Name: Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Leer hoe u neuronen en axonale projecties labelt in hersenexplantaten met laser-geleide tracerinjecties. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van neurale circuitstudies in muizen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ondersteund door NIH / NIDCD R01 DC 011582. Imaging experimenten werden uitgevoerd aan de Universiteit van Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Core mede ondersteund door NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Aantal UL1 RR025780 en de Rocky Mountain Neurlogical Disorders Core Center Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac van het Salk Institute gaf ons de GlyT2-GFP muizen.

1. Optische Genotyping 1. Optische Genotypering van Muis Pups <ol><li> Controleer expressie van de respectieve fluorescerende merker met een laser pointer van het juiste excitatie golflengte (405 nm in de hier beschreven experimenten) en bijbehorende filter bril blokkeren excitatiegolflengte maar langs de emissiegolflengte (450 - 700 nm in de hier beschreven experimenten) . Richt de laser pointer aan de achterkant van het hoofd of het ruggenmerg van de muis pup (zie figuur 1). Vermijd schijnt de laser in de ogen en langdurige blootstelling van de huid aan laserlicht. </li></ol> 2. optische Genotypering van oudere dieren <ol><li> Diep verdoven van de muis (leeftijd p14 aan p138 in de hier beschreven experimenten) met een overdosis pentobarbital door een intraperitoneale injectie (120 mg / kg lichaamsgewicht). Bevestig de juiste verdoving door het controleren van reflexen van het dier (kort knijpen het topje van the ear of één van de achterpoten om het terugtrekken van de reflex of poot) wekken. </li><li> Opmerking: Ondanks het gebruik van een overdosis pentobarbital (120 mg / kg lichaamsgewicht) wordt verwezen naar de injectieprocedure als &quot;diepe verdoving&quot; in plaats van euthanasie, omdat het dier idealiter nog in leven (bijvoorbeeld het hart blijft kloppen), wanneer de chirurgie en de perfusie beginnen. Dit zorgt voor een efficiëntere perfusie van de inwendige organen zoals de hersenen. </li><li> Zodra het dier geen reflexen vertonen zorgvuldig de huid die over de schedel (Figuur 2A) verwijderd door een incisie in de huid die de achterkant van het hoofd en snijden om de buik van de schedel. Expose de schedel ontdekt laserlicht en observeer de fluorescentie door het filter bril zoals hierboven beschreven. Als een positief GFP-signaal wordt waargenomen, ga dan naar stap 2, zo niet, offeren het dier door middel van onthoofding (tweede / zorgen vorm van euthanasie na onzeIACUC regelgeving). </li></ol> Opmerking: In nog oudere muizen (&gt; 1 maand) de fluorescentie worden waargenomen door de ogen van het dier. 2. transcardial perfusie en Brain Voorbereiding <ol><li> Perfuseren transcardially met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; NaCI: 137 mM, KCl 2,7 mM, KH 2PO 4: 1,76 mM Na 2 HPO 4: 10 mM) met een 30 G injectienaald om het bloed uit grotendeels verwijderen het dier. <ol><li> Eerste, voorzichtig open de ribbenkast met een scherpe schaar en duw de naald in de linker ventrikel van het hart. Start de pompen PBS in het hart en de aorta en onmiddellijk na deze stap opent het rechter atrium van het hart met de schaar om het bloed naar het lichaam te verlaten. Opmerking: perfusie duurt 5 - 10 min afhankelijk van de grootte van het dier. </li></ol></li><li> Na verbloeding door middel van perfusie, onthoofden het dier veilig zijn kop met pin needles (of 30 G injectienaalden) door piercing ze door de oogkassen in een preparaat schaal en verwijder de hersenen uit de schedel. <ol><li> Gebruik eerst scherpe schaar af te snijden van de huid overlappen schedel: een kleine incisie in het achterhoofd, en snijd over de middellijn aan de dorsale zijde van de kop, gesneden om de zijkanten net caudaal van de ogen van het dier en tenslotte gesneden in de caudale richting volledig de flappen van de huid te verwijderen aan de achterkant van het hoofd. </li><li> Vervolgens herhaalt u dezelfde snijden patroon voor de schedel zelf, zorg ervoor dat zowel cochleas in het proces te verwijderen, omdat deze aanzienlijk zal het verwijderen van de hersenstam aan het eind vereenvoudigen. Na deze procedure de caudale helft van de hersenen zou moeten liggen volledig bloot. </li><li> In de volgende stap, met een scherp scheermesje of een scalpel door de gehele voorhersenen te snijden onder een hoek van ongeveer 45 ° en ongeveer 2 mm rostraal van het cerebellum. Schep het gescheiden voorste helft van de hersenen met abent spatel. </li><li> Gebruik de spatel om de caudale helft van de hersenen verhogen rostrale aan zijn uiteinde en vervolgens dwars door de craniale zenuwen die nog steeds verbonden met de hersenstam aan de buikzijde. Als resultaat moeten de caudale helft van de hersenen inclusief de hersenstam vrij van de rest van de bereide dierkop vallen. </li><li> Flip de verwijderde caudale helft van de hersenen om de buikzijde bloot en snijd langs de frontale vlak net rostraal (voor de anterograde injecties) of gewoon staartvin (voor de retrograde injecties) van de ventraal gelegen &quot;bollen&quot; met de trapezium lichaam (zie stap 2,3). <ol><li> Gebruik altijd een scherp scheermesje of een scalpel voor het snijden procedure om celdood veroorzaakt door overmatige mechanische belasting op het weefsel te minimaliseren. Als resultaat moet een brain explantaat uitstrekt over ongeveer 1 cm in lengte en dat het volledige superieure olivaris complex langs andere hersengebieden zijn verkregen. </li></ol></li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> Opmerking: Dit protocol toont de procedure voor een tracer injectie in het lichaam trapezoïde in de auditieve hersenstam. Pas de locatie en oriëntatie van de snijvlakken en injectieplaatsen indien nodig. Indien de fluorescerende hersengebieden plaats liggen dicht genoeg bij het ​​hersenoppervlak, zodat zij kunnen worden geïdentificeerd en geïnjecteerd zonder dat de hersenen (zie figuur 2B), dan is de coronale snij stap kan worden overgeslagen. <ol start="3"><li> Identificeer de trapezium lichaam als twee ventrale prominente &quot;bollen&quot; met de ventrale kern van de trapezium lichaam (VNTB). </li></ol> Opmerking: Voor meer anatomische referentie met betrekking tot de geschatte stereotactische locatie van deze snijvlakken, zie Franklin en Paxinos, 2008. Panel 78 van de atlas, Bregma ~ -5,7 mm toont de mediale kern van de trapezium lichaam (= MNTB) bestempeld als &quot;Tz &quot;. Paneel 69 toont het ventrale kern van de trapezium body (VNTB) bestempeld als &quot;MVPO&quot; (medioventral periolivary nucleus) 19. 3. Anterograde / Retrograde Tracing Opmerking: Voer alle volgende procedures bij kamertemperatuur (25 ° C). <ol><li> Na het snijden plaatst de hersenstam explantaat in een preparaat schotel met geoxygeneerde (95% O2, 5% CO 2) ontleden oplossing (NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2: 0,1 mM, glucose : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mm, NaHCO3: 25 mM, ascorbinezuur: 0,4 mm, myoinositol: 3 mm pyrodruivenzuur: 2 mm), het veiligstellen van het met 30 G injectienaalden. Zorg ervoor dat het gebied van de injectie naar boven is gericht. </li><li> Trek injectie pipetten van borosilicaatglas en vullen met een van de volgende drie oplossingen: a) 1,0 mg / ml oplossing van choleratoxin subunit-b geconjugeerd aan een fluorofoor Alexa 555 in PBS 12-13 (hoofdzakelijk voor retrograde transport), b ) een 1% -dilution in 0,9% zoutoplossing van dextran tetramethylrhodamine 555 (3000 MW, hoofdzakelijk voor retrograde transport) of c) een 1% -dilution in 0,9% zoutoplossing van 10.000 MW dextran-TRITC 555 (hoofdzakelijk voor anterograde transport). <ol><li> Ervoor zorgen dat de injectie pipet weerstanden bereik van 2,5 om 3,5 MOhm en ze worden geproduceerd in 3 - 4 trekken cycli. Voor de hier beschreven experimenten, dit te bereiken door in te voorgeprogrammeerde trekken algoritme de pipet trekker. </li></ol></li><li> Verlichten de hersenen explant met behulp van een statisch gemonteerde laser pointer van de juiste golflengte (item nummer 2 in figuur 3A; 405 nm golflengte in de hier beschreven experimenten). Gebruik de laser pointer als leidraad voor de injecties, en richt de laserstraal op het fluorescent gelabelde hersenen kern of de cellen van belang, dat zal worden geïnjecteerd. </li><li> Zoek en observeer de verlichte doelgebied door een binoculair microscoop, terwijl het dragen van de compatibele filter bril (450-700 nm banddoorlaatfilter in de hier beschreven experimenten). Plaats de injectie elektrode via de micromanipulator in het gebied van belang. </li><li> Injecteer de tracer stof. De injecties uit 2 - 10 drukstoten bij 15 psi gedurende 50 msec elk onder een druk injectie-inrichting, loodrecht gericht in het gebied van belang (ROI) in het gedeelte hersenen. Dien elke drukpuls met tussenpozen van 10 - 15 sec om de kleurstof te verspreiden. </li><li> Bij de tetramethylrhodamine (TRITC) injecties, aanvullend elektrisch stimuleren de kleurstofopname verbeteren door middel van elektroporatie met de elektrode geplaatst in de hersenen interessegebied (MNTB en VNTB in de hier beschreven experimenten). <ol><li> Met 8 TTL pulsen van 8 volt bij 50 msec met 50 msec interpuls intervallen, aangedreven door een stimulator en versterkt tot 55 V met een stimulatie isolatie-eenheid (items nr 7 en 9 in figuur 3B). Gebruik 10-20 herhalingen van dit protocol, administratreerd op enkele minuten 7,8. Zorg ervoor dat de elektrode goed geaard - de aarding draad moet worden aangesloten op het bad oplossing! </li></ol></li><li> Controleer succes van de injectie. Aangezien een fluorescerende tracer met een langere emissiegolflengte zendt ook een fluorescerend signaal na excitatie laser met kortere golflengten, visueel op de kleurstofopname / verspreid in het doelgebied geïnjecteerde tijdens het belichten met de laser en het waarnemen door het filter bril. </li></ol> 4. Incubation <ol><li> Na de injectie, incubeer de brainstems in geoxygeneerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF, NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glucose 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM ascorbinezuur: 0,4 mM myo-inositol: 3 mM pyrodruivenzuur: 2 mM, geborreld met 95% O2 - 5% CO 2) bij kamertemperatuur (RT, 25 ° C) gedurende 1 - 4 uur, terwijlde kleurstof wordt getransporteerd. Bubble de oplossing gedurende de gehele incubatieperiode. </li><li> Vervolgens overdracht van de brainstems in 4% paraformaldehyde (PFA) opgelost in PBS (ca. 100 ml;. PH 7 voor PFA / PBS mix) en incubeer ze bij 4 ° C na fixatie overnacht staan ​​(O / N). </li></ol> 5. Tissue Snijden en Montage <ol><li> De volgende dag was de hersenstam drie keer in PBS (5 min per wasstap), bedekken in 4% agar en vervolgens in 50 - 80 urn dikke plakken op een vibratome. Mount segmenten met een fixeermiddel op een glasplaatje, en dekglaasje. </li><li> Eventueel etiket de secties met fluorescerende Nissl gedurende 25 min (bv blauwe Nissl bij een 1: 100 verdunning in AB media). <ol><li> AB media voor te bereiden, meng 250 ml van 0,2 M fosfaatbuffer (PB; 51 mm KH 2 PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml 5 M NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml DDH 2 O en 5 g runderserumalbumine. </li><li> Precede slagen en de Nissl etikettering stap 3 wasstappen in PBS (10 min elk). </li></ol></li></ol> NB: In gevallen waarin dikkere secties moeten worden gemonteerd en geanalyseerd (in experimenten hier beschreven zoals plakjes waren 100-500 micron dik aan axonale verbindingen over grotere afstanden te behouden), kan de techniek worden gecombineerd met weefsel clearing. We vonden de ClearT2 12 20 succesvol te zijn. Wanneer een weefsel clearing stap is opgenomen, uit te voeren voordat de montage van de secties.

<ol><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+sections+of+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog+and+observations+of+the+alterations+produced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond%22%5BJournal%5D)">Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).</li>
<li>Fink, R. P., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+selective+silver+impregnation+of+degenerating+axons+and+their+synaptic+endings+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system.</a> Brain Res. 4, 369-374 (1967).</li>
<li>Nauta, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+silver+impregnation+of+degenerating+axons+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system.</a> Stain Technol. 27, 175-179 (1952).</li>
<li>Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).</li>
<li>Kristensson, K., Olsson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+retrograde+transport+of+peroxidase+in+hypoglossal+neurons.+Electron+microscopical+localization+in+the+neuronal+perikaryon%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon.</a> Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).</li>
<li>Kristensson, K., Olsson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+axonal+transport+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Retrograde axonal transport of protein.</a> Brain Res. 29, 363-365 (1971).</li>
<li>Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+superior+olivary+nucleus+provides+divergent+inhibitory+input+to+parallel+auditory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways.</a> J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).</li>
<li>Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fenestration+of+the+calyx+of+Held+occurs+sequentially+along+the+tonotopic+axis%2C+is+influenced+by+afferent+activity%2C+and+facilitates+glutamate+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance.</a> J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).</li>
<li>Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextran+amines+used+as+axonal+tracers+in+the+nervous+system+of+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo.</a> J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).</li>
<li>Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugates+of+horseradish+peroxidase+%28HRP%29+with+cholera+toxin+and+wheat+germ+agglutinin+are+superior+to+free+HRP+as+orthograde+transported+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers.</a> Brain Res. 223, 381-385 (1981).</li>
<li>Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horseradish+peroxsidase+%28HRP%29+conjugates+of+cholera+toxin+and+lectins+are+more+sensitive+retrograde+transported+markers+than+free+HRP%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP.</a> Brain Res. 231, 33-50 (1982).</li>
<li>Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+in+the+projections+of+lateral+posterior+thalamus+with+cingulate+and+medial+agranular+cortex+in+relation+to+circuitry+for+directed+attention+and+neglect%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect.</a> Brain Res. 1240, 87-95 (2008).</li>
<li>Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+neuroanatomical+tract-tracing+using+fluorescent+Alexa+Fluor+conjugates+of+cholera+toxin+subunit+B+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats.</a> Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-+from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Zeilhofer, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycinergic+neurons+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein+in+bacterial+artificial+chromosome+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice.</a> J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).</li>
<li>Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glycine+transporter+GLYT2+is+a+reliable+marker+for+glycine-immunoreactive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons.</a> Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li>
<li>Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bac+to+the+future%3A+the+use+of+BAC+transgenic+mice+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).</li>
<li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li>
<li>Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine%3A+comparison+with+the+tracer+PHA-L+in+preparations+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy.</a> J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li>
<li>Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+projections+from+the+ventral+nucleus+of+the+trapezoid+body+to+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse.</a> Front. Neural Circuits. 8, 83(2014).</li>
<li>Benson, D. A., Teas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+unit+of+binaural+interaction+in+the+auditory+cortex+of+the+chinchilla%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla.</a> Brain Res. 103, 313-338 (1976).</li>
<li>Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+pressure+transformations+by+the+head+and+pinnae+of+the+adult+Chinchilla+%28Chinchilla+lanigera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera).</a> Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).</li>
<li>Ryan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+sensitivity+of+the+mongolian+gerbil%2C+Meriones+unguiculatus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acoust.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus.</a> J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li>
<li>Zwicker, E., Fastl, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZwicker%2C+E+%22Psychoacoustics+Facts+and+Models%22">Psychoacoustics Facts and Models</a>. , Springer. (1990).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).</li>
<li>Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+induced+DNA+uptake+by+cells+is+a+fast+process+involving+DNA+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis.</a> Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Slice+Culture+of+E18+Rat+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains.</a> J. Vis. Exp. (6), e235(2007).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Een algemene kracht van in vitro elektroporatie tracer, in tegenstelling tot in vivo opsporen studies, is dat het onderzoekers betere toegang tot de hersenen interessegebied en dus niet duur stereotactische (vaak elektrofysiologische) materiaal omvatten. Bovendien is de overlevingsperiode nodig voor de hersenen explantaten omvat slechts een paar uur (1 - 4) in plaats van dagen of zelfs weken bij in vivo tracer injecties (zie een gedetailleerd overzicht van het gebruik van dextran aminen en and...

Om een ​​bepaalde neuronale (micro) circuit definiëren, moet men beginnen door het vinden van de verschillende deelnemers van de schakeling, en de verbinding patroon. Sinds de publicatie Waller over neurofiber traceren door middel van laesie 1 een grote verscheidenheid van neuroanatomische tracing technieken is vastgesteld. Sommige van deze technieken kunnen in vaste weefsel post mortem 2-4 worden toegepast, andere vertrouwen op het actieve transport van de kleurstof in levende neuronen, zoals ontdekt in 1971 6/5. De laatste kunnen worden onderverdeeld in twee groepen discrimineren tussen verschillende maken van actieve retrograde (van het geïnjecteerde gebied om de bron van een bepaalde projectie, dwz. De somata van neuronen die uitsteken aan genoemde gebied) en actieve anterograde (van de geïnjecteerde gebied om de doelstelling van een bepaalde projectie, dwz. de axonale projecties en de axonale terminals van de gelabelde neuronen) vervoer. Ook in sommige gevallen tracer materiaal wordt geïnjecteerd in levende dieren die vervolgens overleven de injectie van verscheidene dagen of weken (in vivo tracer injecties), terwijl in andere gevallen geëxplanteerde hersenen geïnjecteerd en incubeer gedurende enkele uren na de injectie in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (in vitro tracer injecties) . In dit protocol gewijzigde we een bestaand in vitro elektroporatie techniek 7-8 neuronale somata en processen labelen in anterograde en retrograde tracing experimenten met choleratoxin subunit-b en tetramethylrhodamine dextran als tracing stoffen. De algemene doelstelling van dit protocol is te neurowetenschappers te voorzien van een efficiënt hulpmiddel om neuronale connectiviteit patronen tussen verschillende hersenkernen traceren, terwijl gebruik te maken van beschikbare transgene muis lijnen en eenvoudige optische apparatuur om targeting nauwkeurigheid tijdens tracer injecties te verhogen. Hoewel de werkwijze anterograde en retrograde traceren met behulpcholeratoxin en dextran amine en hun fluorescent gemerkte conjugaten niet nieuw 9-13 (volgens de methode van elektroporatie, bijv. Haas et al. 14), de combinatie van tracer injecties met elektroporatie in een in vitro bereiding met blokken van hersenweefsel is een meer recente ontwikkeling 7. Zijn belangrijkste voordeel ten opzichte neuronale tracing technieken met dezelfde soort tracer kleurstoffen in levende dieren is de toegenomen labeling intensiteit, vanwege de hogere efficiëntie waarmee de geëlektroporeerde kleurstof wordt opgenomen door neuronen. Een bijkomend voordeel is de verkorte incubatietijd (vereist voor de kleurstof transport) en de grotere nauwkeurigheid doel tijdens de tracer injectie, omdat de experimentator visuele controle over het doelgebied van de injectie. Dit laatste betekent tevens dat geen dure stereotactische apparatuur nodig om de kern of hersengebied interessegebied. Om addinaal verhogen targeting nauwkeurigheid, we hebben gebruik gemaakt van een transgene muis lijn, die GFP uitdrukt in zijn glycinergic subpopulatie van neuronen 15 en eenvoudige optische apparatuur, bestaande uit een hand-held laser pointer van 405 nm golflengte en bijpassende banddoorlaatfiltering goggles (450 - 700 nm). Zo behaalden we een aanzienlijke verdere stijging van de doelgerichtheid nauwkeurigheid door de injectieplaats te identificeren door middel van haar fluorescerend signaal en door een fijnere manier om te controleren voor de kleurstof verspreiding in de injectie gebied door middel van de waarneming van de interactie tussen de inheemse GFP-signaal en de tracer fluorescentie. De techniek maakt het ook mogelijk om de functionaliteit van een circuit ontdekken met de connectiviteit door het identificeren van GFP-positieve remmende neuronen (of prikkelende andere muizenlijnen) die waren gevuld met de tracer. Kortom, we verder versterkt een krachtig instrument om de neurowetenschappelijk connectoom van de gewervelde hersenen te bestuderen en te beoordelen thij verschillende neuroanatomische kenmerken van een bepaalde neurocircuit. Met behulp van transgene muizen met goedkope en overal verkrijgbaar optische apparatuur konden we aanzienlijke verhoging van de targeting nauwkeurigheid van onze injecties. Bovendien is de transgene muizen lieten het type getraceerd verbindingen, die hielp blootleggen van de functionaliteit van een remmende microcircuit in de auditieve hersenstam identificeren.

<table><tbody><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Alle chemicaliën zijn van Sigma-Aldrich, tenzij anders aangegeven.</td></tr><tr><td>Kaliumchloride&nbsp;</td><td></td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasic</td><td></td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat di-basis</td><td></td><td>S907</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td></td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td></td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td></td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinezuur</td><td></td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyrovacinaat</td><td></td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td></td><td>A2153</td><td>optioneel, voor aanvullende (immuno)histochemische analyse</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td></td><td>X100</td><td>optioneel, voor aanvullende (immuno)histochemische analyse</td></tr><tr><td>Poly(ethyleenglycol), 8000 MW</td><td></td><td>P2139</td><td>optioneel, voor hersenclearing</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84</td><td>optioneel, voor hersenclearing</td></tr><tr><td>Choleratoxine-subeenheid-b</td><td>Molecular Probes</td><td>C-34776 (Alexa 555)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dextraan tetramethyl-rhodamien</td><td>Molecular Probes</td><td>D-7162 (Alexa 555)</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Nissl</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479 (blauw)</td><td>optioneel</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF93</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbi-tal</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>Fatal-Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaatglasfilamenten</td><td>Harvard Apparatus</td><td>G150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipetpuller</td><td>Zeitz Instruments, Duitsland</td><td>DMZ Universal Puller</td><td></td></tr><tr><td>Perfusieopstelling</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserpointer&nbsp;</td><td>laserpointerpro.com, Hongkong</td><td>HK-88007294 (405 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Filter/veiligheidsbril</td><td>Dragon Lasers, China</td><td>LSG09 (bandpass 450-700 nm)</td><td></td></tr><tr><td>Binoculaire microscoop&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg, Zwitserland</td><td>Wild M3</td><td>Uitgerust met hoogintensiviteitsverlichter (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Instruments</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>PC met geïnstalleerde MC Stimulus software</td><td>Multi Channel Sys-tems, Duitsland (software)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-kanaals stimulator</td><td>Multi Channel Sys-tems, Duitsland</td><td>STG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Stimulatie-isolatie-eenheid</td><td>A.M.P.I., Israël</td><td>Iso-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige, Japan</td><td>YOU-1</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Duitsland</td><td>VT1000S</td><td></td></tr></tbody></table>

lasergestuurde neuronal tracing in brain explantaten

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Wij presenteren een techniek die in vitro tracer injectieprotocol, die gebruik maakt van een reeks elektrische pulsen en druk kleurstof opname in hersenen explantaten met gerichte laserbelichting en bijpassende filter goggles verhogen door elektroporatie tijdens de procedure combineert. De beschreven techniek van in vitro elektroporatie zelf levert relatief goede visuele controle voor het richten bepaalde hersengebieden. Door combinatie met laser excitatie van fluorescerende genetische merkers en hun uitlezing doorgaande band passeren filter bril, die halen de emissies van het genetisch gelabelde cellen / kernen en fluorescerende traceren kleurstof, een onderzoeker in hoofdzaak nauwkeurigheid van injecties vergroten door het vinden van het gebied van de rente en het beheersen van de kleurstof-spread / opname in de injectieplaats veel efficiënter. Bovendien, de laserverlichting techniek kan de functionaliteit van een bepaald neurocircuit van prov bestuderenIDing informatie over het type van neuronen projecteren op een bepaald gebied wanneer het GFP-expressie is gekoppeld aan het type zender door een subpopulatie van neuronen tot expressie.

Figuren 1 en 2 tonen hoe de laser pointer en laser bril kan worden gebruikt om snel en goedkoop genotype GFP positieve dieren uit een nest. In het geval van de jonge muis pups, kan de techniek worden gebruikt om GFP label noninvasively identificeren in de hersenen van het dier door de schedel en de bovenliggende huid (Figuur 1A - D). Uitgezonden fluorescentie kan ten minste tot postnatale dag 3 (Figuur 1C) worden gezien door de huid en de schedel van de muis pups. De pr...

We beschrijven een techniek voor neuronen en hun processen label via anterograde of retrograde tracer injecties in de hersenen kernen met een in vitro bereiding. We pasten een bestaande methode i n vitro tracer elektroporatie door gebruik te maken van fluorescent gelabelde muis mutanten en eenvoudige optische apparatuur om de nauwkeurigheid etikettering te verhogen.

Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Het algemene doel van deze methode is het labelen van neuronen en hun axonale projecties om hun verbindingen met doel- of bronkernen in de hersenen van belang te kunnen volgen. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen in de neurowetenschappen, zoals connectiviteitspatronen tussen verschillende gebieden of neuronale subpopulaties van de hersenen, evenals hun functionele betekenis voor een specifiek neuraal circuit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de verhoogde doelwalsenauwkeurigheid tijdens de injecties van de tracer.Dit wordt bereikt door basisoptische apparatuur te gebruiken om fluorescent gelabelde hersenkernen te visualiseren. Een ander voordeel van deze methode is dat het niet-invasieve genotypering mogelijk maakt van muizenpups die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen onder controle van neuronale promotors. Controleer bij het genotyperen van pups de expressie van de respectievelijke fluorescerende markers met een laserpointer met de juiste excitatiegolflengte.Draag tegelijkertijd filterbrillen die de excitatiegolflengte blokkeren, maar de emissiegolflengte doorlaten. Richt de laser op de achterkant van de kop of het ruggenmerg van de betr

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video beschrijft de manipulatie van gekweekte neuronen met behulp van laser-pincet in vitro.

Met behulp van Laser pincet voor het manipuleren van geïsoleerde neuronen in vitro

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Neurale Explantatie Culturen van<em&gt; Xenopus laevis</em

Source: Muto, A., et al. Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (2018) In this video, a two-photon laser ablation procedure is demonstrated, enabling the selective destruction of fluorescent neurons in agarose-immobilized zebrafish larvae. High-resolution imaging before and after the procedure confirms efficient neuronal damage, as observed by the absence of fluorescence.

Targeted Neuronal Ablation Using Two-Photon Microscopy in a Zebrafish Larava

Menselijke neuroprogenitor cellen (NPC) werden uitgebreid onder uitdijende omstandigheden. NPCs werden gedifferentieerd in neuron-rijke culturen in aanwezigheid van een combinatie van neurotrofinen. Neuronale merkers werden gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring. Om een ​​zuivere populatie van neuronen te isoleren, werden NPCs gedifferentieerd PEN membraan glijbanen en lasermicrodissectie werd uitgevoerd.

Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur

We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.

Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

Twee-foton beeldvorming, gekoppeld aan laser nanodissection, zijn nuttige hulpmiddelen om degeneratieve en regeneratieve processen te bestuderen in het centrale zenuwstelsel met subcellulaire resolutie. Dit protocol laat zien hoe u een label, afbeelding en ontleden enkele klimmen vezels in de cerebellaire schors in vivo.

Laser nanosurgery van Cerebellar Axonen<em&gt; In Vivo</em

Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Dit protocol beschrijft een reeks methoden voor het identificeren van de cel-type specifieke functionele connectiviteit van lange-bereik ingangen van verre hersengebieden met behulp van optogenetische stimulaties in ex vivo hersenen segmenten.

In vivo intracerebrale Stereotaxic injecties voor Optogenetische stimulatie van lange-afstand ingangen in muis hersenen segmenten

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

We beschrijven de intraparenchymale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen getransduceerd met een dual reporter vector die luciferase-groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen van muizen tot expressie brengt. Na transplantatie wordt het luciferasesignaal herhaaldelijk gemeten met behulp van in vivo bioluminescentie en GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd in hersensecties met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis

Leer hoe u neuronen en axonale projecties labelt in hersenexplantaten met laser-geleide tracerinjecties. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van neurale circuitstudies in muizen.

Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

Meer video's verkennen