste één dag voordat er ES-cellen worden gekweekt. Wanneer de feeders volledig zijn bezonken, worden ES-cellen ontdooid en op de schalen gezaaid.
In de dagen die volgen, zullen ES-cellen groeien tot grote kolonies. Voordat de kolonies elkaar raken en versmelten, moet de ES-cultuur worden gepasseerd. Men moet de morfologie van de ES-cellen observeren om te zien of ze tekenen van differentiatie vertonen. Ongedifferentieerde ES-kolonies zien er over het algemeen goed gedefinieerd en homogeen uit, terwijl gedifferentieerde cellen eruitzien als doffe, onregelmatig gevormde 'cobblestones'.
Als kolonies 70% of meer differentiatie vertonen, of als ze schaars zijn, snijdt men mechanisch de ongedifferentieerde kolonies uit en brengt ze over naar een nieuwe feederplaat. Anders verwijdert men gewoon de gedifferentieerde gebieden of kolonies en gaat men door met het passeren.
Zodra de gedifferentieerde kolonies zijn opgeruimd, worden proteolytische enzymen, zoals collagenase, toegevoegd om de cellen van de plaat te tillen met incubatie bij 37°C gedurende de juiste hoeveelheid tijd. Vervolgens wordt vers ES-medium toegevoegd om de enzymatische reacties te stoppen. De kolonies worden mechanisch losgemaakt van de plaat en overgebracht naar een centrifugeerbuis, waar ze met zacht pipetteren worden opgebroken in de gewenste groottes. De ES-cellen worden verzameld door centrifugatie, opnieuw gesuspendeerd in ES-medium en geplaatst op de voorbereide feederplaten.
Nadat we hebben geleerd hoe we ES-cellen passen, laten we kijken naar een van de meer gebruikelijke technieken die worden gebruikt om ES-cellen te differentiëren in embryoïde lichamen - de hangende druppelmethode.
Om te beginnen worden ES-cellen losgemaakt met behulp van proteolytische enzymen zoals collagenase, en verdund tot de gewenste concentratie in media met lijnspecifieke differentiatiefactoren. De ES-celsuspensie wordt vervolgens in druppels op de deksel van een bacteriële petrischaal gedeponeerd. Het deksel wordt snel omgekeerd en op de schaal geplaatst, zodat de mediadruppels ondersteboven hangen en de embryoïde lichamen zich kunnen ontwikkelen.
Na ongeveer twee dagen kunnen de druppels met EB's worden verzameld en op niet-adhesive platen worden geplaatst voor verdere cultivatie. Op het juiste tijdstip voor de gewenste cellijn worden embryoïde lichamen teruggeplaatst op gelatiniseerde adhesieve weefselkweekschalen voor verdere differentiatie.
Nu we de basistechnieken van het kweken en differentiëren van ES-cellen hebben behandeld, laten we kijken hoe ze zijn aangepast voor specifieke experimentele behoeften.
Zoals eerder vermeld, kunnen ES-cellen worden gericht om zich te differentiëren in specifieke celtypen onder verschillende kweekcondities. In dit experiment produceerden wetenschappers motorneuronen uit menselijke ES-cellen. Dit werd gedaan door
Het kweken van embryonale stamcellen (ES) vereist omstandigheden die deze cellen in een ongedifferentieerde toestand houden om hun capaciteit voor zel…
Embryonaal stamcellen, of ES-cellen, hebben een aantal unieke eigenschappen die ze onderscheiden van normale volwassen cellen. Daarom hebben wetenschappers speciale kweektechnieken ontwikkeld om deze eigenschappen te behouden of te benutten. Wanneer ze goed worden gekweekt, kunnen ES-cellen zich oneindig delen om meer van zichzelf te maken. Tegelijkertijd kunnen ES-cellen, door de kweekcondities te veranderen, worden gericht om zich te differentiëren in bijna elk celtype dat in ons lichaam voorkomt; dit vermogen van ES-cellen wordt 'pluripotentie' genoemd.
In deze video leer je hoe je ES-cellen kweekt en passeert zodat ze hun unieke eigenschappen behouden, hoe je differentiatie in ES-cellen kunt induceren om specifieke celtypen te vormen, en op welke manieren ES-celkweek- en differentiatietechnieken tegenwoordig door onderzoekers worden gebruikt en verfijnd.
Voordat we ingaan op de details van de procedures voor ES-celonderhoud, is het belangrijk om eerst te begrijpen wat ES-celdifferentiatie voorkomt of stimuleert. Om hun unieke eigenschappen van pluripotentie en zelfvernieuwing te behouden, moeten ES-cellen worden gekweekt met specifieke factoren in hun groeimedium die spontane differentiatie onderdrukken.
Dit wordt meestal gedaan door ES-cellen te kweken op een laag van 'feeders', meestal muis embryonale fibroblasten, of MEF's. Feedercellen 'voeden' de ES-cellen bepaalde factoren, zoals activin A, die helpen om ES-cellen in hun ongedifferentieerde toestand te houden.
Onlangs hebben wetenschappers ook feeder-vrije kweekmethoden ontwikkeld waarbij ES-cellen worden gekweekt in media met de benodigde factoren toegevoegd in een gedefinieerd recept. Deze aanpak vermindert variabiliteit en verwijdert het niet-menselijke component uit ES-celculturen, wat een voorwaarde is voor klinische toepassingen.
Een andere eigenschap van ES-cellen is dat ze van nature in clusters of kolonies groeien, en de neiging hebben om een lage overlevingskans te hebben wanneer ze worden losgemaakt tot enkele cellen, vooral menselijke ES-cellen. Als gevolg hiervan vereist het passeren van menselijke ES-cellen over het algemeen dat ze in intacte klonters worden gehouden door mechanische 'picking'.
Wanneer ES-cellen worden gekweekt onder niet-adhesieve omstandigheden, vormen ze 3D-aggregaten die bekend staan als embryoïde lichamen, of EB's, waarin de ES-cellen zich zullen differentiëren in alle verschillende celtypen. Door de differentiatieomstandigheden te variëren, zoals het toevoegen van specifieke groeifactoren aan het medium, ontwikkelen wetenschappers methoden om ES-celdifferentiatie in specifieke celtypen te richten.
Nu je de principes achter ES-celonderhoud en differentiatie begrijpt, laten we kijken naar het kweken en passeren van ES-cellen op MEF-feeders.
MEF's worden verkregen uit vroege muisembryo's en worden vervolgens geïnactiveerd door chemicaliën of straling om te voorkomen dat ze zich verder delen. Geïnactiveerde MEF's moeten op gelatiniseerde weefselkweekschalen worden geplaatst, ten minste één dag voordat er ES-cellen worden gekweekt. Wanneer de feeders volledig zijn bezonken, worden ES-cellen ontdooid en op de schalen gezaaid.
In de dagen die volgen, zullen ES-cellen groeien tot grote kolonies. Voordat de kolonies elkaar raken en versmelten, moet de ES-cultuur worden gepasseerd. Men moet de morfologie van de ES-cellen observeren om te zien of ze tekenen van differentiatie vertonen. Ongedifferentieerde ES-kolonies zien er over het algemeen goed gedefinieerd en homogeen uit, terwijl gedifferentieerde cellen eruitzien als doffe, onregelmatig gevormde 'cobblestones'.
Als kolonies 70% of meer differentiatie vertonen, of als ze schaars zijn, snijdt men mechanisch de ongedifferentieerde kolonies uit en brengt ze over naar een nieuwe feederplaat. Anders verwijdert men gewoon de gedifferentieerde gebieden of kolonies en gaat men door met het passeren.
Zodra de gedifferentieerde kolonies zijn opgeruimd, worden proteolytische enzymen, zoals collagenase, toegevoegd om de cellen van de plaat te tillen met incubatie bij 37°C gedurende de juiste hoeveelheid tijd. Vervolgens wordt vers ES-medium toegevoegd om de enzymatische reacties te stoppen. De kolonies worden mechanisch losgemaakt van de plaat en overgebracht naar een centrifugeerbuis, waar ze met zacht pipetteren worden opgebroken in de gewenste groottes. De ES-cellen worden verzameld door centrifugatie, opnieuw gesuspendeerd in ES-medium en geplaatst op de voorbereide feederplaten.
Nadat we hebben geleerd hoe we ES-cellen passen, laten we kijken naar een van de meer gebruikelijke technieken die worden gebruikt om ES-cellen te differentiëren in embryoïde lichamen - de hangende druppelmethode.
Om te beginnen worden ES-cellen losgemaakt met behulp van proteolytische enzymen zoals collagenase, en verdund tot de gewenste concentratie in media met lijnspecifieke differentiatiefactoren. De ES-celsuspensie wordt vervolgens in druppels op de deksel van een bacteriële petrischaal gedeponeerd. Het deksel wordt snel omgekeerd en op de schaal geplaatst, zodat de mediadruppels ondersteboven hangen en de embryoïde lichamen zich kunnen ontwikkelen.
Na ongeveer twee dagen kunnen de druppels met EB's worden verzameld en op niet-adhesive platen worden geplaatst voor verdere cultivatie. Op het juiste tijdstip voor de gewenste cellijn worden embryoïde lichamen teruggeplaatst op gelatiniseerde adhesieve weefselkweekschalen voor verdere differentiatie.
Nu we de basistechnieken van het kweken en differentiëren van ES-cellen hebben behandeld, laten we kijken hoe ze zijn aangepast voor specifieke experimentele behoeften.
Zoals eerder vermeld, kunnen ES-cellen worden gericht om zich te differentiëren in specifieke celtypen onder verschillende kweekcondities. In dit experiment produceerden wetenschappers motorneuronen uit menselijke ES-cellen. Dit werd gedaan door
Embryonaal stamcellen, of ES-cellen, hebben een aantal unieke eigenschappen die ze onderscheiden van normale volwassen cellen. Daarom hebben wetenschappers speciale kweektechnieken ontwikkeld om deze eigenschappen te behouden of te benutten. Wanneer ze goed worden gekweekt, kunnen ES-cellen zich oneindig delen om meer van zichzelf te maken. Tegelijkertijd kunnen ES-cellen, door de kweekcondities te veranderen, worden gericht om zich te differentiëren in bijna elk celtype dat in ons lichaam voorkomt; dit vermogen van ES-cellen wordt 'pluripotentie' genoemd.
In deze video leer je hoe je ES-cellen kweekt en passeert zodat ze hun unieke eigenschappen behouden, hoe je differentiatie in ES-cellen kunt induceren om specifieke celtypen te vormen, en op welke manieren ES-celkweek- en differentiatietechnieken tegenwoordig door onderzoekers worden gebruikt en verfijnd.
Voordat we ingaan op de details van de procedures voor ES-celonderhoud, is het belangrijk om eerst te begrijpen wat ES-celdifferentiatie voorkomt of stimuleert. Om hun unieke eigenschappen van pluripotentie en zelfvernieuwing te behouden, moeten ES-cellen worden gekweekt met specifieke factoren in hun groeimedium die spontane differentiatie onderdrukken.
Dit wordt meestal gedaan door ES-cellen te kweken op een laag van 'feeders', meestal muis embryonale fibroblasten, of MEF's. Feedercellen 'voeden' de ES-cellen bepaalde factoren, zoals activin A, die helpen om ES-cellen in hun ongedifferentieerde toestand te houden.
Onlangs hebben wetenschappers ook feeder-vrije kweekmethoden ontwikkeld waarbij ES-cellen worden gekweekt in media met de benodigde factoren toegevoegd in een gedefinieerd recept. Deze aanpak vermindert variabiliteit en verwijdert het niet-menselijke component uit ES-celculturen, wat een voorwaarde is voor klinische toepassingen.
Een andere eigenschap van ES-cellen is dat ze van nature in clusters of kolonies groeien, en de neiging hebben om een lage overlevingskans te hebben wanneer ze worden losgemaakt tot enkele cellen, vooral menselijke ES-cellen. Als gevolg hiervan vereist het passeren van menselijke ES-cellen over het algemeen dat ze in intacte klonters worden gehouden door mechanische 'picking'.
Wanneer ES-cellen worden gekweekt onder niet-adhesieve omstandigheden, vormen ze 3D-aggregaten die bekend staan als embryoïde lichamen, of EB's, waarin de ES-cellen zich zullen differentiëren in alle verschillende celtypen. Door de differentiatieomstandigheden te variëren, zoals het toevoegen van specifieke groeifactoren aan het medium, ontwikkelen wetenschappers methoden om ES-celdifferentiatie in specifieke celtypen te richten.
Nu je de principes achter ES-celonderhoud en differentiatie begrijpt, laten we kijken naar het kweken en passeren van ES-cellen op MEF-feeders.
MEF's worden verkregen uit vroege muisembryo's en worden vervolgens geïnactiveerd door chemicaliën of straling om te voorkomen dat ze zich verder delen. Geïnactiveerde MEF's moeten op gelatiniseerde weefselkweekschalen worden geplaatst, ten minste één dag voordat er ES-cellen worden gekweekt. Wanneer de feeders volledig zijn bezonken, worden ES-cellen ontdooid en op de schalen gezaaid.
In de dagen die volgen, zullen ES-cellen groeien tot grote kolonies. Voordat de kolonies elkaar raken en versmelten, moet de ES-cultuur worden gepasseerd. Men moet de morfologie van de ES-cellen observeren om te zien of ze tekenen van differentiatie vertonen. Ongedifferentieerde ES-kolonies zien er over het algemeen goed gedefinieerd en homogeen uit, terwijl gedifferentieerde cellen eruitzien als doffe, onregelmatig gevormde 'cobblestones'.
Als kolonies 70% of meer differentiatie vertonen, of als ze schaars zijn, snijdt men mechanisch de ongedifferentieerde kolonies uit en brengt ze over naar een nieuwe feederplaat. Anders verwijdert men gewoon de gedifferentieerde gebieden of kolonies en gaat men door met het passeren.
Zodra de gedifferentieerde kolonies zijn opgeruimd, worden proteolytische enzymen, zoals collagenase, toegevoegd om de cellen van de plaat te tillen met incubatie bij 37°C gedurende de juiste hoeveelheid tijd. Vervolgens wordt vers ES-medium toegevoegd om de enzymatische reacties te stoppen. De kolonies worden mechanisch losgemaakt van de plaat en overgebracht naar een centrifugeerbuis, waar ze met zacht pipetteren worden opgebroken in de gewenste groottes. De ES-cellen worden verzameld door centrifugatie, opnieuw gesuspendeerd in ES-medium en geplaatst op de voorbereide feederplaten.
Nadat we hebben geleerd hoe we ES-cellen passen, laten we kijken naar een van de meer gebruikelijke technieken die worden gebruikt om ES-cellen te differentiëren in embryoïde lichamen - de hangende druppelmethode.
Om te beginnen worden ES-cellen losgemaakt met behulp van proteolytische enzymen zoals collagenase, en verdund tot de gewenste concentratie in media met lijnspecifieke differentiatiefactoren. De ES-celsuspensie wordt vervolgens in druppels op de deksel van een bacteriële petrischaal gedeponeerd. Het deksel wordt snel omgekeerd en op de schaal geplaatst, zodat de mediadruppels ondersteboven hangen en de embryoïde lichamen zich kunnen ontwikkelen.
Na ongeveer twee dagen kunnen de druppels met EB's worden verzameld en op niet-adhesive platen worden geplaatst voor verdere cultivatie. Op het juiste tijdstip voor de gewenste cellijn worden embryoïde lichamen teruggeplaatst op gelatiniseerde adhesieve weefselkweekschalen voor verdere differentiatie.
Nu we de basistechnieken van het kweken en differentiëren van ES-cellen hebben behandeld, laten we kijken hoe ze zijn aangepast voor specifieke experimentele behoeften.
Zoals eerder vermeld, kunnen ES-cellen worden gericht om zich te differentiëren in specifieke celtypen onder verschillende kweekcondities. In dit experiment produceerden wetenschappers motorneuronen uit menselijke ES-cellen. Dit werd gedaan door
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What factors maintain embryonic stem cells in an undifferentiated state?
Embryonic stem cells require specific factors in their growth medium to suppress spontaneous differentiation and retain pluripotency. Feeder cells, typically mouse embryonic fibroblasts (MEFs), provide factors like activin A that maintain ES cells undifferentiated. Alternatively, feeder-free methods use defined media recipes with necessary factors added directly, reducing variability and enabling clinical applications.
Q2: Why do human embryonic stem cells require mechanical picking during passaging?
Human ES cells naturally grow in clusters and have low survival rates when dissociated into single cells. Mechanical picking preserves intact cell clumps, maintaining viability during passaging. This approach contrasts with feeder-free methods using ROCK inhibitors, which allow single-cell suspension passaging at high density while improving cell survival and reducing culture heterogeneity.
Q3: What is the hanging drop method used for in embryonic stem cell differentiation?
The hanging drop method directs ES cell differentiation into specific cell types by forming embryoid bodies (EBs). ES cells are suspended in media containing lineage-specific differentiation factors and deposited as drops on inverted petri dish lids. After two days, EBs are collected and plated onto non-adherent plates, then transferred to adherent dishes at appropriate timepoints for further differentiation.
Q4: How can embryonic stem cells be directed to differentiate into specific cell types?
Scientists direct ES cell differentiation by varying culturing conditions and adding specific growth factors to the medium. For example, motor neurons are produced by first adding factors that direct embryoid bodies toward the neural lineage, followed by chemicals and plating conditions that specify motor neuron identity. Similar approaches have successfully generated rhythmically beating heart muscle cells.
Q5: What are embryoid bodies and how do they form?
Embryoid bodies (EBs) are three-dimensional aggregates that form when ES cells grow in non-adherent conditions. Within EBs, ES cells differentiate into multiple cell types, mimicking early embryonic development. By controlling differentiation conditions and growth factors, researchers can direct EB development toward specific cell lineages for regenerative medicine applications.
Q6: What is pluripotency and why is it important for embryonic stem cell research?
Pluripotency is the ability of ES cells to differentiate into almost any cell type found in the body. This unique property allows researchers to generate specialized cells for studying embryonic development and developing treatments for degenerative diseases. Maintaining pluripotency requires culturing ES cells with specific factors that suppress spontaneous differentiation.
Q7: How do scientists study early embryonic development using differentiated embryonic stem cells?
Because differentiating ES cells mimic events occurring during natural embryonic development, researchers use them to investigate developmental biology. For instance, scientists study X-chromosome inactivation (XCI) by visualizing specific RNAs and proteins in developing embryoid bodies. This approach provides valuable insights into crucial developmental processes without requiring intact embryos.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
1:07
Principles of ES Cell Culturing and Differentiation
3:13
Growing and Passaging ES Cells on MEFs
5:26
ES Differentiation by the Hanging Drop Method
6:32
Applications
9:08
Summary