Evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus Modellen van kwantitatieve real-time PCR

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van de hoeveelheid van een specifiek MRNA uit tumorcellen in de long, als methode voor het analyseren van metastase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een kwantitatieve maat voor metastase is. Om een dissectie van een longtumor uit te voeren, nadat een muis is geëuthanaseerd met een dodelijke dosis isofluraan volgens het tekstprotocol, wordt de muis op de rug op een schuimplaat geplaatst met de ledematen gespreid, waarna dissectiespeldjes worden gebruikt om de muis aan de plaat te bevestigen.

Nadat de muis met ethanol is bespoten, wordt het onderste deel van het dier in het midden met een pincet vastgegrepen en wordt met een schaar door de huid omhoog richting de nek gesneden, waarbij voorzichtig wordt gewaakt om de peritoneumholte van de muis niet te doorboren. Grijp nu het peritoneum aan het onderste uiteinde van het dier vast en begin omhoog te snijden naar de basis van de nek. Snijd voorzichtig langs de linker- en rechterzijde van de ribbenkast, waarbij zorgvuldig wordt voorkomen dat bloedvaten worden doorgesneden die in de borstholte kunnen bloeden.

Verwijder de ribben door links en rechts door het middenrif en de bovenste delen van de borstkas te knippen. Pak vervolgens met een pincet de trachea van de muis vast en trek deze naar voren, en gebruik dissectiescharen om de trachea door te snijden voordat de longen uit de muis worden verwijderd. Gebruik PBS om het longweefsel voorzichtig te wassen.

Voer vervolgens, na de macroscopische evaluatie van het longweefsel volgens het tekstprotocol, de RNA-isolatie uit als de longen onmiddellijk geanalyseerd moeten worden. Begin bij de RNA-isolatie uit weefsel met het homogeniseren van het weefsel met een van de methoden die in het tekstprotocol worden beschreven. Bereid lysisbuffer voor uit een RNA-isolatiekit en voeg 20 µL tumor captoethanol toe aan elke milliliter lysisbuffer.

Resuspendeer elke 30 gram weefsel in 300 µl lysisbuffer en soniceer het weefsel gedurende 10 seconden met een sonicator ingesteld op 30% amplitude. Voeg 10 µl protinase K toe aan 590 µl TE-buffer en voeg 600 µl van deze buffer toe aan 300 µl gesoniceerd weefsel. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.

Centrifuge de monsters vervolgens gedurende 10 minuten bij een snelheid van ≥ 13.000 ×g om het debris te verwijderen. Breng daarna het supernatant over naar nieuwe buisjes. Voeg 450 µL ethanol toe aan elke 900 µL supernatant om het RNA neer te slaan.

Breng vervolgens 700 µL van het mengsel van lysaat en ethanol over naar een RNA-kolom. Centrifugeer opnieuw bij ≥ 13.000 ×g gedurende één minuut om het RNA aan de kolom te binden. Gooi daarna de vloeistof in de opvangbak weg, voeg het resterende supernatant toe aan de kolom en centrifugeer opnieuw.

Voeg vervolgens 350 µL wasbuffer één toe aan het bovenste gedeelte van de kolom en centrifugeer de monsters gedurende 30 seconden. Gooi het vloeibare afval weg en plaats de kolom terug in de buis. Bereid DNase voor door voor elk monster vijf eenheden DNase één-enzym te mengen met vijf µL 10X DNase-buffer en 40 µL DNase RNase-vrij water.

Voeg 50 µL DNase-mix toe aan elke kolom en laat dit 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 350 µL washbuffer één toe aan de kolommen en centrifugeer de monsters gedurende 30 seconden. Gooi de vloeistof weg, voeg 600 µL washbuffer twee toe en centrifugeer opnieuw gedurende 30 seconden.

Gooi de vloeistof weg voordat u 250 µL wasbuffer twee toevoegt, en centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten. Breng de kolom over naar een nieuwe opvangkoker en voeg 50 tot 100 µL RNase- en DNase-vrij water toe aan de kolom. Na een incubatie van één minuut centrifugeert u gedurende één minuut.

Laat het verzamelde eluaat opnieuw door de kolom lopen om de RNA-opbrengst te verhogen. Bewaar de monsters op ijs voor onmiddellijk gebruik. Voor later gebruik: vries ze snel in op droogijs of vloeibare stikstof en bewaar ze bij minus 80 graden Celsius tot gebruik.

Kwantificeer het RNA met een spectrophotometer. Gebruik vervolgens 0,5 tot 2 microgram totaal RNA in steriele, RNase- en DNase-vrije PCR-buisjes of platen om het reactiemengsel voor de eerste transynthese voor te bereiden, zoals weergegeven in deze tabel. Meng de inhoud, centrifugeer voorzichtig en programmeer een standaard PCR-apparaat volgens het hier getoonde programma.

Wanneer de reactie is voltooid, gebruik dan steriel, nucleasevrij water om de voltooide reactie te verdunnen tot het gewenste volume. Om real-time PCR uit te voeren, gebruik dan een positieve controle-cDNA, zoals menselijk HER2, om voor elke primer-set een standaardcurve op te stellen door één tot vier seriële verdunningen van het cDNA voor te bereiden om vijf standaarden te genereren. Bereken vervolgens het totaal aantal monsters, waarin zowel de standaardcurve als de experimentele monsters moeten zijn opgenomen.

Bereid vervolgens in steriele RNase- en DNase-vrije buisjes een mastermix voor voor elk experimenteel gen van belang, evenals voor een interne controle, zoals gapdh. Bereid een testplaat voor die één microliter cDNA bevat voor elk standaard- of experimenteel monster. Wijs ten minste één cDNA-monster per put toe voor elke primer-probe.

Voeg 19 µL mastermix per well toe, voor elke primerprobe. Dit bioluminescentie-experiment demonstreert dat muizenlongen behandeld met ACT1, dat zich richt op het gap junction-eiwit Connexin 43, negatief zijn voor luciferase-activiteit, wat wijst op de afwezigheid van tumorcellen in het weefsel. Analyse van H&E-doorsneden van het longweefsel laat echter micrometastasen zien die niet door luciferase werden verlicht, wat suggereert dat luciferase-imaging niet gevoelig genoeg is om lage aantallen tumorcellen te detecteren.

Hier worden de resultaten getoond van een qRT-PCR-experiment, met gebruik van een probe specifiek voor HER2, om menselijke HER2-positieve JIMT1-tumorklellen aan te tonen in longweefsel van cellen die oorspronkelijk waren getransplanteerd in het vetkussentje van de muis. Hoewel er geen macroscopisch zichtbare metastasen werden waargenomen in enige van de longen, detecteerde qRT-PCR in twee van de 11 monsters metastasen. In deze figuur is een standaardcurve-analyse opgesteld om de relatieve HER2-niveaus te bepalen, genormaliseerd naar muizenlong gapdh in een reeks celgetallen.

De resultaten geven aan dat de qRT-PCR, met gebruik van de HER2-probe, gevoelig genoeg was om HER2-niveaus in slechts 10 cellen te detecteren. Tot slot laat deze regressieanalyse het relatieve aantal cellen in elk longmonster zien, inclusief de positieve en negatieve controles. Zodra de techniek onder controle is, kan deze in zes tot acht uur worden uitgevoerd, mits dit correct wordt gedaan.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzorgsmaatregelen te nemen om de RNA-integriteit te behouden tijdens de RNA-isolatie en de reverse transcriptase-reactie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe metastase in volledig longweefsel kan worden gedetecteerd middels kwantitatieve real-time PCR.