Name: Voorbereiding en Fotoakoestisch Analyse van Cellular Voertuigen die goud nanorods (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer hoe je tumor-geassocieerde macrofagen laadt met goud nanorods voor fotoakoestische beeldvorming van kanker. Deze methode maakt gerichte aflevering van plasmonische deeltjes naar tumoren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Regione Toscana en de Europese Gemeenschap in het kader van de ERANET + Projecten LUS BEL en BI-TRE.

Opmerking: Alle concentraties van goud nanorods worden uitgedrukt in nominale Au molariteiten. Ter vergelijking met andere werken, mee dat 1 M Au ruwweg overeen met 20 uM goud nanorods, in ons geval. 1. Bereiding van kationische Gold nanorods Opmerking: De werkwijze begint met de synthese van cetrimoniumbromide (CTAB) -getermineerd goud nanorods de autokatalytische reductie van HAuCl 4 met ascorbinezuur, volgens het protocol geïntroduceerd door Nikoobakht et al 25 en aangepast aan Ratto et al 26... Vervolgens worden deze goud nanorods worden gewijzigd om meer biocompatibiliteit en affiniteit krijgen voor plasma membranen, door de combinatie van polyethyleenglycol bundels 10, 11, 27, 28 en 22 quaternaire ammoniumverbindingen. <ol><li> Zuiver 24 ml CTAB-afgedekte gouden nanorods bij een concentration van 450 uM Au door twee cycli van centrifugatie (12.000 x g, 30 min) en decanteren. Zorg ervoor dat de verhouding van dode volume van het oorspronkelijke volume is ongeveer 1/200 of lager voor alle centrifugeren stappen in dit protocol. Gebruik 500 uM CTAB als waterige wasoplossing en tenslotte de deeltjes over in 6 ml 100 mM acetaatbuffer bij pH 5 met 500 uM CTAB en 0,005% (v / v) polysorbaat 20. </li><li> Voeg 30 ul 10 mM waterige alfa-methoxy-omega-mercapto-poly (ethyleenglycol) (MW ~ 5000) en laten reageren gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 30 ul 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N-trimethylammonium bromide in dimethylsulfoxide en laat rusten gedurende 24 uur bij 37 ° C. </li><li> Voeg vervolgens 18 ml 0,005% (v / v) polysorbaat 20 in water en zuivering hiervan door vier cycli van centrifugatie (12.000 x g, 30 min) en decanteren. Met 0,005% (v / v) polysorbaat 20 in water als wasoplossing en tenslotte de deeltjes over in 2,4 ml steriel PBS bij pH7.4. De uiteindelijke nominale concentratie van goud is 4,5 mM. </li></ol> 2. Laden van Murine macrofagen met Gouden nanorods <ol><li> Gebruik de monocyt / macrophagic cellijn J774A.1 en DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1 mM glutamine, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine als cultuurmedium. Plaat 5 x 10 5 cellen in vier petrischalen met een diameter van 60 mm en laat ze groeien 24 uur, om te worden subconfluente ten tijde van onthechting (zie stap 2,2). <ol><li> Gehele protocol behouden de cellen onder standaard kweekcondities (37 ° C, 5% CO2, 95% lucht en 100% relatieve vochtigheid). Gebruik een laminaire stroming kabinet en passende persoonlijke beschermingsmiddelen aan de cellen te manipuleren. </li></ol></li><li> Na 24 uur, laadt u de cellen met kationische goud nanorods en hen voorbereiden om te worden ingebed in chitosan films: <ol><li> Zodat de deeltjes tot worden door de cellen, voeg een hoeveelheid van 4,5kationische mM Au goud nanorods in PBS aan elke petrischaal, zodat een eindconcentratie van 100 uM Au bereiken. Laat de Petrischalen in incubatie gedurende 24 uur. </li><li> Vervolgens nemen de cellen onder een optische microscoop om hun goede omstandigheden en de upload te bevestigen. De cellen moeten hun normale morfologie en een aantal donkere intracellulaire blaasjes vertonen. Maak de cellen door een schraper, samenvoegen die uit twee petrischalen, teneinde een geschikt aantal cellen bereiken de volgende stappen (minimaal 2 x 10 6 cellen) en centrifugeer ze (120 xg, 6 min) alle elimineren overmaat kationische goud nanorods. De cellulaire pellet moet kijken bijna zwart. </li><li> Suspendeer de pellet in 2 ml PBS en tel de cellen door het gebruik van een Bürker kamer. Centrifugeer een suspensie met 2 x 10 6 cellen (120 xg, 6 min) en de pellet op te lossen in 2 ml 3,6% (w / v) formaldehyde in PBS gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Tenslotte driemaal wassen dit pellet door centrifugation (120 xg, 6 min) om het fixeermiddel verwijderd. Met PBS als wasoplossing. </li></ol></li></ol> 3. Verankering van macrofagen in Chitosan Films Opmerking: De bijzondere eigenschappen van chitosan 26, 27, 28, 29 worden benut biomimetische fantomen die MAK gekleurd met kationische goud nanorods produceren. Met betrekking tot andere hydrogels zoals agarose, chitosan maakt films die veel sterker en dunner zijn, wat essentieel is voor PA 6 microscopie. Het vervaardigen van deze fantomen volgens eerdere protocollen 29, 30, 31 met enkele modificaties zoals beschreven in het volgende 30 uitgevoerd. <ol><li> Bereid een aangezuurd (pH 4,5, verkregen door toevoeging van azijnzuur) of viskeuze 3% (w / v) laag gewicht chitosan molecuulgewicht (gemiddeld MW 120 kDa) oplossing grondig mengen enlaten gehomogeniseerd 24 uur bij 40 ° C. </li><li> Vervolgens meng murine macrofagen bevattende kationische goud nanorods (2 x 10 6 cellen) met 500 pl chitosan oplossing. </li><li> Voor het verkrijgen ~ 50 urn dik fantomen, giet 250 mg van het mengsel in 1,91 cm 2 polystyreen mallen en laat ze onder een stikstofstroom gedurende 24 uur. Daarna behandel deze monsters met 500 gl 1 M NaOH, teneinde verknoping te induceren en spoelen met 10 ml ultrazuiver water. </li></ol> 4. Test van de Stabiliteit van Fotoakoestisch Conversion Opmerking: De stabiliteit van PA omzetting wordt onderzocht met behulp van PA experimenten met de zelfgemaakte opstelling die is beschreven in ref 6. <ol><li> Schorsen chitosan film die de macrofagen in DI-water, bijvoorbeeld door het gebruik van een plastic houder ondergedompeld in een petrischaal, zodat een afstand van ~ 5 mm van de bodem van de plaat te houden. Zet deze plaat op een micrometrische XY podiumteneinde het monster positieregeling. </li><li> Richt een laserstraal met ~ 5 ns pulsduur in resonantie met de longitudinale plasmonische band van het goud nanorods (bijvoorbeeld van een optische parametrische oscillator door de derde harmonische van een Q-switched Nd gepompt: YAG laser met een golflengte van 400 - 2500 nm en pulsduur van 5 nsec) loodrecht op het filmoppervlak met een ~ 300 urn vlekdiameter. <ol><li> Plaats een verzwakker vóór de laser uitgang te stemmen de laser Fluence en gebruik een bundelsplitser deel van de laserstraal te richten op een energiemeter (bijvoorbeeld een pyro-elektrische detector) en monitor fluentie schommelingen. Handhaving van de optische Fluence hieronder ~ 1 mJ / cm2 per puls tijdens de uitlijning. Gebruik de juiste laserveiligheidsbrillen wanneer de laser is ingeschakeld. </li></ol></li><li> Dip een ultrasone transducer (frequentiebereik van 1 - 20 MHz) in de petrischaal ~ 2 mm off van de film oppervlak en de positie aan te passen met behulp van micrometrische vertalingenen rotatie fasen PA signaal uitgevoerd door de film te maximaliseren. </li><li> Bepaal een sonde Fluence F-LO, dat niet de steekproef 6 niet beschadigt: <ol><li> Bestralen een willekeurig punt van het monster bij een fluentie ongeveer 1 mJ / cm2 per puls tenminste 500 pulsen. Voor elke puls verwerven de overeenkomstige PA signaal van de ultrasone transducer en laser Fluence de energiemeter met een oscilloscoop. Noem de gemiddelde Fluence als F LO trial. </li><li> Bereken de intensiteit van de PA signaal de piek-tot-piek amplitude als functie van aantal pulsen. Om de laser intensiteitsfluctuaties tegengewicht, normaliseren de amplitude van elke PA signaal de verhouding tussen zijn eigen Fluence F LO proces. Analyseer de trend van de genormaliseerde PA intensiteit als functie van pulsaantal en de stabiliteit te verifiëren tijd. </li><li> In het geval van instabiliteit, herhaalt u de stappen 4.4.1 tot 4.4.3 met een lagere waarde van de F-LO <sup&gt; trial. Bij stabiliteit herhalen met een waarde van F LO proef hoger met ~ 10%, tot een verlies aan stabiliteit ontstaat. Stel de sonde Fluence F LO als de tweede hoogste waarde van F-LO proef die stabiliteit garandeert. </li></ol></li><li> Meet een omvorming drempel Fluence: <ol><li> Kies ander willekeurig punt van het monster en de sonde een gemiddelde PA-intensiteit (I LO a) meer dan 500 pulsen op F LO. </li><li> Stel een nominale Fluence groter dan F LO en leveren 50 pulsen. Noem hun gemiddelde Fluence als F exc. </li><li> Sonde een gemiddelde PA-intensiteit (I LO b) meer dan 500 pulsen bij F LO weer. Bereken de verhouding R = I LO b / I LO a. Een waarde van R beneden eenheid geeft bewijs van een onomkeerbare verandering van de optische eigenschappen van het monster. </li><li> Gebruik de micrometrische XY podium om de film te gaan en verander de point van het monster willekeurig. Herhaal stappen 4.5.1 tot 4.5.4 met verschillende waarden van F exc teneinde enkele waarden onder nemen van R, rond en boven eenheid. 15 punten zijn redelijk. </li><li> Plot R als functie van F exc en identificeren van de herstructurering drempel fluentie F th als die waarde wanneer R begint te verschillen van buiten statistische onzekerheid. 6 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+as+new+nanochromophores+for+photothermal+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies.</a> J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).</li>
<li>Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+golden+age%3A+gold+nanoparticles+for+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The golden age: gold nanoparticles for biomedicine.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 2740-2779 (2012).</li>
<li>Hahn, M. A., Singh, A. K., Sharma, P., Brown, S. C., Moudgil, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+Contrast+Agents+for+in-Vivo+Bioimaging%3A+Current+Status+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as Contrast Agents for in-Vivo Bioimaging: Current Status and Future Perspectives.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 3-27 (2011).</li>
<li>Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+gold+nanoparticles+in+targeted+cancer+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery.</a> Ther. Deliv. 3 (4), 457-478 (2012).</li>
<li>Manohar, S., Ungureanu, C., Van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+as+molecular+contrast+agents+in+photoacoustic+imaging%3A+The+promises+and+the+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods as molecular contrast agents in photoacoustic imaging: The promises and the caveats.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 6 (5), 389-400 (2011).</li>
<li>Cavigli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+Affects+the+Stability+of+the+Photoacoustic+Conversion+of+Gold+Nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Size Affects the Stability of the Photoacoustic Conversion of Gold Nanorods.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (29), 16140-16146 (2014).</li>
<li>Chen, L. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+photoacoustic+stability+of+gold+nanorods+by+silica+matrix+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Enhanced photoacoustic stability of gold nanorods by silica matrix confinement.</a> J. Biomed. Opt. 15 (1), 016010(2010).</li>
<li>Ratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CW+laser-induced+photothermal+conversion+and+shape+transformation+of+gold+nanodogbones+in+hydrated+chitosan+films%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">CW laser-induced photothermal conversion and shape transformation of gold nanodogbones in hydrated chitosan films.</a> J. Nanopart. Res. 13, 4337-4348 (2011).</li>
<li>Mercatelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+readout+of+optically+encoded+gold+nanorods+using+an+ordinary+dark-field+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Quantitative readout of optically encoded gold nanorods using an ordinary dark-field microscope.</a> Nanoscale. 5 (20), 9645-9650 (2013).</li>
<li>Von Maltzahn, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computationally+guided+photothermal+tumor+therapy+using+long-circulating+gold+nanorod+antennas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas.</a> Cancer Res. 69 (9), 3892-3900 (2009).</li>
<li>Jokerst, J. V., Cole, A. J., Van De Sompel, D., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+for+ovarian+cancer+detection+with+photoacoustic+imaging+and+resection+guidance+via+Raman+imaging+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods for ovarian cancer detection with photoacoustic imaging and resection guidance via Raman imaging in living mice.</a> ACS Nano. 6 (11), 10366-10377 (2012).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reexamination+of+active+and+passive+tumor+targeting+by+using+rod-shaped+gold+nanocrystals+and+covalently+conjugated+peptide+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">A reexamination of active and passive tumor targeting by using rod-shaped gold nanocrystals and covalently conjugated peptide ligands.</a> ACS Nano. 4 (10), 5887-5896 (2010).</li>
<li>Alkilany, A. M., Thompson, L. B., Boulos, S. P., Sisco, P. N., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods%3A+Their+potential+for+photothermal+therapeutics+and+drug+delivery%2C+tempered+by+the+complexity+of+their+biological+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods: Their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 190-199 (2012).</li>
<li>Centi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+antibody-conjugated+gold+nanorods+for+systemic+injections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of antibody-conjugated gold nanorods for systemic injections.</a> J. Nanobiotechnology. 12, 55(2014).</li>
<li>Jain, P. K., Eustis, S., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+coupling+in+nanorod+assemblies%3A+Optical+absorption%2C+discrete+dipole+approximation+simulation%2C+and+exciton-coupling+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Plasmon coupling in nanorod assemblies: Optical absorption, discrete dipole approximation simulation, and exciton-coupling model.</a> J. Phys. Chem. B. 110 (37), 18243-18253 (2006).</li>
<li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+coupling+of+gold+nanorods+at+short+distances+and+in+different+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries.</a> Nano Lett. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li>
<li>Mazzoni, M., Ratto, F., Fortunato, C., Centi, S., Tatini, F., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+Decoupling+in+Aggregates+of+Silanized+Gold+Nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Partial Decoupling in Aggregates of Silanized Gold Nanorods.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (34), 20018-20025 (2014).</li>
<li>Lapotko, D. O., Lukianova, E., Oraevsky, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+laser+nano-thermolysis+of+human+leukemia+cells+with+microbubbles+generated+around+clusters+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">Selective laser nano-thermolysis of human leukemia cells with microbubbles generated around clusters of gold nanoparticles.</a> Lasers Surg. Med. 38 (6), 631-642 (2006).</li>
<li>Choi, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+trojan+horse+for+delivery+of+therapeutic+nanoparticles+into+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">A cellular trojan horse for delivery of therapeutic nanoparticles into tumors.</a> Nano Letters. 7 (12), 3759-3765 (2007).</li>
<li>Dreaden, E. C., Mwakwari, S. C., La Austin,, Kieffer, M. J., Oyelere, A. K., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-gold+nanorod+conjugates+selectively+target+and+induce+macrophage+cytotoxicity+towards+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Small molecule-gold nanorod conjugates selectively target and induce macrophage cytotoxicity towards breast cancer cells.</a> Small. 8 (18), 2819-2822 (2012).</li>
<li>Yang, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+phase-contrast+imaging+of+photothermal+treatment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+an+in+vitro+study+of+macrophages+as+a+vector+for+the+delivery+of+gold+nanoshells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Real-time phase-contrast imaging of photothermal treatment of head and neck squamous cell carcinoma: an in vitro study of macrophages as a vector for the delivery of gold nanoshells.</a> J. Biomed. Opt. 17 (12), 128003(2012).</li>
<li>Vigderman, L., Manna, P., Zubarev, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Replacement+of+Cetyl+Trimethylammonium+Bromide+by+Cationic+Thiol+Ligands+on+the+Surface+of+Gold+Nanorods+and+Their+Extremely+Large+Uptake+by+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+%28English%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative Replacement of Cetyl Trimethylammonium Bromide by Cationic Thiol Ligands on the Surface of Gold Nanorods and Their Extremely Large Uptake by Cancer Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. (English). 51 (3), 636-641 (2012).</li>
<li>Richard, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+A+reevaluation+of+the+mechanism+of+cellular+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: A reevaluation of the mechanism of cellular uptake.</a> J. Biol. Chem. 278 (1), 585-590 (2003).</li>
<li>Delehanty, J. B., Boeneman, K., Bradburne, C. E., Robertson, K., Bongard, J. E., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+for+specific+intracellular+delivery+and+targeting+of+nanoparticles%3A+implications+for+developing+nanoparticle-mediated+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Peptides for specific intracellular delivery and targeting of nanoparticles: implications for developing nanoparticle-mediated drug delivery.</a> Ther. Deliv. 1, 411-433 (2010).</li>
<li>Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+growth+mechanism+of+gold+nanorods+%28NRs%29+using+seed-mediated+growth+method%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Preparation and growth mechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method.</a> Chem. Mater. 15 (10), 1957-1962 (2003).</li>
<li>Ratto, F., Matteini, P., Rossi, F., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+shape+control+in+the+overgrowth+of+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">Size and shape control in the overgrowth of gold nanorods.</a> J. Nanopart. Res. 12 (6), 2029-2036 (2009).</li>
<li>Niidome, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-modified+gold+nanorods+with+a+stealth+character+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">PEG-modified gold nanorods with a stealth character for in vivo applications.</a> J. Control. Release. 114 (3), 343-347 (2006).</li>
<li>Tatini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+dependent+biological+profiles+of+PEGylated+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Size dependent biological profiles of PEGylated gold nanorods.</a> J. Mater. Chem. B. 2, 6072-6080 (2014).</li>
<li>Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., Centi, S., Dei, L., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+films+doped+with+gold+nanorods+as+laser-activatable+hybrid+bioadhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Chitosan films doped with gold nanorods as laser-activatable hybrid bioadhesives.</a> Adv. Mater. 22 (38), 4313-4316 (2010).</li>
<li>Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., de Angelis, M., Cavigli, L., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+nanocomposite+films+for+laser-activated+tissue+bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Hybrid nanocomposite films for laser-activated tissue bonding.</a> J. Biophotonics. 5 (11-12), 868-877 (2012).</li>
<li>Matteini, P., Tatini, F., Cavigli, L., Ottaviano, S., Ghini, G., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+as+a+photothermal+switch+for+controlled+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Graphene as a photothermal switch for controlled drug release.</a> Nanoscale. 6, 7947-7953 (2014).</li>
<li>Ratto, F., Witort, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmonic+Particles+that+Hit+Hypoxic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Plasmonic Particles that Hit Hypoxic Cells.</a> Adv. Funct. Mater. 25 (2), 316-323 (2015).</li>
<li>Chithrani, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+uptake%2C+transport%2C+and+processing+of+gold+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Molec.+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures.</a> Molec. Membrane Biol. 27 (7), 299-311 (2010).</li>
<li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells%2C+relieves+immunosuppression%2C+and+improves+chemotherapeutic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73 (3), 1128-1141 (2013).</li>
<li>Mantovani, A., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+anticancer+therapies+with+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages.</a> J. Exp. Med. 212 (4), 435-445 (2015).</li>
<li>Panni, R. Z., Linehan, D. C., DeNardo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+to+combat+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-infiltrating macrophages to combat cancer.</a> Immunotherapy. 5 (10), 1075-1087 (2013).</li>
<li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+fate+of+PEGylated+gold+nanoparticles+is+dependent+on+both+cell-penetration+peptides+and+particle+size%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and fate of PEGylated gold nanoparticles is dependent on both cell-penetration peptides and particle size.</a> ACS Nano. 5 (8), 6434-6448 (2011).</li>
<li>Yuan, H., Fales, A. M., Vo-Dinh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+peptide-functionalized+gold+nanostars%3A+Enhanced+intracellular+delivery+and+efficient+NIR+photothermal+therapy+using+ultralow+irradiance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">TAT peptide-functionalized gold nanostars: Enhanced intracellular delivery and efficient NIR photothermal therapy using ultralow irradiance.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (28), 11358-11361 (2012).</li>
<li>Ladest, S., Fales, A. M., Domard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-membrane+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-membrane hydrogels.</a> Nature. 452, 76-79 (2008).</li>
<li>Matteini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermally+activated+hybrid+films+for+quantitative+confined+release+of+chemical+species%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+%28English%29%22%5BJournal%5D)">Photothermally activated hybrid films for quantitative confined release of chemical species.</a> Angew. Chem. Int. Ed. (English). 52, 5956-5960 (2013).</li>
<li>Khor, E., Lim, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantable+applications+of+chitin+and+chitosan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Implantable applications of chitin and chitosan.</a> Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).</li>
<li>Kennedy, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+enhance+gold+nanoparticle+delivery+to+tumors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res.+Lett%22%5BJournal%5D)">T cells enhance gold nanoparticle delivery to tumors in vivo.</a> Nanoscale Res. Lett. 6 (1), 283(2011).</li>
<li>Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+destruction+of+murine+macrophage+cells+with+bioconjugated+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods.</a> J. Nanopart. Res. 9 (6), 1109-1124 (2007).</li>
<li>Jokerst, J. V., Thangaraj, M., Kempen, P. J., Sinclair, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+imaging+of+mesenchymal+stem+cells+in+living+mice+via+silica-coated+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic imaging of mesenchymal stem cells in living mice via silica-coated gold nanorods.</a> ACS Nano. 6 (7), 5920-5930 (2012).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+coated+with+multilayer+polyelectrolyte+as+contrast+agents+for+multimodal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods coated with multilayer polyelectrolyte as contrast agents for multimodal imaging.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (34), 12552-12557 (2007).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+laser+assisted+microvascular+repair+and+end-to-end+anastomosis+by+means+of+indocyanine+green-infused+chitosan+patches%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo laser assisted microvascular repair and end-to-end anastomosis by means of indocyanine green-infused chitosan patches: A pilot study.</a> Lasers Surg. Med. 45 (5), 318-325 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Het idee om tumor-geassocieerde macrofagen doel is in opkomst als een krachtig concept kanker 34, 35, 36 bestrijden. Hier, in plaats van de vernietiging, deze cellen worden gerekruteerd cellulaire voertuigen goud nanorods in een tumor te brengen, door de exploitatie van hun tropisme. Dit perspectief vergt een doordachte ontwerp van de deeltjes, hun integratie in de cellen en hun karakterisering. We hebben gevonden dat de fotostabiliteit van murine macrofagen geladen...

In de afgelopen tien jaar hebben verschillende plasmonische deeltjes zoals goud nanorods, nanoshells en nanocages, veel aandacht gekregen voor toepassingen in de biomedische optica 1, 2, 3, 4. In strijd met de standaard goud nanobolletjes, deze nieuwere deeltjes resoneren in het venster nabij-infrarood (NIR), die voorziet in de diepste optische penetratie door het lichaam en de hoogste optische contrast dan endogene componenten 1. Deze functie is interessant voor innovatieve toepassingen, zoals de fotoakoestische (PA) beeldvorming en fotothermische ablatie van kanker gewekt. Echter, een aantal zaken te beperken de klinische penetratie van deze deeltjes. Bijvoorbeeld hun optische activatie beperkt echter hun oververhitting veroorzaken en hun functionele vormen naar meer sferische profielen, die een fotoinstabiliteit 5, 6, 7 aandrijft wijzigen, 8 </sup&gt;, 9. Een ander probleem dat het wetenschappelijke debat domineert is hun systemische toediening in tumoren. In het bijzonder goud nanorods combineren formaten die ideaal zijn om tumoren die verbeterde doorlaatbaarheid en retentie en het gemak van conjugatie met specifieke probes van kwaadaardige markers weer doordringen zijn. Daarom wordt de voorbereiding van een directe injectie in de bloedstroom gezien als een mogelijke regeling 10, 11, 12, 13. Echter, deze route blijft problematisch, waarbij de meeste deeltjes raken gevangen door het mononucleaire fagocytsysteem 10, 11, 12. Bovendien, andere zorg is de optische en biochemische stabiliteit van de deeltjes na circulatie door het lichaam 14. Wanneer deeltjes verliezen hun colloïdale stabiliteit en aggregaat, kunnen hun plasmonische eigenschappen en warmteoverdracht dynamiek last van plasmonische koppeling 15, </sup&gt; 16, 17 en 18 dwars-oververhitting. Meer recent, de notie van het tropisme van tumor-geassocieerde macrofagen exploit heeft ontpopt als een slim alternatief 19, 20, 21. Deze cellen bezit zijn van een aangeboren vermogen om te detecteren en te doordringen tumoren met hoge specificiteit. Daarom kan men perspectief om deze cellen te isoleren uit een patiënt, laad ze met goud nanorods in vitro en injecteer die terug in de patiënt, met de bedoeling om ze te gebruiken als mobiele voertuigen belast met de levering. Een ander voordeel zou zijn om meer controle over de optische en biochemische stabiliteit van de deeltjes te verkrijgen, omdat hun biologische-interface worden geconstrueerd in vitro. Still, de prestaties van deze cellulaire voertuigen optische contrastmiddelen hebben een kritische analyse. In dit werk beschrijven we de voorbereiding en de kritieke problemen van cellular voertuigen die goud nanorods voor de PA beeldvorming van kanker. GePEGyleerde goud nanorods worden gemodificeerd met quaternaire ammoniumverbindingen 22, om een kationisch profiel dat naar verwachting hun interacties met plasma membranen 23, 24 te bevor- deren. Deze deeltjes ondergaan efficiënt en niet-specifieke opname van de meeste cellulaire soorten, hopelijk zonder zich te bemoeien veel met hun biologische functies. Murine macrofagen worden geladen met tot wel 200, 000 kationische goud nanorods per cel, die opgesloten raken binnen strakke endocytische blaasjes. Deze configuratie moet bezorgdheid ontstaan ​​vanwege de dreiging van plasmonische koppeling en cross-oververhitting in deze blaasjes. Daarom worden de macrofagen ingebed in biopolymere hydrogels die biologische weefsels na te bootsen, om te controleren dat de meeste stabiliteit van PA omzetting van de deeltjes wordt vastgehouden in de overgang van het groeimedium de endocytische blaasjes. effective meetcriteria zijn uitgewerkt om de stabiliteit van PA omzetting onder omstandigheden van onmiddellijk belang voor beeldvorming PA meten. Een nieuwe vorm drempel ligt helemaal aan het begin van de optische instabiliteit na een trein van 50 laserpulsen met de typische herhalingssnelheid van 10 Hz. We zijn ervan overtuigd dat deze resultaten momentum kunnen dienen voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën om plasmonische deeltjes te leveren aan tumoren.

<table><tbody><tr><td>Hexadecyltrimethylammonium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>Om goudnanostaven te synthetiseren</td></tr><tr><td>Gold(III) chloride trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td>Om goudnanostaven te synthetiseren</td></tr><tr><td>Silver nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td>Om goudnanostaven te synthetiseren</td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Om goudnanostaven te synthetiseren</td></tr><tr><td>Natriumborohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Om goudnanozaadjes te synthetiseren</td></tr><tr><td>MeO-PEG-SH</td><td>Iris Biotech</td><td>PEG1171</td><td>Om goudnanostaven te PEGyleren. Molecuulgewicht ongeveer 5.000 Da.</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Om goudnanostaven te PEGyleren en chitosan op te lossen</td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>Om goudnanostaven te PEGyleren</td></tr><tr><td>(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>733305</td><td>Om goudnanostaven te modificeren met quaternaire ammoniumverbindingen</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>Om (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide op te lossen</td></tr><tr><td>Polysorbaat 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Om PEGylerde goudnanostaven te centrifugeren</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Om goudnanostaven op te suspenderen voor incubatie met cellen en om cellenpellets te behandelen</td></tr><tr><td>J774a.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Monocyte/macrofagen muiscellijn</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-707F</td><td>Celcultuurmedium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>Te worden toegevoegd aan celcultuurmedium</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Te worden toegevoegd aan celcultuurmedium</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>Te worden toegevoegd aan celcultuurmedium</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>NEST</td><td>705001</td><td>Celcultuurschaal</td></tr><tr><td>Celschraper</td><td>EuroClone</td><td>ES7018</td><td>Om cellen los te maken</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fluka</td><td>47630</td><td>Om cellen te fixeren</td></tr><tr><td>Chitosan, laag moleculair gewicht</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>75-85% deacetyleerd. Molecuulgewicht ongeveer 120.000 Da.</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>Om chitosan onoplosbaar te maken en het hydrogel te genereren</td></tr><tr><td>Polystyreen celcultuurplaten</td><td>NEST</td><td>702011</td><td>Gebruikt als mallen voor het fabriceren van chitosan hydrogels</td></tr><tr><td>Optische parametrische oscillator aangedreven door de derde harmonische van een Q-switched Nd:YAG laser</td><td>Continuum, Santa Clara, VS</td><td>Surelite OPO plus</td><td>Bron van optische excitatie voor fotoakoestische tests</td></tr><tr><td>Pyro-elektrische detector&nbsp;</td><td>Gentec, Quebec, Canada</td><td>QE8SP</td><td>Om de optische flux voor fotoakoestische tests te bewaken</td></tr><tr><td>Voorafversterkte naaldhydrofoon</td><td>Precision Acoustic, Dorset, VK</td><td>Model met 1 mm sensordiameter en 1-20 MHz frequentiebereik</td><td>Om fotoakoestische signalen te meten</td></tr></tbody></table>

voorbereiding en fotoakoestisch analyse van cellular voertuigen die goud nanorods

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Goud nanorods zijn aantrekkelijk voor verschillende biomedische toepassingen, zoals de fotothermische verdamping en de fotoakoestische beeldvorming van kanker, dankzij hun intense optische absorptie in het nabije infrarood raam lage cytotoxiciteit en potentieel huis in tumoren. Echter, hun levering aan tumoren blijft een probleem. Een innovatieve aanpak bestaat uit de exploitatie van het tropisme van tumor-geassocieerde macrofagen die met goud nanorods in vitro kunnen worden geladen. Hier beschrijven we de voorbereiding en de fotoakoestische inspectie van cellulaire voertuigen met goud nanorods. GePEGyleerde goud nanorods worden gemodificeerd met quaternaire ammoniumverbindingen, om een ​​kationisch profiel te bereiken. Bij contact met de muizen-macrofagen in gewone petrischaaltjes, worden deze deeltjes gevonden om massale opname ondergaan in endocytische blaasjes. Vervolgens worden deze cellen zijn ingebed in biopolymere hydrogels, die worden gebruikt om te controleren of de stabiliteit van fotoakoestische conversievan de deeltjes wordt vastgehouden in hun cellulaire opname in voertuigen. We zijn ervan overtuigd dat deze resultaten nieuwe inspiratie voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën om plasmonische deeltjes te leveren aan tumoren kan bepalen.

Hier is de haalbaarheid van cellulaire voertuigen die goud nanorods de PA beeldvorming van kanker getoond samen met typische resultaten van het protocol. De TEM beelden in figuur 1 tonen de gebruikelijke weergave van de deeltjes na stap 1 en hun cellulaire voertuigen na stap 2. De bereiding van de deeltjes en de cellen voor TEM beeldvorming elders 17 beschreven. Kationische goud nanorods ondergaan e...

We tonen de voorbereiding en bespreken de haalbaarheid van cellulaire voertuigen die gouden nanostaven bevatten voor de foto-akoestische beeldvorming van kanker.

Voorbereiding en Fotoakoestisch Analyse van Cellular Voertuigen die goud nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Het algemene doel van dit protocol is het gebruik van cellulaire dragers die goudnanostaven bevatten als een innovatieve strategie om plasmonische deeltjes in tumoren af te leveren. Ons protocol kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de ontwikkeling van foto-akoestische en fotothermische benaderingen om kanker te beelden en te behandelen met behulp van exogene contrastmiddelen. Deze methode is gebaseerd op het tropisme van tumor-geassocieerde macrofagen om plasmonische deeltjes naar tumoren te transporteren.Het idee is om deze cellen van een patiënt te isoleren, ze in vitro te laden met plasmonische deeltjes en ze vervolgens terug te injecteren in de gastheer met de bedoeling ze als oestrogeenhouders te gebruiken. Een van de voordelen van deze aanpak is de mogelijkheid om meer controle te krijgen over de optische en biochemische stabiliteit van de deeltjes, omdat hun biologische interface volledig in vitro wordt geconstrueerd. Begin met het zuiveren van zes milliliter met cetrimonium beklede goud-nanostaven bij een goudconcentratie van 450 micromolar, middels twee centrifugaties, gevolgd door het afgieten en wassen in 500 micromolar waterig cetrimoniumbromide.Voeg vervolgens 1,5 milliliters 100 millimolar acetaatbuffer met cetrimoniumbromide en polysorbaat 20 toe aan het vat met het pellet van gouddeeltjes. Voeg daarna 7,5 microliters 10 millimolar alpha-Methoxy-omega-mercapto polyethyleenglycol in water toe en laat dit 30 minuten reageren bij 37 degrees Celsius. Voeg vervolgens 7,5 microliters 100 millimolar mercaptoundecyl trimethylammoniumbromide in dimethylsulfoxide toe.Laat de reactie vervolgens 24 uur rusten bij 37 °C. Voeg na 24 uur 4,5 milliliters 0,005% polysorbate 20 in water toe. Zuiver nu de deeltjes met behulp van deze milde polysorbate 20-oplossing via vier cycli van centrifugatie en decantatie.Overbreng tenslotte de partikels naar 600 µL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing. De nominale concentratie goud moet nu 4,5 mM zijn. Om de cellen voor te bereiden, plaatst u in twee schalen van 60 mm een halve miljoen monocyt-macrofagische cellen in aangevuld Dulbecco's Modified Eagle Medium en laat u deze 24 uur groeien.Vervang na 24 uur het celmedium door vers medium, aangevuld met de bereide kationische goud-nanostaven voor een uiteindelijke concentratie van 100 micromol goud en oplossing in elke Petrischaal. Zet de incubatie vervolgens nog 24 uur voort. Controleer de volgende dag de cellen onder een microscoop.Ze moeten een normale morfologie vertonen en veel donkere intracellulaire blaasjes bevatten. Als de cellen er goed uitzien, was ze dan met vers medium, detach ze met een scraper en voeg de cellen van twee kweekschalen samen om ten minste twee miljoen cellen in één collectie te hebben. Centrifugeer de collecties vervolgens bij 120 Gs gedurende 6 minuten om eventuele overtollige kationische goud-nanostaven te verwijderen.Gooi de supernatanten weg. De celpellets moeten er bijna zwart uitzien. Suspendeer de pellets in twee milliliters fosfaatgebufferde zoutoplossing en tel de cellen met behulp van een Neubauer-kamer.Meng vervolgens suspensies die twee miljoen cellen bevatten en centrifugeer deze bij 120 Gs gedurende zes minuten. Resuspendeer de pellets in twee milliliters 3,6% formaldehyde en fosfaatgebufferde zoutoplossing, en laat de cellen 10 minuten fixeren bij kamertemperatuur. Verwijder ten slotte het fixatiemiddel met drie wasbeurten met fosfaatgebufferde zoutoplossing.Bereid één dag vóór de start van deze procedure 500 µL van een aangezuurde 3% w/v chitosanoplossing met een laag molecuulgewicht. Breng de pH naar 4,5 door toevoeging van azijnzuur. Laat de oplossing 24 uur lang homogeniseren bij 40 °C om deze grondig te mengen.Meng de volgende dag de met goudnanostaven geprepareerde murine macrofagen met alle 500 µL van de chitosanoplossing. Om phantoms met een dikte van 50 µm te verkrijgen, brengt u 250 mg van het mengsel aan in polystyreenvormen van 1,9 cm².Behandel de monsters de volgende dag met 500 microliters 1 molar waterige natriumhydroxide om cross-linking te induceren en spoel ze vervolgens met 10 milliliters ultrapuur water. Analyseer de stabiliteit van de fotoakoestische conversie met behulp van een aangepaste fotoakoestische microscoop, die is uitgerust met een optische parametrische oscillator, een attenuator om de optische fluentie af te stellen en een ultrasone transducer. Begin met het suspenderen van de chitosanfilm met de macrofagen in gedeïoniseerd water met behulp van een plastic houder die is ondergedompeld in een watertank.Bepaal een probe-fluentie die het monster niet beschadigt en die een fotoakoestische emissie met een voldoende signaal-ruisverhouding overdraagt. Stel een proeffluentie en acquisitieparameters in. Verzamel voor elke puls van de laser het corresponderende fotoakoestische signaal van de ultrasone transducer.Bereken de verhouding tussen de fotoakoestische intensiteit en de laserfluentie voor elke puls. Analyseer de trend als functie van het pulsnummer en verifieer de stabiliteit over de tijd. In het geval van instabiliteit dient deze meting te worden herhaald met een lagere testfluentie.In het geval van stabiliteit kan de proef-fluentie worden gebruikt als probe-fluentie, mits de foto-akoestische emissie hiervan een geschikte signaal-ruisverhouding vertoont. Meet vervolgens een reshaping-drempelfluentie. Kies een willekeurig punt op het monster, stel de laser in op de probe-fluentie en meet een gemiddelde foto-akoestische intensiteit, A, over 500 pulsen.Verhoog vervolgens de nominale fluentie boven de probe-fluentie en lever 50 pulsen. Noem hun gemiddelde fluentie F excitatie. Reset de laser naar de probe-fluentie en herhaal de meting, waarbij de gemiddelde foto-akoestische intensiteit, B, over 500 pulsen wordt bepaald.Bereken nu de ratio R van B ten opzichte van A. Een R-waarde kleiner dan één geeft aan dat er een onomkeerbare verandering is opgetreden in de optische eigenschappen van het monster. Gebruik vervolgens de micrometrische tafel om de film te verschuiven en het meetpunt van het monster willekeurig te wijzigen. Herhaal daarna de meting van R voor verschillende waarden van de F-excitatie, zodat er enkele waarden van R rond en onder één worden verkregen.Ongeveer 15 R-punten vormen een redelijke verzameling gegevens. Zet vervolgens R uit tegen de F-excitatie en identificeer de drempelwaarde voor hervorming als de fluorescentie waarbij R zonder onzekerheid afwijkt van één. Doorgaans ondergaan kationische goudnanostaven een massale accumulatie in macrofagen, die hun normale morfologie behouden.Er is vastgesteld dat de partikels zijn ingesloten in nauwe endocytische blaasjes. Later in het proces lijkt de inbedding in de chitosan-hydrogel geen invloed te hebben op de cellulaire morfologie. Zoals te zien is op een micrografie, zijn de cellen goed verspreid over het monster.Controles van chitosanfilms met goud-nanostaven zonder cellen zijn homogeen. Plasmonische banden van goud-nanostaven blijven behouden in hun cellulaire dragers. Effecten zoals plasmonische koppeling of een verschillende opname van deeltjes met verschillende grootte en vorm speelden geen substantiële rol in deze protocollen.Na het verzamelen van de gegevens geeft de trend van R als functie van de F-excitatie een beeld van de data en de analyse die nodig is om de F-drempel te bepalen. Hier werd de F-drempel vastgesteld op ongeveer 11 millijoules per vierkante centimeter. De fotoakoestische metingen waren zeer nauwkeurig, met een signaal-ruisverhouding groter dan 20 over 500 pulsen.Ons protocol is innovatief ten opzichte van bestaande methoden wat betreft het ontwerp van de deeltjes en het onderzoek naar hun fotostabiliteit. De modificatie van gepegyleerde gouden nanostaven met quaternary ammoniumcations zorgt voor een hoge efficiëntie van de cellulaire opname terwijl de colloïdale stabiliteit behouden blijft. De meting van de stabiliteit van de fotoakoestische conversie door de definitie van de reshaping-drempel is kwantitatief en reproduceerbaar.Aangezien deze deeltjes bedoeld zijn als contrastmiddelen voor fotoakoestische beeldvorming, is een fotoakoestische probe ideaal om hun functionele eigenschappen te testen. Cellulaire dragers van plasmonische deeltjes zijn zichtbaar als contrastmiddelen voor fotoakoestische beeldvorming. Hun fotostabiliteit is gelijk aan die van vrije plasmonische deeltjes.De focus van ons huidige werk ligt op de fysiologie van deze cellen, met speciale aandacht voor hun levensvatbaarheid en chemotactische activiteit.

preparation-photoacoustic-analysis-cellular-vehicles-containing-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We gesynthetiseerd stervormige gouden nanostars met behulp van een zilveren zaad gemedieerde groei methode. De diameter van de nanostars varieert van 200 tot 300 nm en het aantal tips variëren van 7 tot 10. De nanodeeltjes hebben een brede oppervlakte plasmon resonance-modus in het midden van het nabij-infrarood.

Goud Nanostar Synthese met een Silver Zaad gemedieerde groei Methode

In this video, we describe the darkfield microscopy (DFM) technique combined with single-particle tracking (SPT) analysis to monitor the interaction of plasmonic gold nanorods with the cell membrane of a specific cell line of interest. Combined DFM and SPT analysis allows the visualization of the nanorod movement through the cell membrane with high spatiotemporal resolution.

Darkfield Microscopy to Visualize Diffusional Dynamics of Nanorods on Cell Membrane

Wij rapporteren over technieken micropattern nanoporeuze gouden dunne films via stencilafdruk en fotolithografie, alsook werkwijzen cultuur brengen van cellen op microschaal vervaardigde patronen. Verder beschrijven we beeld analysemethoden morfologie van het materiaal en de gekweekte cellen met behulp van scanning elektronenmicroscopie en fluorescentie microscopie technieken karakteriseren.

Microfabricage van Nanoporeuze Gold Patronen voor Cell-materiaal Interaction Studies

Dit protocol beschrijft hoe de tijdelijke verwarming die geassocieerd is met de optische absorptie van gouden nanostaafjes, kan worden gebruikt om differentiatie en intracellulaire calciumactiviteit in neuronale cellen te stimuleren. Deze resultaten openen mogelijk nieuwe toepassingen in neurale prothesen en fundamentele studies in de neurowetenschappen.

Goud nanorod-bijgestaan ​​Optische Stimulatie van neuronale cellen

We beschrijven een eenvoudige werkwijze voor het produceren van zeer stabiele oligomere clusters van goud nanodeeltjes via de reductie chlorogoudzuur (HAuCl 4) met natrium thiocyanaat (NaSCN). De oligoclusters een smalle grootteverdeling en kunnen worden met uiteenlopende afmetingen en oppervlakte lagen.

Een eenvoudige methode voor de grootte gecontroleerde synthese van Stable oligomere Clusters van Gold Nanodeeltjes onder omgevingsomstandigheden

Dit protocol beschrijft een eenvoudige bereidingswijze voor goud nanodeeltjes geïntegreerde foto-responsief liposomen met de commercieel verkrijgbare materialen. Het toont ook aan hoe de microbellen cavitatie proces van de gesynthetiseerde liposomen te meten bij de behandeling van gepulste laser.

Synthese van gouden nanodeeltjes geïntegreerde Photo-responsieve liposomen en waardering van hun Microbel Cavitatie bij Pulse Laser Excitatie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de synthese van goud nanorods, gebaseerd op het gebruik van hydrochinon als reductiemiddel, plus de verschillende mechanismen voor het regelen van de grootte en beeldverhouding.

Hydrochinon Based Synthese van Gold nanorods

Beschrijven we een methode voor de synthese van biocompatibel 10-nm gouden nanodeeltjes, matiemaatschappij door poly-ethyleen-glycol coating op het oppervlak. Deze deeltjes kunnen worden gebruikt in vitro en in vivo voor het leveren van therapeutics nanoschaal cellulaire en extracellulaire ruimten die zijn moeilijk toegankelijk met conventionele nanoparticle maten.

Synthese van matiemaatschappij 10-nm polymeer beklede gouddeeltjes voor endotheel Targeting en Drug Delivery

Enterprise gold nanostaafjes kan worden gevangen in vloeistoffen en gedraaid bij kHz frequenties met behulp van cirkel-gepolariseerde optisch pincet. Invoering van instrumenten voor Brownian dynamics analyse en lichte scatteringspectroscopy leidt tot een krachtig systeem voor onderzoek en toepassing op talrijke gebieden van de wetenschap.

Bouw en de exploitatie van een licht gestuurde gouden nanostaafjes Rotary locomotorisch stelsel

Een betrouwbare en gemakkelijk reproduceerbare methode voor de voorbereiding van functionalizable, nabij-infrarood uitzendende fotoluminescente goudnanoclusters en hun directe detectie in HeLa-cellen door stromingscytometrie en confocale laserscanningmicroscopie wordt beschreven.

Synthese van near-infrared emitting gold nanoclusters voor biologische toepassingen

Hier tonen we het gebruik van traditionele donkerveldmicroscopie om de dynamiek van gouden nanorods (AuNRs) op celmembraan te monitoren. De locatie en oriëntatie van enkele AuNR's worden gedetecteerd met behulp van ImageJ en MATLAB, en de diffusieve toestanden van AuNR's worden gekenmerkt door analyse van het volgen van afzonderlijke deeltjes.

Diffusional Dynamics of Gold Nanorods visualiseren op celmembraan met behulp van Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Leer hoe je tumor-geassocieerde macrofagen laadt met goud nanorods voor fotoakoestische beeldvorming van kanker. Deze methode maakt gerichte aflevering van plasmonische deeltjes naar tumoren mogelijk.

Voorbereiding en Fotoakoestisch Analyse van Cellular Voertuigen die goud nanorods

Meer video's verkennen