Name: Evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus Modellen van kwantitatieve real-time PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer hoe je longmetastase evalueert in muizenborsttumormodellen met kwantitatieve real-time PCR. Deze methode detecteert tumor-specifieke mRNA in longweefsel voor kwantitatieve metastase-analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De Yeh lab wordt ondersteund door de financiering van onderzoek van een American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) toegekend aan de Hollings Cancer Center op MUSC, door de financiering van onderzoek van het Ministerie van Defensie subsidie ​​(W81XWH-11-2- 0229) op MUSC, en door een award van het Concern Foundation (tot ESY).

Het protocol volgt de richtlijnen en verzorging van dieren normen van de Medische Universiteit van Zuid-Carolina (MUSC) en de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Borsttumor dissectie (optioneel afhankelijk van de studie doelen en of de primaire tumor analyse of staartader injectie werd uitgevoerd). <ol><li> Euthanaseren muis met behulp van een dodelijke dosis van isofluraananesthesie volgens IACUC en universitaire regelgeving. Bevestig euthanization door chirurgische dislocatie. </li><li> Op schuim aan boord, pin met dissectie pinnen door het plaatsen van de muis op zijn rug met de ledematen gespreid. </li><li> Spray muis met 70% ethanol. </li><li> Met behulp van een tang, pakt het onderste gedeelte van het dier in het centrum. </li><li> Met behulp van schaar, sneed omhoog in de richting van de hals door de huid, zorg dat u de buikholte van de muis niet te doorboren. </li><li> Bezuinigen huid op de ledematen om tumorweefsel te onthullen. </li><li> Ontleden tumorweefsel en preserve door voorkeursmethode, zoals bevriezing en fixatie, voor verdere analyse (niet verder in dit protocol besproken). </li></ol></li><li> Longweefsel dissectie. <ol><li> Als tumorweefsel werd geoogst zoals hierboven beschreven, vastpinnen overtollige huid. </li><li> Met behulp van een tang, grijpen peritoneum aan ondereinde van het dier gaan knippen opwaarts naar de basis van de hals. </li><li> Knip voorzichtig langs de linker en rechterkant van de ribbenkast en voorzichtig om te voorkomen dat eventuele bloedvaten die kan bloeden in de borstholte verbreken. Verwijder de ribben door het snijden naar links en rechts door het membraan en bovenste gedeelten van de ribbenkast. </li><li> Met behulp van een tang grijpen van de luchtpijp van de muis en trek naar voren. </li><li> Sever de luchtpijp met dissectie schaar en verwijder de longen van de muis. Let op: kan het hart verbonden aan de longen blijven. Als dit gebeurt, zorgvuldig ontleden hart weg van de longen voorzichtig om alle vijf lobben te verzamelen (zie figuur 1 </strong&gt;). </li><li> Was voorzichtig met PBS om overtollig bloed te verwijderen. </li></ol></li><li> Bruto evaluatie van longweefsel. <ol><li> Optie 1: In vivo beeldvorming. <ol><li> Voor luciferase imaging, ~ 10 min voor beeldvorming, geven de dieren een 150 mg / kg dosis van luciferine door intraperitoneale (ip) injectie. Afbeelding longen in vivo verdoofde dieren of bij verwijdering na sectie (figuur 2) 5. </li></ol></li><li> Optie 2: Bruto evaluatie. <ol><li> Onderzoek longen onder stereo microscoop om tumoren te visualiseren. Opmerking: Als cellen GFP label, kan een fluorescentie staat stereomicroscoop met een lichte kubus met de juiste excitatie / emissie maxima (bijvoorbeeld in de buurt van 470/510 nm) om GFP te detecteren worden gebruikt om de longen stereoscopisch onderzoeken voor fluorescentie voorafgaand aan de verwerking. </li></ol></li><li> Als longen zijn om onmiddellijk te worden geanalyseerd, gaat u naar sectie &#39;RNA Isolation&#39;. Anders snap bevriezen weefsel met behulp van vloeibare zeeid stikstof of droogijs. Bewaren bij -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. RNA Isolation Opmerking: Voor de representatieve analyse werd RNA geïsoleerd met behulp van een RNA-isolatie kit (zie Materials List). Terwijl de huidige analyse gebruikt product een bepaalde fabrikant, diverse isolatie kits zijn verkrijgbaar bij verschillende leveranciers betrouwbare. Bovendien, non-kit gebaseerde centrifugeren methoden zijn ook mogelijk. cDNA tevens bereid vanuit een positieve controle RNA-monster, bijvoorbeeld een cellijn of plasmide voor standaard curve analyse. Als alternatief kan een positieve controle specifiek voor de primer probe set worden aangeschaft (zie Materials List). <ol><li> Bij gebruik van eerder ingevroren weefsel, verzamelen bevroren weefsel op droog ijs. </li><li> Homogeniseren weefsel met behulp van een van de volgende methoden zoals: mortier en stamper slijpen uitgevoerd door de hand over droog ijs na het bevriezen van weefsel in vloeibare stikstof; weefselhomogenisator of mechanische dissociatie apparaatper suggestie fabrikant; sonicatie of andere voorkeurswerkwijze. Opmerking: Voor de vertegenwoordiger van de analyse, de voorkeur van homogenisering is sonicatie. <ol><li> Voor de in figuur 3 analyse bereiden lysis buffer (verschaft in RNA isolatie kit) en 2-mercaptoethanol in een verhouding van 20 pl 2-mercaptoethanol voor elke 1 ml lysisbuffer. Resuspendeer weefsel in 300 pi lysisbuffer aangevuld met 2-mercaptoethanol per 30 g weefsel en ultrasone trillingen gedurende 10 sec met sonicator vastgesteld op 30% amplitude. </li><li> Bij gebruik van mortier en stamper, resuspendeer grond weefsel in 300 pi lysisbuffer na het slijpen. </li></ol></li><li> Voeg 10 ul proteinase K tot 590 gl TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Voeg 600 ul proteinase K oplossing voor elke 300 gl (dat wil zeggen voor elk 30 mg) weefsel. Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Opmerking: De spijsvertering kan variëren. </li><li> Centrifugeer monsters bij ≥13000 g gedurende 10 minuten om vuil te verwijderen. </li><li> Breng supernatant nieuwe buizen. </li><li> Voeg 450 pl ethanol (96% -100%) per 900 pl supernatant precipiteren RNA. </li><li> Breng 700 pi van het lysaat / ethanol mengsel aan de kolom. </li><li> Centrifugeer monsters bij ≥13,000 g gedurende 1 min om RNA te binden aan de kolom. </li><li> Gooi vloeibaar afval en voeg de resterende supernatant naar kolom en spin weer. </li><li> Zodra alle lysaat wordt gesponnen door de kolom, voeg 350 ul wasbuffer 1 naar het bovenste gedeelte van de kolom en centrifugeer monsters bij ≥13,000 g gedurende 30 sec. </li><li> Gooi vloeistof uit kolom en vervang bovenste gedeelte. </li><li> Bereid DNase door 5 eenheden DNase I enzym met 5 ui 10X DNase en 40 gl DNase / RNase vrij water per monster (totaal volume van 50 ul / monster). </li><li> Voeg 50 ul DNase mengen om elke kolom en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 350 ui wasbuffer 1 kolom en centrifugeer samselen bij ≥13,000 g gedurende 30 sec. </li><li> Gooi vloeistof uit kolom en vervang bovenste gedeelte. </li><li> Voeg 600 ui wasbuffer 2 aan de kolom en spin 30 sec bij ≥13,000 g. </li><li> Gooi vloeistof uit kolom en vervang bovenste gedeelte. </li><li> Voeg 250 ui wasbuffer 2 en centrifugeer gedurende 2 min bij ≥13,000 g. </li><li> Zet een deel van de kolommen in de nieuwe collectie buis en oude collectie buis weggooien. </li><li> Voeg 50-100 ul van RNase / DNase-vrij water kolom en incubeer gedurende 1 min. </li><li> Spin gedurende 1 min bij ≥13,000 g. </li><li> Re-run verzameld eluaat door de kolom om RNA opbrengst te verhogen. </li><li> Voor onmiddellijk gebruik, houden monsters op ijs en overgaan tot kwantificering. Voor later gebruik, snap bevriezen van droogijs of vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 ° C vriezer totdat het nodig is. </li></ol> 3. First Strand Synthesis Opmerking: de representatieve analyse het reverse transcriptase (RT) reactie uitgevoerd een First Strand cDNA synthese kit ontworpen voor QRT-PCR (zie Materials List). <ol><li> Als monsters die eerder werden verzameld, ontdooien buizen op ijs. </li><li> Meet RNA hoeveelheid met behulp van een spectrofotometer. </li><li> Met behulp van 0,5-2 ug totaal RNA, voeren de eerste streng synthese met behulp van reverse transcriptase om cDNA voorraad genereren. <ol><li> In steriele, RNase / DNase-vrij PCR tubes / platen bereiden het reactiemengsel (tabel 1). Meng voorzichtig en centrifuge. Programmeer een standaard PCR machine (tabel 2). </li></ol></li><li> Verdunnen afgewerkte reactie gewenste volume (meestal 50-100 pi) met steriele nuclease-vrij water. </li></ol> 4. Real-time PCR Opmerking: Voor de representatieve analyse werd SYBR groen gebruikt. Echter kan elke voorkeurswerkwijze worden vervangen naar keuze van de gebruiker. <ol><li> Met behulp van een positieve controle cDNA, het opzetten van een standaard curve voor elke primer set. <ol><li> Voor de analyse getoond in figuur 3, de voorbereiding van de standaard curve voor menselijke HER2 met de fabrikant aanbevolen positieve controle cDNA (zie Materials List). Voor muis GAPDH, met de negatieve controle long cDNA van een standaardcurve. Voor elke probe, serieel verdunnen cDNA 1: 4-5 normen genereren. </li></ol></li><li> Bereken het totale aantal monsters dat moet de standaardkromme en experimentele monsters. Opmerking: Voor de hier beschreven analyse, werden 2-3 experimentele herhalingen per monster geanalyseerd. Standaard curve analyse werd uitgevoerd om een eenvoudige lineaire regressiemodel dat kan worden toegepast om te bepalen de relatieve hoeveelheid HER2 en GAPDH per monster genormaliseerd uiteindelijke hoeveelheid berekenen genereren. Deze analyse zal er ook voor zorgen dat de primer efficiëntie is voldoende voor de analyse bij de hand. </li><li> In een steriele, RNase / DNase-vrij buis bereiden master mix (Tabel 3). <ol><li> Bereken master mix amount per monster. Opschalen voor meer dan één monster. Gebruik een master mix voor elke experimentele gen van belang, evenals een interne controle zoals GAPDH. Gebruik voor GAPDH primers in een uiteindelijke concentratie van 200 nM. Opmerking: De interne controle is vooral handig wanneer het proberen om onderscheid te maken tussen mens en muis cel oorsprong. Opmerking: Primer concentratie HER2 werd bepaald en geoptimaliseerd door de fabrikant. </li></ol></li><li> Bereid testplaat met 1 pl cDNAs overeenkomt met elke standaard of experimentele monster. Goed toe te wijzen ten minste 1 cDNA monster / voor elke primer sonde. Voeg 19 ul van de master mix per putje voor elke primer sonde. Opmerking: de representatieve gegevens in Figuur 3 werden de cDNA monsters in duplo geanalyseerd voor elke primer probe en geplot als gemiddelde van de twee monsters. </li><li> Run reactie in QRT-PCR machine met aanbevolen of eerder geteste PCR-protocol. Zie tabel 4 </strong&gt; aan de PCR protocol voor de representatieve gegevens in Figuur 3 en figuur 4. </li></ol>

<ol><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
</ol>

ESY en MAA zijn niet in dienst van FirstString Research Inc. en hebben geen financieel belang in de onderneming niet in het bezit. FirstString Research Inc., mits de luciferase beeldgegevens die werd gepresenteerd in dit manuscript. GSG is voorzitter en CEO van FirstString Research. CLG is een werknemer van FirstString Research. GSG en CLG hebben aandelenopties uitgegeven door FirstString Research.

Dit protocol beschrijft het gebruik van QRT-PCR om mammaire tumorcelmetastase evalueren aan de longen met een xenograft muismodel. Er wordt erkend dat andere technieken, zoals bioluminescentie beeldvorming, zijn beschikbaar en zijn ook effectief voor het detecteren van metastasen ondanks hun eigen waarden en beperkingen. De gepresenteerde gegevens suggereren dat QRT-PCR een effectieve maatregel detecteren tumor afgeleide mRNA in longweefsel voor kwantificering van totaal metastase. Voorgesteld wordt QRT-PCR analyse een ...

QRT-PCR analyse is voorgesteld als een werkwijze voor het beoordelen van tumormetastase. Deze werkwijze is voorgesteld als een alternatief voor gebruikers die geïnteresseerd zijn in de beoordeling metastase zijn slechts toegankelijk voor bepaalde apparatuur niet zoals in vivo beeldvormende apparatuur of fluorescentie staat stereoscoop. Een bespreking van de meest gebruikte methoden gepresenteerd, gevolgd door een demonstratie van hoe QRT-PCR-analyse kan worden gebruikt als een afzonderlijke of als gezelschap methode om metastase te beoordelen. Deze procedure heeft het potentieel om een ​​kwantitatieve analyse van metastatische belasting verschaffen. Standaardmethoden van de bruto-analyse, met inbegrip van visualisatie van de longen onder een stereomicroscoop evenals seriële snijden, gevolgd door hematoxyline en eosine (H &amp; E) kleuring van longweefsel, kwantificeerbaar zijn maar sterk afhankelijk van door de gebruiker gedefinieerde parameters voor het tellen van 2-5. Bij de evaluatie van hele longen met behulp van een stereomicroscoop, alleen grote oppervlakte uitzaaiingen zijn visible en analyse vereist de onderzoeker om een ​​redelijke kennis van de long anatomische structuur te bepalen wat een metastatische laesie te hebben. Fluorescentielabelling van tumorcellen met een merker zoals GFP en het gebruik van een stereomicroscoop met een lichte kubus met de geschikte excitatie- / emissie maxima (bijv nabij 470/510 nm voor GFP) bevat helpt bij dit proces, maar alleen aan de oppervlakte tumornoduli detecteerbaar . Bovendien fluorescentie van bloed verontreinigingen, die zichtbaar worden onder dezelfde parameters als GFP is, kan leiden tot vals identificeren van mogelijke metastatische laesies. Snijden van de long, gevolgd door H &amp; E kleuring long metastase visualiseren is een nuttige methode om micrometastasen en andere microscopische processen zoals immune infiltratie te evalueren, maar het gebruik van de gehele long weefsel voor inbedden in paraffine, snijden en kleuringen vereist vaak. Daarom stroomafwaartse procedures niet ideaal na deze method. Hoewel kwantificeerbaar, vereist deze procedure de onderzoeker een groot aantal gekleurde longsecties per dier evalueren om te garanderen dat de analyse rekening voor de gehele 3D-structuur van de longen. Bijgevolg is dit type onderzoek is tijdrovend, kan leiden tot het tellen fout, en analyse leunt zwaar op de onderzoeker discretie. Verscheidene in vivo beeldvormende technieken (bijvoorbeeld MRI, PET, SPECT) worden momenteel gebruikt uitvoeren of testen biologische processen in experimentele diermodellen 8. Bioluminescentie beeldvorming is een gemeenschappelijke methode om een bruto weergave van metastase 9 verwerven. Deze techniek wordt algemeen op de aanwezigheid van luciferase-reporter-activiteit te evalueren als gevolg van de accumulatie van tumorcellen die zijn ontworpen om een ​​luciferase responselement bevatten, die in bepaalde organen zoals de melkklier na tumorcel implantatie en de longen op spontane metastase verblijven 10. Visualisatie van luciferase-activiteit wordt geïnduceerd door de aanwezigheid van luciferine substraat (D-luciferine). Luciferase katalyseert de oxidatieve decarboxylering van D-luciferine tot oxyluciferine genereren bioluminescentie. Terwijl informatief, is deze werkwijze beperkt door verscheidene factoren, waaronder substraat stabiliteit (bijv korte halfwaardetijd), adequate verdeling van substraat hangt af van hoe het wordt geleverd aan proefdieren en lage detectiegevoeligheid 9. Een belangrijke verdienste van deze techniek is dat het niet-invasief kan worden uitgevoerd op levende dieren, en kan leiden tot de detectie van tumorcellen metastasen in meerdere organen die niet zijn normaliter geoogst dissectie 9,10. Een positief aspect van in vivo imaging technieken is dat het longweefsel wordt ongestoorde waardoor secundaire procedures zoals paraffine inbedding of zoals hier gepresenteerd, QRT-PCR-analyse. Omdat QRT-PCR theoretically een gevoeligere maat voor detectie bruto evaluatie niet gering aantal tumorcellen in de long zichtbaar. Hoewel nuttig, kan de beeldvormende technieken hierboven beschreven gesubstitueerd of aangevuld met QRT-PCR methode die momenteel beschreven. QRT-PCR heeft het potentieel om een ​​gevoelige maatstaf van tumor afgeleide mRNA binnen een long.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25636&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>100-25716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh Primer Sequence</td><td></td><td></td><td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus modellen van kwantitatieve real-time pcr

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatische ziekte is de verspreiding van kwaadaardige tumorcellen uit de primaire kankertype naar een verre orgaan en is de primaire oorzaak van kanker-geassocieerde overlijden 1. Voorkomende plaatsen van metastatische verspreiding omvatten longen, lymfeklieren, hersenen en bot 2. Mechanismen die metastase rijden zijn intense gebied van kankeronderzoek. Bijgevolg effectieve assays voor uitgezaaide last te meten in verre plaatsen van metastase zijn instrumenteel voor kankeronderzoek. Evaluatie van longmetastasen in borsttumor modellen wordt in het algemeen uitgevoerd door het bruto kwalitatieve observatie van longweefsel na dissectie. Kwantitatieve evaluatie van metastasen momenteel beperkt tot ex vivo en in vivo imaging gebaseerde technieken die gebruiker gedefinieerde parameters vereisen. Veel van deze technieken zijn op het hele organisme niveau in plaats van het cellulaire niveau 3-6. Hoewel nieuwere beeldvormende methoden gebruik te maken van multi-foton microscopie zijn in staat om metas evaluerenTasis op cellulair niveau 7, deze zeer elegante procedures zijn meer geschikt voor het evalueren mechanismen van verspreiding dan kwantitatieve beoordeling van metastatische belasting. Hier is een eenvoudige in vitro werkwijze kwantitatief beoordelen metastase gepresenteerd. Met behulp van kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR), kan tumorcel specifieke mRNA worden gedetecteerd in de muis longweefsel.

Voorbij de tijd die nodig is om de initiële inoculatie van tumorcellen te voeren in het proefdier en zo uitvoeren, de primaire tumor in vivo analyse van het weefsel oogst, RNA-isolatie en QRT-PCR analyse een 1-2 dagen procedure (figuur 1) . Een voorbeeld van grove analyse bioluminescentie beeldvorming tumorcellen te evalueren in het longweefsel. Hier werd een borstklier tumorgenese experiment uitgevoe...

Dit protocol wordt beschreven hoe kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR) gebruikt om tumorcel specifieke mRNA die metastase in de muis longweefsel detecteren.

Evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus Modellen van kwantitatieve real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van de hoeveelheid van een specifiek MRNA uit tumorcellen in de long, als methode voor het analyseren van metastase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een kwantitatieve maat voor metastase is. Om een dissectie van een longtumor uit te voeren, nadat een muis is geëuthanaseerd met een dodelijke dosis isofluraan volgens het tekstprotocol, wordt de muis op de rug op een schuimplaat geplaatst met de ledematen gespreid, waarna dissectiespeldjes worden gebruikt om de muis aan de plaat te bevestigen.Nadat de muis met ethanol is bespoten, wordt het onderste deel van het dier in het midden met een pincet vastgegrepen en wordt met een schaar door de huid omhoog richting de nek gesneden, waarbij voorzichtig wordt gewaakt om de peritoneumholte van de muis niet te doorboren. Grijp nu het peritoneum aan het onderste uiteinde van het dier vast en begin omhoog te snijden naar de basis van de nek. Snijd voorzichtig langs de linker- en rechterzijde van de ribbenkast, waarbij zorgvuldig wordt voorkomen dat bloedvaten worden doorgesneden die in de borstholte kunnen bloeden.Verwijder de ribben door links en rechts door het middenrif en de bovenste delen van de borstkas te knippen. Pak vervolgens met een pincet de trachea van de muis vast en trek deze naar voren, en gebruik dissectiescharen om de trachea door te snijden voordat de longen uit de muis worden verwijderd. Gebruik PBS om het longweefsel voorzichtig te wassen.Voer vervolgens, na de macroscopische evaluatie van het longweefsel volgens het tekstprotocol, de RNA-isolatie uit als de longen onmiddellijk geanalyseerd moeten worden. Begin bij de RNA-isolatie uit weefsel met het homogeniseren van het weefsel met een van de methoden die in het tekstprotocol worden beschreven. Bereid lysisbuffer voor uit een RNA-isolatiekit en voeg 20 µL tumor captoethanol toe aan elke milliliter lysisbuffer.Resuspendeer elke 30 gram weefsel in 300 µl lysisbuffer en soniceer het weefsel gedurende 10 seconden met een sonicator ingesteld op 30% amplitude. Voeg 10 µl protinase K toe aan 590 µl TE-buffer en voeg 600 µl van deze buffer toe aan 300 µl gesoniceerd weefsel. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.Centrifuge de monsters vervolgens gedurende 10 minuten bij een snelheid van ≥ 13.000 ×g om het debris te verwijderen. Breng daarna het supernatant over naar nieuwe buisjes. Voeg 450 µL ethanol toe aan elke 900 µL supernatant om het RNA neer te slaan.Breng vervolgens 700 µL van het mengsel van lysaat en ethanol over naar een RNA-kolom. Centrifugeer opnieuw bij ≥ 13.000 ×g gedurende één minuut om het RNA aan de kolom te binden. Gooi daarna de vloeistof in de opvangbak weg, voeg het resterende supernatant toe aan de kolom en centrifugeer opnieuw.Voeg vervolgens 350 µL wasbuffer één toe aan het bovenste gedeelte van de kolom en centrifugeer de monsters gedurende 30 seconden. Gooi het vloeibare afval weg en plaats de kolom terug in de buis. Bereid DNase voor door voor elk monster vijf eenheden DNase één-enzym te mengen met vijf µL 10X DNase-buffer en 40 µL DNase RNase-vrij water.Voeg 50 µL DNase-mix toe aan elke kolom en laat dit 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 350 µL washbuffer één toe aan de kolommen en centrifugeer de monsters gedurende 30 seconden. Gooi de vloeistof weg, voeg 600 µL washbuffer twee toe en centrifugeer opnieuw gedurende 30 seconden.Gooi de vloeistof weg voordat u 250 µL wasbuffer twee toevoegt, en centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten. Breng de kolom over naar een nieuwe opvangkoker en voeg 50 tot 100 µL RNase- en DNase-vrij water toe aan de kolom. Na een incubatie van één minuut centrifugeert u gedurende één minuut.Laat het verzamelde eluaat opnieuw door de kolom lopen om de RNA-opbrengst te verhogen. Bewaar de monsters op ijs voor onmiddellijk gebruik. Voor later gebruik: vries ze snel in op droogijs of vloeibare stikstof en bewaar ze bij minus 80 graden Celsius tot gebruik.Kwantificeer het RNA met een spectrophotometer. Gebruik vervolgens 0,5 tot 2 microgram totaal RNA in steriele, RNase- en DNase-vrije PCR-buisjes of platen om het reactiemengsel voor de eerste transynthese voor te bereiden, zoals weergegeven in deze tabel. Meng de inhoud, centrifugeer voorzichtig en programmeer een standaard PCR-apparaat volgens het hier getoonde programma.Wanneer de reactie is voltooid, gebruik dan steriel, nucleasevrij water om de voltooide reactie te verdunnen tot het gewenste volume. Om real-time PCR uit te voeren, gebruik dan een positieve controle-cDNA, zoals menselijk HER2, om voor elke primer-set een standaardcurve op te stellen door één tot vier seriële verdunningen van het cDNA voor te bereiden om vijf standaarden te genereren. Bereken vervolgens het totaal aantal monsters, waarin zowel de standaardcurve als de experimentele monsters moeten zijn opgenomen.Bereid vervolgens in steriele RNase- en DNase-vrije buisjes een mastermix voor voor elk experimenteel gen van belang, evenals voor een interne controle, zoals gapdh. Bereid een testplaat voor die één microliter cDNA bevat voor elk standaard- of experimenteel monster. Wijs ten minste één cDNA-monster per put toe voor elke primer-probe.Voeg 19 µL mastermix per well toe, voor elke primerprobe. Dit bioluminescentie-experiment demonstreert dat muizenlongen behandeld met ACT1, dat zich richt op het gap junction-eiwit Connexin 43, negatief zijn voor luciferase-activiteit, wat wijst op de afwezigheid van tumorcellen in het weefsel. Analyse van H&E-doorsneden van het longweefsel laat echter micrometastasen zien die niet door luciferase werden verlicht, wat suggereert dat luciferase-imaging niet gevoelig genoeg is om lage aantallen tumorcellen te detecteren.Hier worden de resultaten getoond van een qRT-PCR-experiment, met gebruik van een probe specifiek voor HER2, om menselijke HER2-positieve JIMT1-tumorklellen aan te tonen in longweefsel van cellen die oorspronkelijk waren getransplanteerd in het vetkussentje van de muis. Hoewel er geen macroscopisch zichtbare metastasen werden waargenomen in enige van de longen, detecteerde qRT-PCR in twee van de 11 monsters metastasen. In deze figuur is een standaardcurve-analyse opgesteld om de relatieve HER2-niveaus te bepalen, genormaliseerd naar muizenlong gapdh in een reeks celgetallen.De resultaten geven aan dat de qRT-PCR, met gebruik van de HER2-probe, gevoelig genoeg was om HER2-niveaus in slechts 10 cellen te detecteren. Tot slot laat deze regressieanalyse het relatieve aantal cellen in elk longmonster zien, inclusief de positieve en negatieve controles. Zodra de techniek onder controle is, kan deze in zes tot acht uur worden uitgevoerd, mits dit correct wordt gedaan.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzorgsmaatregelen te nemen om de RNA-integriteit te behouden tijdens de RNA-isolatie en de reverse transcriptase-reactie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe metastase in volledig longweefsel kan worden gedetecteerd middels kwantitatieve real-time PCR.

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit orthotopisch model van menselijke prostaatkanker maakt kwantificering van tumorgrootte circulerende tumorcellen en de vorming van verschillende metastase naar de longen. Omdat de cellen van het belangrijkste orgaan moet ontsnappen, in de bloedsomloop, en implantaat in een tweede locatie, dit model effectief recapituleert het scenario bij de mens.

Een orthotope muizenmodel van menselijke prostaatkankercellen Metastasis

Het doel van dit protocol is om borsttumorigenesis te bestuderen. Met deze techniek worden muisborsttumoren verwijderd en worden primaire cellen bereid uit tumoren. Er is een longextractieprotocol opgenomen voor het bestuderen van longmetastasen. Verder is er nog een protocol opgenomen voor het analyseren van muis embryonale fibroblasten van het muizenembryo.

Primaire tumor en MEF Cell Isolation om te studeren longmetastase

We beschrijven een methode voor de detectie van tumorknobbelontwikkeling in de longen van een adenocarcinoom muismodel met behulp van micro-computertomografie en het gebruik ervan voor het monitoren van veranderingen in knobbelgrootte over tijd en als reactie op behandeling. De nauwkeurigheid van de beoordeling werd bevestigd met histologische kwantificering aan het eindpunt.

Met behulp van micro-computertomografie voor de evaluatie van de ontwikkeling van tumoren en follow-up van de respons op de behandeling in een muismodel van longkanker

Hier beschrijven we het model en de aanpak om functies van pulmonaire alveolaire macrofagen in kankermetastase te bestuderen. Om de rol van deze cellen in metastase te demonstreren, werd het syngene (4T1) model van borstkanker gebruikt in combinatie met de depletie van alveolaire macrofagen met clodronat liposomen.

Het bestuderen van de rol van alveolaire macrofagen in de uitzaaiing van borstkanker

Preklinische modellen die adjuvante therapie beoordelen die gericht zijn op metastase van borstkanker, ontbreken. Om dit aan te pakken, ontwikkelden we een muizenmodel van de novo pulmonale mammary adenocarcinoma metastase, waarbij therapieën toegediend in de adjuvante omgeving (post-chirurgische resectie van primaire tumoren) kunnen worden geëvalueerd voor werkzaamheid bij het beïnvloeden van eerder gecoede pulmonale metastasen.

Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van De Novo Maagkanker Metastase

Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van het protocol voor de pulmonaire metastase assay (PuMA). Dit model staat onderzoekers bestuderen metastatische Osteosarcoom (OS) celgroei in longweefsel met behulp van een widefield fluorescentie- of confocale laser scanning microscoop.

Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom

Wij introduceren een lymfkliertest orthotopic borst kanker en radicale mastectomie model met bioluminescentie technologie te kwantificeren van de last van de tumor om na te bootsen menselijke borst kanker progressie.

Het genereren van een lymfkliertest Orthotopic uitgezaaide borst kanker Model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie

Dit werk presets een geavanceerd protocol om nauwkeurig te beoordelen tumor laden door detectie van groene fluorescerende eiwitten en bioluminescentie signalen, alsmede de integratie van kwantitatieve moleculaire detectie techniek.

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Intraveneuze injectie van kankercellen wordt vaak gebruikt in metastaseonderzoek, maar de gemetastaseerde tumorbelasting kan moeilijk te analyseren zijn. Hierin demonstreren we een staartaderinjectiemodel van metastase en nemen we een nieuwe benadering op om de resulterende gemetastaseerde longtumorbelasting te analyseren.

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Leer hoe je longmetastase evalueert in muizenborsttumormodellen met kwantitatieve real-time PCR. Deze methode detecteert tumor-specifieke mRNA in longweefsel voor kwantitatieve metastase-analyse.

Evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus Modellen van kwantitatieve real-time PCR

Meer video's verkennen