3 januari 2016
Verzadigbare en omgekeerde verzadigingsverstrooiing werden ontdekt in geïsoleerde plasmonische deeltjes en toegepast als een nieuwe niet-blekende contrastmethode in superresolutiemicroscopie. Hier worden de experimentele procedures voor het detecteren en extraheren van niet-lineaire verstrooiing in detail uitgelegd, evenals hoe de resolutie kan worden verbeterd met behulp van verzadigd excimitatiemicroscopie.
Het algemene doel van dit experiment is om resolutieverbetering aan te tonen met niet-lineaire verstrooiing van plasmonische nanostructuren. In het veld van optische microscopie zijn contrast en resolutie de belangrijkste factoren. Onze techniek breidt zich uit naar het superresolutiegebied met de nieuwe op contrast gebaseerde verstrooiing.
Het grote voordeel van deze techniek is dat verstrooiing van nanodeeltjes sterk, zeer niet-lineair en niet-blekend is. De procedure zal worden gedemonstreerd door Hsuan Lee. Een gevorderde student uit mijn lab.
Het experiment zal worden uitgevoerd op een optische werkbank. Waar er een microscoop en twee laserbronnen zijn. De eerste laserbron is een 532 nanometer continue golflaser die wordt gebruikt voor beeldvorming.
De tweede is een supercontinuumlaser die wordt gebruikt voor spectroscopiemetingen. Dit is een schematische weergave van de basisopstelling voor zowel beeldvorming als spectroscopie. Monsters worden gemonteerd op een piëzo-elektrische positioneringsstandaard in de confocale microscoop.
Licht van de 532 nanometerlaser passeert een neutraal dichtheidsfilter. De bundel wordt door een beam splitter geleid naar galvano-spiegels die rasterscannen in het brandpuntsvlak van het objectief van de confocale microscoop bieden. Het achterwaarts verstrooide licht wordt verzameld door het objectief en op de detector gefocusseerd.
Begin met het uitlijnen van de witte lichtverlichtingsbaan van de microscoop. Gebruik de halogeenlichtbron onder curlerverlichting. Om de uitlijning van de interne iris te verifiëren, moet u scherpe randen op het achthoekige zien via het oculair of CCD.
Gebruik vervolgens een stuk papier om de externe lichtbaan te controleren. Verifieer dat de bundels gedeeltelijk worden gereflecteerd door de beam splitter en naar de laser bewegen door het papier langs de lichtbaan te verplaatsen. Heeft nu papierdoelen klaar om verdere uitlijning te helpen.
De doelen moeten op dun papier met concentrische ringen zijn. Plaats deze doelen langs de straalweg zodat ze zijn uitgelijnd met de halogeenstraal. Hier is een doel op de achterste opening van het objectieflens gepositioneerd.
Dit is een andere doel in positie langs de optische baan. Schakel vervolgens de 532 nanometerlaser in die voor beeldvorming wordt gebruikt om deze uit te lijnen. Gebruik de papierdoelen om te helpen bij het collimateren van het invallende laserlicht tegenover de halogeenstraal.
Ga verder met fijnere uitlijning van de laserstraal voordat u de doelen verwijdert en verdergaat. Na het uitlijnen van de laser, haal een voorbereid gouden nanosfeermonster voor het experiment. Dit monster heeft gouden nanodeeltjes van 80 nanometer in olie.
Het mengsel wordt verzegeld tussen twee glazen platen. Ga verder door het monster op de microscoopstandaard te monteren en objectiefolië toe te voegen. Klaar nu het detectiesysteem voor beeldvorming.
Verzamel het verstrooide licht met de fotomultiplierbuis aan het einde van de optische baan. Terug langs de straalweg, heb een 20 micrometer diameter pinhole om verstrooid licht buiten focus uit de fotomultiplierbuis te blokkeren. Ga verder met beeldvorming door de galvano-spiegels en de fotomultiplier in te schakelen.
Observeer de computermonitor om het terugscannersignaal van de gouden nanodeeltjes te zien. Maximaliseer het terugscannersignaal door de pinholepositie en de hoogte van de monsterstandaard aan te passen. Na het uitlijnen van de confocale microscoop, karakteriseer de verstrooiingsniet-lineariteit van het monster.
Om dit te doen, gebruik eerst een vermogensmeter om het laservermogen na de objectieflens te meten. De lezing moet minder zijn dan 10 microwatts wat overeenkomt met een excitatie-intensiteit van minder dan 10 tot de vierde watt per centimeter vierkant. Verwerf vervolgens een afbeelding van de gouden nanodeeltjes met behulp van de fotomultiplierbuis.
Open de vastgelegde afbeelding in afbeeldingsanalysesoftware om het verstrooiingsintensiteitsprofiel te karakteriseren. Selecteer een gouden nanodesel tussen degenen in de afbeelding en teken een lijn erdoorheen. Volg vervolgens de stappen die in de software vereist zijn om het verstrooiingsprofiel te verkrijgen.
Pas het profiel aan een gaussiaan aan wat een verdere controle op de uitlijning van het beeldvormingssysteem mogelijk maakt. Begin nu systematisch te scannen door de excitatie-intensiteiten. Verander eerst de neutrale dichtheidsfilter om de excitatie-intensiteit te verhogen.
Bepaal de nieuwe excitatie-intensiteit en noteer het terugverstrooiingsbeeld op het nieuwe intensiteitsniveau. Gebruik het beeld om een verstrooiingsprofiel van een nanodesel te extraheren zoals voorheen. Plot het verstrooiingsprofiel en identificeer de waarde ervan in het centrum van de bol als het verstrooiingssignaal.
Herhaal deze stappen meerdere keren om een plot van het verstrooiingssignaal versus excitatie-intensiteit te bouwen. In deze figuur vertegenwoordigen de blauwe punten gegevens. De rode lijn is een polynoomfit.
Er is een lineaire relatie tussen het verstrooiingssignaal en lage waarden van de excitatie-energie. De daling onder deze lineaire relatie geeft aan dat verzadiging heeft plaatsgevonden. De volgende stap is om spectroscopie uit te voeren op een enkele gouden nanodeeltje.
Deze schematische weergave geeft een overzicht van de opstelling. Gebruik een supercontinuumlaserbron met een golflengtebereik van 450-1750 nanometer. Gebruik ook een breedband 50/50 beamsplitter om spectrale dekking over het zichtbare spectrum te garanderen.
Plaats een flipspiegel voor de fotomultiplierbuis om het licht naar de spectrometer te leiden. Die is uitgerust met een lading-gekoppeld apparaat. De supercontinuumlaser moet worden uitgelijnd volgens dezelfde procedure als de 532 nanometerlaser.
Neem bij de uitgang van de supercontinuumlaser enkele voorzorgsmaatregelen om overtollig infraroodvermogen uit het systeem te verwijderen. Plaats zichtbaar licht reflecterende spiegels in de optische baan direct na de laseruitgang, voordat u de bundel naar de microscoop stuurt. Gebruik in combinatie met de spiegels beam dumps om de infraroodstraling te verzamelen die het systeem kan beschadigen.
Met de uitgelijnde laser, verwerf een afbeelding
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Deze studie onderzoekt de resolutieverhoging in optische microscopie via niet-lineaire verstrooiing door plasmonische nanostructuren. De techniek maakt gebruik van sterke, zeer niet-lineaire en niet-blekende verstrooiing door nanodeeltjes om het contrast en de resolutie te verbeteren.
Nietlineaire verstrooiing vanuit plasmonische nanostructuren maakt resolutieverhoging in optische microscopie mogelijk zonder fotobleking, waarmee een belangrijke beperking bij live-cell en longitudinale beeldvorming wordt weggenomen. Deze benadering biedt een contrastmechanisme dat niet bleekt en dat voorspellend vertrouwen in doelwitvalidatie ondersteunt door herhaalde metingen van biologische structuren over een bepaalde tijd mogelijk te maken. De afhankelijkheid van de techniek van gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie (LSPR) biedt een weg naar mechanische risicoreductie bij de ontwikkeling van assays via intensiteitsafhankelijke signaalmodulatie.
De methode past binnen het continuüm van ontdekking, van vroege targetvalidatie tot preklinische evaluatie, waarbij niet-lineaire verstrooiing dient als een stabiele, kwantificeerbare readout voor studies naar het werkingsmechanisme en de optimalisatie van probes.