Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

Het algemene doel van deze methode is om neuronen en hun axonale projecties te labelen om hun verbindingen met doel- of bronhersenkernen van belang te traceren. Deze methode helpt bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de neurowetenschap, zoals connectiviteitspatronen tussen verschillende gebieden of neuronale subpopulaties van de hersenen, evenals hun functionele betekenis voor een bepaalde neurocircuit. Het grote voordeel van deze techniek is de verhoogde doelnauwkeurigheid tijdens tracerinjecties.

Dit wordt bereikt door het gebruik van eenvoudige optische apparatuur om fluorescerend gelabelde hersenkernen te visualiseren. Een ander voordeel van deze methode is dat het niet-invasief genotypering mogelijk maakt van muispopulaties die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen onder controle van neuronale promotoren. Bij het genotyperen van pups controleert u op de expressie van de respectieve fluorescerende markeringen met een laserpointer met de juiste excitatiegolflengte.

Tegelijkertijd draagt u filterbril die de excitatiegolflengte blokkeert, maar de emissiegolflengte doorlaat. Richt de laser op de achterkant van het hoofd of het ruggenmerg van de betreffende pup. Wees voorzichtig om de laser niet in de ogen van de P te laten schijnen en houd de laserblootstelling kort.

De geëxciteerde fluorescerende markeringen zouden zichtbaar moeten zijn door de huid. Wanneer de muis ouder is, kunnen individuele neuronen van geoogst weefsel worden geïdentificeerd. Nadat de muis is verdoofd en is gecontroleerd op afwezigheid van reflex, verwijdert u de huid over de schedel, snijdt u de huid langs de achterkant van het hoofd naar het midden van de schedel.

Bij oudere muizen van meer dan een maand kan de fluorescentie worden waargenomen door de ogen van het dier. Gebruik vervolgens ijskoud PBS trans Cardi om het markeringspositieve dier te perfuseren met behulp van een naald van 30 gauge, na vijf tot 10 minuten zal het grootste deel van het bloed zijn verwijderd. Verwijder vervolgens de hersenen en ontleedt de regio van belang.

Hier bevat het trapeziumlichaam, dat twee prominente bollen in de ventrale regio van de hersenen is, de regio van belang. De ventrale kernen van de trapeziumlichamen of VNTB beginnen met het overbrengen van de explantate hersengebied van belang naar een schaal met zuurstofrijke ontleedoplossing.Vastzet de explan met 30 gauge spuitnaalden zodat het gebied voor injectie toegankelijk is bovenop.

Voor de injectie gebruikt u Bo silicaatglas getrokken injectiepipetten die in drie of vier trekcycli worden vervaardigd. Laad de pipet met de volgende oplossing. Choleratoxine subeenheid B geconjugeerd aan Alexa FLUORA 4 5 55, die voornamelijk voor retrograde transport is.

Met de laserpointer en injectiepipetten, allemaal gemonteerd en klaar voor gebruik, gaat u verder met het richten van de straal op de gelabelde hersengebied of cellen om te injecteren. Observeer het veld door de bandpass filterbril om te zien welke neuronen met de injectiepipet moeten worden gericht. Gebruik de micro manipulator om de pipet in het gebied van belang te plaatsen.

Vervolgens gebruiken we een drukinjector ingesteld om 50 milliseconde pulsen bij 15 PS af te leveren, ik injecteer de tracerstof in twee tot 10 pulsen. Laat 10 tot 15 seconden verstrijken tussen de pulsen zodat de geïnjecteerde kleurstof zich kan verspreiden. Bij het injecteren van tetraethyl rumine stimuleert u elektrisch het gebied met de stimulerende elektrode die TTL-pulsen levert.

Zorg ervoor dat de elektrode is geaard in de badoplossing. Lever acht TTL-pulsen bij acht volt, elk 50 milliseconden lang met 50 milliseconde intervallen. Stimuleer het gebied met 10 tot 20 pulsrepetities gedurende enkele minuten.

Hersenkernen variëren in grootte, neuronale dichtheid en celtypen. Dit betekent dat de duur en het aantal druk- en/of elektrische pulsen mogelijk moeten worden aangepast om optimale labelresultaten voor een bepaald hersengebied te bereiken. Controleer met behulp van de laser en bril het fluorescerende tracersignaal.

De kleurstof moet door cellen worden opgenomen en zich verspreiden rond het geïnjecteerde gebied. Na de injectie incubeert u de hersenstammen in beluchte kunstmatige hersenvloeistof op kamertemperatuur gedurende één tot vier uur. Houd de oxygenatie tijdens de incubatie vast, bevestig vervolgens het weefsel in 4% paraformaldehyde.

In PBS overnacht bij vier graden Celsius de volgende dag kan het weefsel worden gesneden en gemonteerd en een intergrade-injectie in de ventrale kern van het trapeziumlichaam of VNTB. Het gebruik van tetraethyl Rodine dextrine toont aan dat projecties van de VNTB zich uitstrekken tot de mediale kern van het trapeziumlichaam, of MNTB. Vervolgens werd de MNTB geïnjecteerd met chole toin, subeenheid B, die de VNTB retro geweldig labelde.

In meer detail leken de somata van de glyc enterische VNTB-cellen vervolgens te worden gelabeld. De MNTB werd geïnjecteerd met het retrograde label dextrine tri. In tegenstelling tot het punctate patroon van CTB-labeling, was de dextrine tri labeling dicht en GOGI-achtig.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u neuronen en hun processen kunt labelen met verhoogde nauwkeurigheid. De gedemonstreerde techniek helpt u bij het identificeren van hersengebieden en neuronale subpopulaties die deelnemen aan een bepaald neurocircuit. Eenmaal onder de knie, kan de injectieprocedure in ongeveer 30 minuten worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Deze procedure kan gemakkelijk worden gecombineerd met andere methoden zoals immunochemie of hersenklaring om aanvullende vragen te beantwoorden over de morfologie, directioneelheid of functionaliteit van neuronale projecties en andere neuronale structuren.