Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip

Het algemene doel van dit microfluïdische experiment is om de effecten van kinase-remmers op de migratie van tumorcellen onder een direct elektrisch veld te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in cellulair electrotaxis-onderzoek, zoals wat de bepalende pathways zijn bij de door een elektrisch veld gestuurde migratie van kankercellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een zeer reproduceerbare en tijdsefficiënte electrotaxis-studie is die eenvoudig kan worden geïmplementeerd.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van het metastatisch potentieel van kanker. Aangezien de mobiliteit van magnetische kankercellen kan worden versterkt door een elektrisch veld, kan deze methode inzicht bieden in de intracellulaire elektrische eigenschappen van tumorcellen.

Het kan ook worden toegepast op huidregeneratieprocessen, zoals wondgenezing. Begin met het gebruik van een teken- en ontwerpprogramma om een patroon voor een individuele acryllayer te tekenen. Sla het patroon op en zet vervolgens de lasersnijder aan.

Verbind de graveerunit met de besturingslaptop en klik op het ontworpen patroonbestand om het patroon voor de acryllaag te openen. Plaats vervolgens een stuk blanco acrylplaat op de x, Y, Z-tafel van de laserscribeerunit en gebruik de bijbehorende automatische uitlijningsstok van de laserscribeerunit om de focus van de laserstraal op het oppervlak van de plaat in te stellen.

Stuur het ontworpen patroon naar de lasersnijder voor de directe bewerking van de acrylplaat. Gebruik vervolgens een pincet om het beschermpapier van de acrylplaten te verwijderen en blaas de oppervlakken schoon met stikstofgas. Stapel de platen nu op en bond ze aan elkaar in een thermische bonder onder een druk van 2 kg/cm² gedurende 45 minuten bij 110 °C om de assemblage van het elektrische stimulatiekanaal voor de vloeistof te vormen.

Nadat dubbelzijdige tape op dezelfde wijze is voorbereid, wordt het schone dekglas op de assemblage van het flow-elektrische stimulatiekanaal geplakt. Gebruik vervolgens secondelijm om 13 acryl adapters te bevestigen aan de afzonderlijke openingen in laag één van de multi-channel dual electric field of MDF-chipassemblage om het zoutbrugnetwerk van de MDF-chip op te stellen. Begin met het verbinden van plastic vloerslangen met de MDF-chipassemblage via de adapters van de mediuminlaat en -uitlaat.

Sluit vervolgens de luer-taps van de middelste inlaat- en uitlaatplastic buisjes aan op driewegkranen. Bevestig een spuit van 3 ml met 2,5 ml CO₂-geëquilibreerde PBS aan de driewegkraan van het inlaatplastic buisje en een lege spuit van 3 ml aan de driewegkraan van het uitlaatplastic buisje. Gebruik witte, solide handvast aandraaibare moeren om de openingen van de blauwe en groene adapters op de acrylplaat van laag één af te dichten. Vul vervolgens de zoutbrugkanalen en kweekkamers met de CO₂-geëquilibreerde PBS, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen ontstaan.

Plaats de chip overnacht in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide, zodat de opgeloste lucht in de dubbelzijdige tape de volgende ochtend bellen kan vormen in de kamers. Gebruik de twee spuiten om een snelle PBS-stroom te genereren om de bellen weg te spoelen, waarbij de PBS indien nodig heen en weer wordt gepompt. Wanneer alle bellen zijn verwijderd, gebruik dan de driewegkraan die is verbonden met de uitlaatbuis voor het medium om de PBS uit de kanalen af te voeren.

Vervang vervolgens de spuit die aan de inlaat is verbonden door een spuit van 3 mL met 2,5 mL CO₂-geëquilibreerde DMEM en vul de kamers opnieuw met het medium zodra deze vol zijn. Verwijder de vaste moeren van de groene adapters en injecteer 3% agarose, verhit tot ten minste 70 °C, in het zoutbrugkanaal. Via de openingen in de adapters bereidt de hete agarose de zoutbrug voor op injectie, waarbij wordt gewaarborgd dat de mediumrij tussen de cultivatiekamers wordt geblokkeerd.

Stop met het injecteren van de agros wanneer de verbinding driekwart van de lengte van het zoutbrugkanaal vult en sluit de poriën opnieuw af met de massieve moeren. Vervang nu de massieve moeren op de blauwe adapters door doorschijnende tubulaire vingerstrakke moeren en vul de tubulaire moeren met aros. Bedrijf vervolgens zilver-zilverchloride-elektroden in de tubulaire moeren voordat de aro stolt.

Om een elektrotactisch experiment op te zetten, injecteert u 0,3 milliliters cellen in de MDF-chip via de uitlaatleiding en plaatst u de chip terug in de celkweekincubator. Na twee tot vier uur installeert u het MDF-microfluidische systeem op een transparante indiumtinoxide-glasverwarmer en bevestigt u een K-type thermokoppel tussen de MDF-chip en het indiumtinoxide-glas. Om de temperatuur van de chip te meten, gebruikt u een proportionele-integrale-afgeleide controller om de incubatietemperatuur van het MDF-microfluidische systeem in te stellen op 37 degree Celsius en monteert u de temperatuurgecontroleerde MDF-chipassemblage op de computergestuurde XYZ-gemotoriseerde tafel van een omgekeerde microscoop.

Dispense vervolgens met een spuitenpomp met vier kanalen volledig medium in de kweekkamers via de inlaatopeningen met een stroomsnelheid van 20 µL per uur. Verzamel het kweekafval uit de uitlaatopeningen in microcentrifugebuisjes. Incubeer de cellen nog 16 tot 18 uur bij 37 °C.

Vervang de volgende dag het medium in elke kamer door vers medium, aangevuld met de juiste concentratie kinase-remmer voor een behandeling van 60 minuten. Sluit vervolgens een DC-voeding serieel aan op de MDF-chip via de zilver/zilverchloride-elektroden. Sluit een ampèremeter aan op het elektrische circuit om de elektrische stroom in de MDF-chip te bewaken.

Zet tot slot de voeding aan en stel de spanning in op tussen 15 en 19 volt. Stel de stroom van de ampèremeter in op 86,94 microamps. In dit representatieve experiment met het MDF Microfluidic-systeem werden longkankercellen behandeld met verschillende concentraties van de kinase-remmer.

Y 2 7 6 3 2 vertoonde geen veranderingen in de migratiesnelheid van de cellen met of zonder elektrische stimulatie. Echter, behandeling met Y 2 7 6 3 2 onder toevoeging van een elektrisch veld verminderde de nautische beweging van de kankercelmigratie significant. Inderdaad, bij een concentratie van 50 micromolar elimineerde de rock-remmer de nautische beweging van de cellen volledig zonder hun migratiesnelheid te beïnvloeden.

Bovendien was er een dosisafhankelijke correlatie tussen de toegepaste chemische concentraties en de directionaliteitsindex, wat de betrouwbaarheid en efficiëntie van het MDF-microfluïdische systeem als methode voor het bestuderen van axonen bevestigt. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in zeven tot acht uur worden voltooid als deze na de ontwikkeling correct wordt uitgevoerd. Deze techniek biedt onderzoekers in het veld van elektro-taxen de mogelijkheid om doorbraken te realiseren in de huid.

Vergeet niet dat het werken met een laserscraper uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen genomen moeten worden bij het uitvoeren van deze procedure.