Geïnduceerde pluripotentie

Geïnduceerde pluripotente stamcellen, net als menselijke embryonale stamcellen, kunnen differentiëren in bijna elk type lichaamscel, en hebben daarom een groot potentieel op het gebied van regeneratieve geneeskunde.

Menselijke embryonale stamcellen, of hESC's, worden verkregen uit pre-implantatie-embryo's, terwijl volledig gedifferentieerde somatische cellen worden gebruikt om geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren, ook wel iPSC's genoemd.

In deze video leer je over de basisprincipes achter het genereren van iPSC's, een stapsgewijs protocol om pluripotentie te induceren in gedifferentieerde cellen, en enkele van de vele downstream-toepassingen en aanpassingen van dit protocol.

Laten we beginnen met de principes achter het genereren van iPSC's uit somatische celtypen te bespreken.

Gedifferentieerde cellen, zoals huidcellen of neuronen, zijn de cellen waarvan het lot is bepaald. Ze zijn toegewijd aan het uitvoeren van een specifieke functie. Aan de andere kant zijn pluripotente stamcellen de cellen waarvan het lot onbeslist is, en ze kunnen differentiëren in elk type cel.

Het proces van het veranderen van de identiteit van een reeds gedifferentieerde cel naar een pluripotente toestand wordt cellulaire herprogrammering genoemd. Dit omvat het veranderen van het patroon van genexpressie in de cel, omdat het aantal en de soorten eiwitten die door een cel worden geproduceerd een belangrijke rol spelen bij het definiëren van de identiteit van een cel.

Een van de manieren om cellulaire herprogrammering te induceren is door de expressie van bepaalde transcriptiefactoren te induceren. Transcriptiefactoren zijn eiwitten die zich binden aan regulerende sequenties binnen een gen. Sommige van deze sequenties worden 'promoters' genoemd, en bevorderen daarom de transcriptie van een gen. Enkele transcriptiefactoren kunnen de expressie van talloze genen beïnvloeden, wat een enorme impact heeft op de celidentiteit.

De vier klassieke transcriptiefactoren waarvan is aangetoond dat ze pluripotentie induceren, zijn Oct4, Sox2, cMyc en Klf4. Deze factoren worden ook wel Yamanaka-factoren genoemd, naar de onderzoeker die hun herprogrammeringseffecten ontdekte.

Er kunnen meerdere methoden worden gebruikt om de expressie van deze transcriptiefactoren te induceren. De meest gebruikelijke en efficiënte methode is het gebruik van een gemodificeerd virus om de transcriptiefactorgenen in de kern te leveren, waar ze zich zullen integreren in het genoom.

Bij deze methode worden de genen die coderen voor de vier Yamanaka-factoren afzonderlijk verpakt in verschillende retrovirussen en toegevoegd aan gedifferentieerde cellen. Wanneer de cellen worden blootgesteld aan gemodificeerde virussen, raakt een klein deel van de gedifferentieerde cellen geïnfecteerd met alle vier de transcriptiefactor-dragende virussen. Ze beginnen te dedifferentiëren totdat grote bolvormige clusters van pluripotente stamcellen zijn gevormd. De clustervorming helpt iPSC's om een micro-omgeving te creëren die vergelijkbaar is met in vivo stamcellen, en helpt ze daarom bij het behoud van hun pluripotentie.

Aangezien je nu de basisprincipes achter het genereren van iPSC's begrijpt, laten we een algemeen protocol doornemen voor het induceren van pluripotentie in muis embryonale fibroblasten, of MEF's, met behulp van een viraal transductiesysteem.

Voordat je begint met deze procedure, houd er rekening mee dat virussen de cellen in je lichaam kunnen infecteren, dus het volgen van veiligheidsrichtlijnen is uiterst belangrijk.

Om het transfectieproces te beginnen, wordt het kweekmedium verwijderd van een plaat met een hoge dichtheid van MEF's, en worden de cellen gewassen met bufferoplossing. Vervolgens wordt een oplossing met een eiwit-afbreekend enzym, zoals trypsine, toegevoegd om de cellen van de bodem van de schaal te heffen. Kweekmedium wordt vervolgens toegevoegd aan de plaat, en de losgekoppelde cellen worden overgebracht naar een centrifugeerbuisje.

Na centrifugatie wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd in het kweekmedium. Vervolgens worden de cellen geteld en wordt de concentratie aangepast zodat een optimaal aantal cellen de volgende dag met het virus kan worden geïnfecteerd. De cellen worden overnacht geïncubeerd.

Nadat de cellen zich op hun nieuwe schaal hebben gezet, wordt het oude medium vervangen door vers medium, en worden gemodificeerde virussen met de gewenste transcriptiefactoren toegevoegd aan de plaat. De cellen worden vervolgens gedurende voldoende tijd met de virussen geïncubeerd om infectie mogelijk te maken. Na incubatie wordt het medium dat vrije virussen bevat verwijderd en vervangen door vers embryonaal stamcelmedium.

Gedurende 2-3 weken na transformatie moeten de cellen worden gekweekt bij 37° in een incubator, en moet het kweekmedium dagelijks worden vervangen.

Na deze tijdsperiode moeten iPSC-kolonies die vergelijkbaar zijn met embryonale stamcelkolonies groot genoeg zijn om te worden opgepikt. De kolonies kunnen worden overgebracht naar een nieuwe plaat met medium met geschikte groeifactoren, en verder worden gekweekt. Om pluripotentie te bevestigen, wordt een deel van de celpopulatie gekleurd met pluripotentiemarkers.

Nu je hebt gezien hoe je iPSC's uit gedifferentieerde cellen kunt genereren, laten we eens kijken naar enkele downstream-toepassingen en aanpassingen van deze zeer nuttige methode.

Een belangrijk kenmerk van iPSC's is dat ze kunnen worden gebruikt om bijna elke cel in het lichaam te genereren. Dit voorbeeld toont de generatie van hartspiercellen, cardiomyocyten genaamd, uit iPSC's. Om dat te doen, worden de iPSC's overgebracht naar niet-adherente platen die hen toestaan embryoïde lichamen te vormen, die aggregaten van pluripotente stamcellen zijn. De embryoïde lichamen worden gekweekt in gespecialiseerd medium dat serum en ascorbinezuur bevat, wat de hartdifferentiatie bevordert. Succesvolle differentiatie kan gemakkelijk worden waargenomen wanneer sommige cellen beginnen te kloppen.

Aangezien iPSC's potentieel in elk celtype kunnen differentiëren, kunnen ze ook een volledig organisme vormen, zoals een muis. Dit kan worden gedaan met behulp van een test genaamd tetraploï