Fluorescentie en Bioluminescentie beeldvorming van Subcellulaire Ca 2+ In Aged hippocampus Neuronen
1 december 2015
Intracellulair Ca2+-remodellering bij veroudering kan bijdragen aan excitotoxiciteit en neuronbeschadiging, processen gemedieerd door Ca2+-overbelasting. We wilden Ca2+-remodellering in de verouderende hersenen onderzoeken door middel van fluorescentie- en bioluminescentie-beeldvorming van cytosolisch en mitochondriaal Ca2+ in langetermijnculturen van hippocampusneuronen van ratten, een model voor neuronale veroudering.
Het algemene doel van deze procedure is om calciumremodellering in de verouderende hersenen te onderzoeken met behulp van fluorescentie- en bioluminescentiebeeldvorming van cytosolisch en mitochondriaal calcium in langdurige culturen van frat hippocampus-neuronen, wat wordt beschouwd als een model van neuronaal veroudering. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het verouderingsveld te begrijpen, zoals hoe remodellering van intracellulair calcium bijdraagt aan excitotoxiciteit en neuronbeschadiging, beide gerelateerd aan calciumoverbelasting. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om calciumremodellering in individuele neuronen nauwgezet te volgen met behulp van culturen op verschillende DYS in vitro van hetzelfde specimen. De duplicatie van deze techniek is van therapeutisch belang bij een beroerte of celziektecijfer omdat het variabele nieuwe doelwitten betreft die gerelateerd zijn aan calciumoverbelasting in deze agentgerelateerde ziekten.
Na het bekijken van deze video heeft Jezus een goed begrip van hoe fluorescentie- en herinneringsbeeldvorming van cytosolisch en mitochondriaal calcium in korte en lange termijn culturen van hippocampus-neuronen van ratten moet worden uitgevoerd. Om deze procedure te starten, verdeel de deksels op een strookje paraform in een petrischaal. Breng vervolgens 200 microliter poly D lycine aan op een milligram per milliliter op elke deksel en behandel ze een nacht lang.
De volgende dag was je de deksels met dubbel gedestilleerd steriel water elke 15 minuten gedurende 90 minuten onder steriele omstandigheden. Plaats de deksels in de multi en bewaar ze in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5%CO2 tot gebruik. Om de hippocampus-neuronen te isoleren, open je de schedel van de pasgeboren rattenpups met steriele schaar, haal je de hersenen eruit met een spatel en was je deze snel in ham's F 12 medium.
Maak vervolgens een diagonale snede met de scalpel in elk hemi-sfeer en breng het over naar de petrischaal met hams F 12 medium onder de microscoop. Gooi de hersenvliezen weg. Identificeer voorzichtig de hippocampus op een karakteristieke concave locatie boven de cortex.
Separeer vervolgens de hippocampus van de cortex door hem voorzichtig weg te trekken en verwijder hem met oogschaar. Breng vervolgens de hippocampus-stukken over naar een flacon met 1,8 milliliter voorgefilterde pepaanoplossing. Incubeer ze bij 37 graden Celsius met af en toe zachtjes schudden gedurende 15 minuten.
Voeg vervolgens 90 microliter DNA's één oplossing toe. Voeg 50 microgram per milliliter toe en incubeer ze nog eens 15 minuten. Breng vervolgens het weefsel over naar een 10 milliliter centrifugeerbuis en was de fragmenten met vers neuro basaal kweekmedium.
Verkrijg een celsuspensie door de weefselfragmenten door een vijf milliliter plastic pipet te laten passeren. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij 160 G gedurende vijf minuten. Vervolgens verwijder je het supinate met behulp van een plastic steriele weidepipet en suspendeer je het pellet voorzichtig in één milliliter neuro basaal kweekmedium met een één milliliter geautomatiseerde pipet.
Meet vervolgens de celdichtheid met behulp van een neubauer telkamer. Voeg 10 microliter celsuspensie toe en tel het aantal cellen onder de microscoop. Voer vervolgens de overeenkomstige berekeningen uit om 40 tot 80 microliter celsuspensie te verkrijgen, die ongeveer 30.000 cellen bevat.
In de vierwelplaat met 500 microliter neuro basaal medium, plaats je ongeveer 30.000 cellen in elke put met glazen deksels. Houd ze twee tot vijf dagen in vitro voor jonge neuronen of meer dan 15 dagen in vitro voor oudere neuronen. In deze procedure, incubeer je de cellen met minder dan 2:00 AM gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
Breng vervolgens de deksels over naar de profusiekamer. Plaats daarna de profusiekamer met de deksel in de houder op de omgekeerde microscoop. Selecteer het microscopische veld en perfuseer de cellen continu met voorverwarmd HBS.
Vervolgens epi-verlicht je de cellen bij 340 en 380 nanometer. Daarna neem je om de vijf tot 10 seconden het uitgezonden licht op bij 520 nanometer met een fluorescente camera, die wordt gefilterd door een fira twee diic spiegel. Om de opgenomen fluorescente beelden te analyseren, open je eerst het experimentbestand met behulp van de Aqua Cosmos software, klik op ratio en selecteer het gewenste ratiobereik.
Bereken de pixel per pixel ratio in de resulterende beelden om een reeks ratiobeelden te verkrijgen. Trek vervolgens de achtergrond af door de achtergrondverwijderingsknop aan te passen. Druk daarna op start berekening.
Druk vervolgens op de knop voor de volledige tijdsreeks en verwijder de oude ROI's voor kwantitatieve analyse van individuele cellen. Maak nieuwe ROI's of de ROI's die overeenkomen met de individuele neuronen. Om de individuele opnames te plotten, exporteer je de verhoudingsfluorescentiewaarden die overeenkomen met elke ROI naar het Origin lab-programma door op grafiek te klikken.
Klik vervolgens op berekenen en sla het TXT-bestand op. Maak vervolgens de overeenkomstige berekening voor het schatten van de grootte van de stijging in de fluorescentieratio als reactie op elke stimulatie om gekweekte neuronen te transfecteren met de MIT mutante plasmide. Bereid eerst 50 microliter oplossing A met transfectiemiddel in een flacon voor.
Bereid vervolgens 50 microliter oplossing B met MIT ute plasmide in een flacon voor. Voeg oplossing B toe aan oplossing A en incubeer gedurende 20 minuten. Breng vervolgens de deksels met hippocampus-neuronen over naar nieuwe multiputjes met 200 microliter vers neuro basaal TF. Voeg vervolgens 100 microliter oplossing A en B druppelsgewijs toe boven elke deksel en incubeer gedurende 30 minuten.
Na 30 minuten verwijder je het medium. Was de cellen met vers neuro basaal tf. Breng de deksels vervolgens terug naar het oorspronkelijke neuro basale kweekmedium en kweek de cellen gedurende 24 uur na transfectie om efficiënte expressie en targeting van de sonde mogelijk te maken.
Voeg vervolgens vier microliter sealant TEREZIN N toe aan 200 microliter HBS om een eindconcentratie
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt calciumremodeling in het verouderende brein, met een focus op hoe dit bijdraagt aan excitotoxiciteit en neuronale schade. Met behulp van fluorescentie- en bioluminescentie-imaging onderzoekt het onderzoek cytosolisch en mitochondriaal calcium in langetermijnculturen van hippocampale neuronen van ratten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Verouderingsonderzoek
Achtergrond
- Calciumoverbelasting is gekoppeld aan excitotoxiciteit en neuronale schade.
- Het begrijpen van calciumremodellering is cruciaal voor inzichten in neuronale veranderingen gerelateerd aan veroudering.
- Hippocampale neuronen van ratten dienen als model voor het bestuderen van neuronale veroudering.
- Fluorescentie- en bioluminescentie-beeldvormingstechnieken maken gedetailleerde observatie van calciumdynamiek mogelijk.
Doel van de studie
- Om de rol van intracellulaire calciumremodellering bij veroudering te onderzoeken.
- Om te verkennen hoe calciumdynamiek bijdraagt aan excitotoxiciteit.
- Om beeldvormingstechnieken in te zetten voor het bestuderen van neuronale cultures op lange termijn.
Gebruikte methoden
- Fluorescentiebeeldvorming van cytosolisch calcium.
- Bioluminescentiebeeldvorming van mitochondriaal calcium.
- Langetermijnculturen van hippocampale neuronen van ratten.
- Beoordeling van calciumremodellering in verschillende ontwikkelingsstadia in vitro.
Belangrijkste resultaten
- Geïdentificeerde patronen van calciumremodellering in verouderende neuronen.
- Toonde de relatie aan tussen calciumoverbelasting en neuronale schade.
- Bood inzichten in de mechanismen van excitotoxiciteit bij veroudering.
- Toonde de effectiviteit van beeldvormingstechnieken aan bij het bestuderen van individuele neuronen.
Conclusies
- Calcium-remodellering speelt een significante rol bij neuronale veroudering.
- Inzicht in deze processen kan leiden tot therapeutische doelwitten voor ouderdomsgerelateerde neurodegeneratieve ziekten.
- Beeldvormingstechnieken zijn waardevol voor het bestuderen van calciumdynamiek in neuronen.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de Industrie
Inzicht in calciumremodellering in verouderde neuronen biedt voorspellende zekerheid voor de validatie van targets in programma's voor neurodegeneratieve ziekten. Deze methode maakt mechanische risicoreductie mogelijk door intracellulaire calciumdynamiek te koppelen aan excitotoxiciteit en neuronale schade. Het ondersteunt vroege beslissingen in het ontdekkingsproces door ouderdomsgerelateerde pathofysiologische reacties te modelleren in een gecontroleerd in vitro systeem.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over calciumoverbelasting in excitotoxiciteitspaden.
- Operationele waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk door real-time monitoring van cytosolische en mitochondriale calciumfluxen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het identificeren van verbindingen die leeftijdsafhankelijke calciumresponsen moduleren.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde neuronale systemen voor op downstream compound-screening tegen calcium-gemedieerde toxiciteit.
- Operationele waarde: Standaardiseert fluorescentie- en bioluminescentie-uitlezingen voor reproduceerbare kwantitatieve calciummetingen.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt hergebruik van het platform mogelijk over jonge en verouderde neuronale modellen voor de ontwikkeling van vergelijkende assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door verouderde hippocampale neuronen in vitro te modelleren.
- Translationele waarde: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door continuïteit in mechanismen van calciumdysregulatie.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen op basis van calciumresponsprofielen in verouderde versus jonge neuronen.
Integratie van Pijplijn en Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door hypothesetoetsing mogelijk te maken van calcium-modulerende verbindingen in neurale modellen voor ouderdomsgerelateerde aandoeningen.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en biologische risicoreductie van targets voor calciumafhankelijke excitotoxiciteit.
- Screening: Levert assay-klare systemen met gestandaardiseerde calciumflux-uitlezingen voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve ratiometrische fluorescentie- en fotontellings-bioluminescentie-outputs voor de vergelijking van condities.
- Translational Research: Verbindt met preklinische continuïteit via gemodelleerde verouderingsfenotypes en patronen van calciumremodellering.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor longitudinale studies naar calciumdynamiek over verschillende stadia van neuronale rijping.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door mechanistisch inzicht in calciumremodellering.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid van dual-modality calcium-imaging in primaire neuronale culturen.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van biologische risico's in een laat stadium van neurodegeneratieprogramma's.
- Portfolio-impact: Risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van effectiviteit in modellen van calciumrespons in verouderde neuronen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire neuronale kweek, transfectie en live-cell imaging.
- Afhankelijk van fluorescentiemicroscopie, fotontellende camera's en ratio-imagingsoftware.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor consistente verouderingsmodellen op basis van DIV en stimulusprotocollen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het vertalen van bevindingen naar andere neuronale subtypen of ziektestudies.
- Beperkt door het in vitro karakter van het model, dat de complexiteit van veroudering in vivo mogelijk niet volledig nabootst.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Short and Long-term Culture of Rat Hippocampal Neurons
4:59
Fluorescence Imaging of Cytosolic Ca2+ Concentration
7:23
Biolumninescence Imaging of Mitochondria Ca2+ Concentration
11:17
Results: NMDA Increases Cytosolic [Ca2+] and Induces Mitochondrial Ca2+ Overload in Hippocampal Neurons
12:52
Conclusion
