Name: Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Leer hoe je elektrotaxis van longkankercellen bestudeert met een microfluïdische chip met dubbel elektrisch veld. Deze methode helpt bij het evalueren van kinaseremmers en het begrijpen van migratiemechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt financieel ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (Contractnr. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) en het Onderzoeksprogramma over Nanowetenschap en Nanotechnologie, Academia Sinica, Taiwan.

1. Ontwerp en fabricatie van de MDF-Chip <ol><li> Teken een individuele acryllaag patroon met behulp van commerciële software, zoals AutoCAD, en sla het patroon. <ol><li> Geef je mening over het ontwerp van de vier lagen acryl plaat patroon in figuur 1A en bevestig de tussenlaag verbindingen. </li></ol></li><li> Fabriceren alle acrylplaten en de dubbelzijdige tape met behulp van laser ablatie met een CO2-laser kraspen (figuren 1B, 2A en 2B). 16 <ol><li> Zet de laser kraspen en sluit de machine aan het beheersen van de laptop. </li><li> Voer de commerciële software en open de patroon ontworpen in stap 1.1 door te klikken op &quot;ontworpen patroon bestand.&quot; </li><li> Leg een stuk blanco acryl plaat of dubbelzijdig tape op de XYZ stadium van de laser kraspen. </li><li> Stel de focus van de laserstraal op het oppervlak van de acrylplaat of dubbelzijdig plakband met een auto-alignment stok die door de fabrikant van de laser kraspen. </li><li> Stuur het ontworpen patroon om de laser kraspen voor directe bewerking van de acryl plaat of dubbelzijdig tape. </li></ol></li><li> Verwijder het beschermende papier uit de acrylplaten behulp van een tang en blaas het oppervlak schoon met stikstofgas. </li><li> Stapel de acrylplaten en hechten ze samen onder een druk van 2 kg / cm 2 in een thermische bonder gedurende 45 minuten bij 110 ° C om de stroom / elektrische stimulatiekanaal samenstel. </li><li> Bereid de microscoop dekglas als de celkweek substraat in de chip. <ol><li> Plaats het deksel glas in een kleuring pot en vul de pot met een tienvoudige verdunning van het wasmiddel in het materiaal lijst vermeld. </li><li> Plaats het deksel glas en vlekken pot in een ultrasoon Steri-reiniger en reinig het deksel glas voor 15 min. </li><li> Giet de verdunde reinigingsmiddel uit de vlekken pot, vul de pot met gedestilleerd water, en herhaal stap 1.5.2 3 keer. </li><li> Droog de gereinigde dekking van glas door te blazen met stikstofgas voor het naleven naar de dubbelzijdige tape. </li></ol></li><li> Hechten de gereinigde dekking van glas om de stroom / elektrische stimulatie kanaal montage met dubbelzijdige tape patroon in stap 1.2. </li><li> Houden 13 stuks van acryl adapters aan de individuele openingen in Laag 1 van de MDF-chip assemblage met superlijm. De MDF chip assemblage is dan voltooid (figuur 2D). </li><li> Steriliseer totale MDF chipeenheid met 30 min UV bestraling vóór gebruik. </li></ol> 2. Instellen van de Salt Bridge Network van de MDF-Chip <ol><li> Voor gebruik steriliseren alle kunststofbuizen handvast noten en microcentrifugebuizen figuur 3B door een houdtijd van 15 minuten bij 121 ° C in de autoclaaf. </li><li> Sluit de fluorkunststof buizen (figuur 3B-i) aan de MDF-chip assemblage via het medium inlaaten uitlaat adapters weergegeven in figuur 1A. </li><li> Sluit de Luer versmalling van het medium en uitlaat kunststofbuizen in figuur 3B-i om de 3-weg kranen. </li><li> Neem 2,5 ml van CO 2 -equilibrated fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een spuit 3 ml en sluit de spuit aan de 3-weg kraan van de inlaat kunststofbuis. Sluit een lege 3 ml spuit om de 3-weg kraan van de uitlaat kunststofbuis. De twee spuiten zijn dus met elkaar verbonden via de MDF chip. OPMERKING: Incubeer de PBS in de 37 ° C 5% CO 2 celkweek incubator O / N te verkrijgen CO 2 -equilibrated PBS. </li><li> Dicht de openingen van de blauwe en groene adapters (figuur 1A) op de laag 1 PMMA plaat met witte vaste hand vast moeren (figuur 3B-iii). </li><li> Vul het zout brug kanalen en cultuur kamers met de CO 2 -equilibrated PBS in de in de setup stap 2.4 beschreven spuit. Vermijdenblaasvorming. </li><li> Vervolgens zet de CO 2 -equilibrated PBS-bevattende MDF chip in de 37 ° C 5% CO 2 celkweek incubator voor O / N incubatie. Hierdoor kan de opgeloste lucht in de dubbelzijdige tape om bellen in de kamers te vormen. </li><li> Wegspoelen de bubbels in de kanalen door een snelle PBS stroming in het kanaal met behulp van de twee spuiten. Pomp de PBS heen en weer, indien nodig. </li><li> Laat de PBS in de kanalen via de 3-weg kraan aangesloten op het medium afvoerbuis. </li><li> Met een nieuwe 3-ml injectiespuit, neem 2,5 ml van CO 2 -equilibrated Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (zie stap 3,5) en plaats de spuit verbonden met de inlaat door de nieuwe. Vul de kanalen met het medium. </li><li> Bereiding van het zout brug netwerk. <ol><li> Tijdelijk verwijdert de vaste moeren (figuur 3B-iii) op de groene adapters (figuur 1A) en injecteer 3% heet (&gt; 70 ° C) agarose in de zoute bridge kanaal door de opening in de groene adapters (Figuur 1A). OPMERKING: Bereiding van hete agarose: Los 1,5 g agarose poeder in 50 ml PBS. Steriliseren door een houdtijd van 20 minuten bij 121 ° C in de autoclaaf. </li><li> Stoppen met het injecteren van de agarose als de vloeistof vult driekwart van de lengte van het zout brug kanaal. </li><li> Dicht de poriën op de groene adapters (figuur 1A) door schroeven de vaste moeren (figuur 3B-iii) na agarose injectie. </li><li> Vervang de vaste moeren aan de blauwe adapters (Figuur 1A) met de doorschijnende buisvormige handvast moeren (Figuur 3B). </li><li> Laad de 3% agarose voorverwarmd in de buisvormige moeren (figuur 3B-iv). </li><li> Ag / AgCl-elektroden (figuur 3B-v) in de buisvormige moeren (figuur 3B-iv) voor het insluitenstollen van de agar. </li></ol></li><li> Na het voltooien van de installatie van het zout brug netwerk, injecteer de CL1-5 longkanker-cellen in de cultuur kamers, één kamer per keer. </li></ol> 3. Voorbereiding van kankercellen en Set Up voor Electrotactic Experiment <ol><li> Regelmatige cultuur van longkanker cellijn CL1-5. <ol><li> De cultuur van de CL1-5 longkankercellen, verkregen van Prof. Pan-Chyr Yang, 17 in het compleet medium in een 75T celkweek kolf bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Het volledige medium bestaat uit DMEM en 10% foetaal runderserum (FBS). Subcultuur de cellen elke 3 tot 4 dagen. De gebruikte cellen voor het uitvoeren van experimenten electrotaxis minder dan 25 passages van de oorspronkelijke bron. </li></ol></li><li> Voeg 2 ml van 0,25% trypsine buffer om de exponentieel groeiende CL1-5 cellen en incubeer gedurende 2 min in 37 ° C 5% CO 2 celkweek incubator voor mobiele detachment. </li><li> Sluit de onthechting proces met 6 ml van 10% FBS DMEM en centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min bij RT. Gooi dan het medium op te schorten en de celpellet met 5 ml PBS. </li><li> Tel het aantal cellen in PBS. Bekijk dan 1 x 10 6 cellen en centrifugeer bij 300 g gedurende 5 min bij RT. </li><li> Gooi de PBS. Suspendeer de cellen met voorverwarmd CO 2 -equilibrated DMEM en pas de celdichtheid worden 1 x 10 6 cellen / ml. OPMERKING: Incubeer de compleet medium in de 37 ° C 5% CO 2 celkweek incubator O / N om het CO 2 te verkrijgen -equilibrated DMEM. </li></ol> 4. Stel voor Electrotactic Experiment <ol><li> Vanaf de uitlaat van de MDF chip, injecteer 0,3 ml, 1 x 10 6 / ml, van de cellen in de chip. </li><li> Incubeer de cel geplaatste MDF chip in de celkweek incubator (vastgesteld op 37 ° C en 5% CO2) gedurende 2-4 uur. </li><li> Setup van MDF microvloeibare systeem. <ol><li> Installeer de MDF microfluïdische systeem op een transparante glas indiumtinoxide (ITO) verwarming. Meet de temperatuur van de chip MDF met een type K thermokoppel geklemd tussen de MDF chip en de ITO glas. De controle van de ITO verwarming met een proportionele-integrale-afgeleide (PID) regelaar. Stel de MDF microfluïdische systeem incubatietemperatuur tot 37 ° C met de PID controller. LET OP: De fabricage van de ITO kachel en de opzet van de celkweek verwarmingsinstallatie worden beschreven in eerdere verslagen 18,19. </li><li> Monteer de temperatuurgeregelde MDF chipeenheid de computergestuurde XYZ gemotoriseerde stadium een ​​omgekeerde microscoop. Het gebruik van de gemotoriseerde fase wordt beschreven in stap 5,1. Pomp de compleet medium in de cultuur kamers door het inlaten met een vier-kanaals injectiepomp. </li></ol></li><li> Pomp het volledige medium in de MDF chip met een stroomsnelheid van 20 pl / uur. De cultuur afval van delaat wordt opgevangen in de microcentrifugebuizen (weergegeven als &quot;afval&quot; in figuur 3A). </li><li> Incubeer de cellen gedurende nog 16-18 uur bij 37 ° C in de MDF chip. </li><li> Om het medium vervangen, pomp het medium bevattende 50, 25, 5 en 0 uM kinase inhibitor, respectievelijk in elk kweekkamer bij een stroomsnelheid van 20 pl / min gedurende 10 min. OPMERKING: Bereid een 10 mM voorraadoplossing van de Rho-geassocieerde proteïne kinase inhibitor Y27632 door toevoeging van 3 ml steriel water om de 10,6 mg kinase remmer. Verdun de 10 mM voorraadoplossing tot 50, 25 en 5 uM, respectievelijk via 10% FBS DMEM medium. </li><li> Incubeer de cellen in het kinase remmer nog eens 60 min bij 37 ° C. Stel het medium debiet 20 ul / uur. Gebruik dezelfde cultuur temperatuur en stroomsnelheid hierboven in latere stappen. </li><li> Gebruik elektrische draden van een DC voeding aan te sluiten op de MDF chip via de Ag / AgCl elektroden op de chip. </li><li> Serieel sluit een ampèremeter in het elektrische circuit. Gebruik de ampèremeter om de elektrische stroom in de MDF chip te controleren. </li><li> Schakel de DC-voeding en stel de ampèremeter stroom 86,94 uA door aanpassing van de voedingsspanning tot tussen 15 en 19 V. OPMERKING: Gezien de wet van Ohm, E = I / (σA eff), waarin I de elektrische stroom die door het stortgoed, dat wil zeggen het kweekmedium in de electrotactic kamer, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) de geleidbaarheid van het kweekmedium, A eff (= 0,21 mm 2 voor een 3 mm breed x 0,07 mm hoogte) is de effectieve doorsnede van de electrotactic kamer en de elektrische stroom (I) vereist om een 300 mV / mm genereren EF in de MDF-chip is 86,94 uA. </li></ol> 5. Verwerving en Analyse van de Cel Afbeeldingen <ol><li> Controle van de gemotoriseerde fase met behulp van een MATLAB GUI-programma. Met het MDF microfluïdische gemonteerd op de Micrpe, bewegen de chip naar de observatie regio&#39;s met behulp van de gemotoriseerde podium. </li><li> Record cel beelden met behulp van een digitale single-lens reflex (SLR) camera gemonteerd op de microscoop. </li><li> Neem microscopische beelden met een 4x objectief met tussenpozen van 15 min gedurende 2 uur. </li><li> Celmigratie analyse. <ol><li> Run NIH ImageJ 1,47 V. </li><li> Analyseer de afstand van de eerste naar de laatste positie van het zwaartepunt van de cel. </li><li> Ga naar &quot;Bestand&quot; → &quot;Import&quot; → &quot;Afbeelding Sequence &#39;en importeren negen beelden voor celmigratie analyse. Het eerste beeld is het resultaat nul tijd, en het laatste beeld is het resultaat van 120 min. </li><li> Ga naar &quot;Analyseren&quot; → &quot;Metingen&quot; en vink het vakje naast &quot;Zwaartepunt&quot; </li><li> Klik op het icoon &quot;Freehand Selecties&quot;. </li><li> Tonen de rand van de geselecteerde cellen in het eerste beeld. </li><li> Ga naar &quot;Edit&quot; → </em&gt; &quot;Selection&quot; → &quot;Aan Manager&quot; </li><li> Naar het negende afbeelding en tonen de rand van dezelfde cellen geselecteerd op de eerste afbeelding. De cel posities kunnen worden opgespoord met behulp van de tweede naar de achtste beelden. </li><li> Ga naar &quot;Edit&quot; → &quot;Selection&quot; → &quot;Aan Manager&quot; </li><li> Herhaal de stappen 5.4.5 tot 5.4.9 gegevens van 90 tot 100 cellen te verzamelen. </li><li> Ga naar &quot;Analyze&quot; → &quot;Measure&quot; het resultaat van de begin- en eindposities van de geselecteerde cellen te verkrijgen. OPMERKING: De migratie snelheid wordt gedefinieerd als de gemiddelde cel beweging lengte per uur. De gerichtheid wordt gedefinieerd als cosinus, waarbij de hoek tussen de vector van de dcEF (van anode naar kathode) en de vector van het startpunt van een cel zijn eindpositie. De gerichtheid is -1 op cellen migreren naar de anode en 1 op cellen migreren naar de kathode. Voor een groep van willekeurig miraspen cellen, de gerichtheid 0. 2 </li></ol></li></ol>

<ol><li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+movement+of+rat+prostate+cancer+cells+in+direct-current+electric+field%3A+involvement+of+voltagegated+Na%2B+channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity.</a> J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).</li>
<li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+receptor+signaling+is+essential+for+electric-field-directed+migration+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells.</a> J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).</li>
<li>Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li>
<li>Huang, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+human+lung+cancer+cell+line+CL1-5+in+response+to+a+direct+current+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field.</a> PLoS One. 6, e25928(2011).</li>
<li>Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+ordered+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds.</a> Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).</li>
<li>Tsai, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+EGFR+and+RTK+signaling+in+the+electrotaxis+of+lung+adenocarcinoma+cells+under+direct-current+electric+field+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation.</a> PLoS One. 8, e73418(2013).</li>
<li>Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+chemical+and+electrical+stimulation+on+lung+cancer+cells+using+a+multichannel-dual-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip.</a> Biomicrofluidics. 8, (2014).</li>
<li>Faupel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electropotential+evaluation+as+a+new+technique+for+diagnosing+breast+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions.</a> Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).</li>
<li>Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+rat+prostate+gland+in+vitro%3A+identified+single-cell+and+transepithelial+%28lumen%29+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials.</a> BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).</li>
<li>McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+dimensions+in+cell+science%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrical dimensions in cell science.</a> J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).</li>
<li>Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on-chip%3A+shear+deformation+of+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells.</a> Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).</li>
<li>Lin, F., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+chemotaxis+in+a+simple+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">T cell chemotaxis in a simple microfluidic device.</a> Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).</li>
<li>Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+studying+cell+migration+in+single+or+co-existing+chemical+gradients+and+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields.</a> Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).</li>
<li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6, 34116(2012).</li>
<li>Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-write+laser+micromachining+and+universal+surface+modification+of+PMMA+for+device+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).</li>
<li>Chu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+invasive+and+metastatic+subpopulations+from+a+human+lung+adenocarcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).</li>
<li>Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+cell-culture+microchamber+with+a+variably+controlled+concentration+gradient+generator+and+flow+field+rectifier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier.</a> Biomicrofluidics. 2, 24105(2008).</li>
<li>Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITO+patterning+by+a+low+power+Q-switched+green+laser+and+its+use+in+the+fabrication+of+a+transparent+flow+meter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316(2007).</li>
<li>Pu, J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+polarization+in+a+strong+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Golgi polarization in a strong electric field.</a> J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).</li>
<li>Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+directly+induces+pre-angiogenic+responses+in+vascular+endothelial+cells+by+signaling+through+VEGF+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors.</a> J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).</li>
<li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

We vonden dat het proces van hechtende acryl adapters op Laag 1 van de MDF-chip lastig te zijn. De toepassing van slechts 1 tot 2 pl superlijm voldoende stevig hechten van de adapter op de MDF chip. Grotere hoeveelheden lijm leidde tot een onvolledige polymerisatie van superlijm en niet hechten. Zodra het acryl adapters stevig werden vastgehouden op de MDF-chip, vloeistof lekkage in de microfluïdische systeem zelden voorgekomen. Daarnaast, O / N incubatie in de vacuümkamer hielp om de lucht gevangen tussen de dubbelzijd...

Het gedrag van hechtende cellen bewegen naar een anode en kathode onder een gelijkstroom elektrisch veld (dcEF) wordt genoemd electrotaxis. De electrotactic gedrag van cellen speelt een belangrijke rol bij embryogenese, zenuwregeneratie en wondgenezing. 1 Tumorcellen zoals ratten prostaatkankercellen, borstkankercellen 2, 3 en longadenocarcinoom cellen 4-8 gebleken electrotactic beweging onder een aangebrachte dcEF . De fysiologische EF is gemeten klier weefsels. 9,10 Electrotaxis is ook gerapporteerd in klier-geassocieerde tumorcellen. 2,3 genomen samen de electrotaxis van kankercellen wordt beschouwd als een metastase factor. 11 beheersen van de elektrische leiding van kankercellen onder dcEF kan een potentiële benadering voor de toekomstige behandeling van kanker. Echter, vandaag de gedetailleerde moleculaire mechanisme van electrotaxis blijft controversieel. Daarom is een onderzoek naar de influence van elektrische stimulatie op kankercel migratie kan de ontwikkeling van strategieën voor de behandeling van kanker te vergemakkelijken. Recent zijn bio-microfluïdische inrichtingen vervaardigd voor het bestuderen van cellulaire reacties op schuifkracht stroomt, 12 chemische gradiënten, 13 en elektrische stimuli 4 in vitro. De vervaardiging van bio-microfluïdische apparaten met polydimethylsiloxaan (PDMS) of polymethylmethacrylaat (PMMA, ook bekend als acryl) met succes verlaagd percentage mislukkingen van dergelijke experimenten. Bovendien gebruiken acrylbasis microfluïdische inrichtingen als een prototype voor het onderzoeken van biologische onderwerpen is eenvoudiger dan het gebruik PDMS chips. Verschillende functies acrylbasis inrichtingen ontwikkeld voor electrotaxis studie. Echter, geen van deze ontwerpen kunnen gelijktijdig testen van de effecten van verschillende chemische omstandigheden en het elektrisch veld op cellen electrotaxis studie. Zo ontwikkelden we een microfluïdische apparaat-de multichannel dual-elektrische veld (MDF) chip met vier onafhankelijke cultuur kanalen en acht verschillende experimentele condities in een chip. De acrylbasis MDF chip, eerst beschreven door Hou et al., 8 integreert elektrische stimulatie en verschillende chemisch gescheiden kanalen. Deze chemisch gescheiden kanalen kan worden gebruikt om de cultuur verschillende typen cellen in een experiment. De dcEF in de kanalen wordt geproduceerd door een elektrische voeding. Twee onafhankelijke elektrische velden, één met toegepaste elektrische veldsterkte (EFS) en een andere met 0 EFS, worden uitgevoerd in elk chemisch geïsoleerde kanaal. Op deze manier wordt de chip levert beter gecontroleerde coëxisteerende EF en chemische stimulatie. Bovendien, de resultaten van de numerieke simulatie van de chemische diffusie in de MDF-chip aan te geven dat er geen kruisbesmetting plaatsgevonden tussen de kanalen na een 24 uur experimentele periode. 8 Vergeleken met de Device beschreven door Li et al., 14 MDF chip levert een grotere cultuur gebied, waardoor verdere biochemische analyse van de elektrisch gestimuleerde cellen. Bovendien, met grotere observatiegebied MDF chip, meer cellen kunnen worden waargenomen in de test, zodat de analyse van de migratie snelheid of gerichtheid van de elektrisch gestimuleerde cellen nauwkeuriger. De enkelkanaals chip designs eerdere studies beschreven door Huang et al. 4 en Tsai et al. 15 staan ​​slechts één type cel of chemische te testen. Echter, de MDF chip worden gebruikt om de effecten van verschillende chemicaliën op electrotaxis, evenals de effecten van elektrische stimulering van verschillende typen cellen te onderzoeken. Met andere woorden, de MDF chip maakt efficiënte studie van chemische afhankelijkheden dosis.

<table><tbody><tr><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-medium</td><td>Gibco,Invitrogen, USA</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum</td><td>Gibco,Invitrogen, USA</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco,Invitrogen, USA</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Basic Life</td><td>BL2651</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (hydrochloride)</td><td>Cayman Chemical Co</td><td>10005583</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>LONZO, USA</td><td>SeaKem LE AGAROSE</td><td></td></tr><tr><td>spruitspuit</td><td>Terumo</td><td>3 ml met Luer-kogel</td><td></td></tr><tr><td>3-weg stopcock</td><td>Nipro</td><td>met Luer-kogel</td><td></td></tr><tr><td>PMMA (acryl)</td><td>HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan</td><td></td><td>dikte 1mm, 2mm</td></tr><tr><td>acrylische adapter</td><td>KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan</td><td>1/4-28 poort, 10x10x6 mm</td><td>aangepast</td></tr><tr><td>moer</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopdekglas</td><td>Deckgläser, Duitsland</td><td>24x60 mm</td><td></td></tr><tr><td>dubbelzijdig plakband</td><td>3M</td><td>PET 8018</td><td></td></tr><tr><td>superlijm</td><td>3M</td><td>Scotch Liquid Plus Superlijm</td><td></td></tr><tr><td>TFD4-detergens</td><td>Franklab, Frankrijk</td><td>TFD4</td><td></td></tr><tr><td>ultrasoon sterilisatieapparaat</td><td>LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo bonder</td><td>KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan</td><td>aangepast</td><td></td></tr><tr><td>CO2 laser graveerder</td><td>LTT group, Taiwan</td><td>ISL-II</td><td></td></tr><tr><td>proportioneel-integraal-derivatief (PID) regelaar</td><td>JETEC Electronics Co., Japan</td><td>TTM-J40-R-AB,</td><td></td></tr><tr><td>K-type thermokoppel</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A</td><td></td></tr><tr><td>4-kanaals spuitspuitpomp</td><td>KdScientific, USA</td><td>250P</td><td></td></tr><tr><td>DC-voeding</td><td>GWInstek, Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Y-Z motor stage</td><td>TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan</td><td>aangepast</td><td></td></tr><tr><td>invers microscope</td><td>Olympus, Japan</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>digitale SLR-camera</td><td>Canon, Japan</td><td>60D</td><td></td></tr></tbody></table>

electrotaxis studies van longkanker-cellen met behulp van een multichannel dual-elektrisch veld microfluïdische chip

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Het gedrag van gerichte celmigratie onder een gelijkstroom elektrisch veld (dcEF) wordt genoemd electrotaxis. De belangrijke rol van fysiologische dcEF in het begeleiden cel beweging tijdens embryonale ontwikkeling, celdifferentiatie en wondgenezing is aangetoond in vele studies. Door het toepassen van microfluïdische chips met een electrotaxis assay, wordt het onderzoek proces verkort en experimentele fouten worden geminimaliseerd. In de afgelopen jaren, microfluïdische inrichtingen van polymere stoffen (bijvoorbeeld polymethylmethacrylaat, PMMA of acryl) of polydimethylsiloxaan (PDMS) zijn op grote schaal gebruikt bij het ​​bestuderen van de reacties van cellen op elektrische stimulatie. Anders dan de talrijke stappen vereist om een ​​PDMS apparaat fabriceren, de eenvoudige en snelle opbouw van de acryl- micro fl uidic chip maakt het geschikt voor zowel inrichting prototyping en productie. Geen van de vermelde inrichtingen vergemakkelijken efficiënte studie van gelijktijdige chemische en DCEF effecten op cellen. In dit verslag beschrijven we ons ontwerp en fabricage van een acrylbasis multichannel dual-elektrisch-veld (MDF) chip om het gelijktijdige effect van chemische en elektrische stimulering van longkankercellen onderzoeken. De MDF-chip biedt acht combinaties van elektrische / chemische stimulaties in een enkele test. De chip niet alleen sterk verkort de vereiste experimentele tijd, maar verhoogt ook de nauwkeurigheid in electrotaxis studies.

Fabricage en assemblage van de MDF-apparaat Een schematisch diagram van de acrylbasis MDF chip wordt getoond in figuur 1A. Vier acryl platen, een dekking van glas, 13 acryl adapters, en een stukje dubbelzijdige tape werden gebruikt bij de assemblage van de voltooide MDF chip (Figuur 2D). Er zijn slechts vier onafhankelijke kanalen cultuur in de MDF apparaat. De on-chip zoutbru...

Veel microfluïdische apparaten zijn ontwikkeld voor gebruik in de studie van elektrotaxis. Toch laat geen van deze chips toe om de gelijktijdige chemische en elektrische veldeffecten (EF) op cellen efficiënt te bestuderen. We hebben een apparaat op basis van polymethylmethacrylaat ontwikkeld dat een beter gecontroleerde co-existentie van EF en chemische stimulatie biedt voor gebruik in elektrotaxis onderzoek.

Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Het algemene doel van dit microfluïdische experiment is om de effecten van kinase-remmers op de migratie van tumorcellen onder een direct elektrisch veld te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in cellulair electrotaxis-onderzoek, zoals wat de bepalende pathways zijn bij de door een elektrisch veld gestuurde migratie van kankercellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een zeer reproduceerbare en tijdsefficiënte electrotaxis-studie is die eenvoudig kan worden geïmplementeerd.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van het metastatisch potentieel van kanker. Aangezien de mobiliteit van magnetische kankercellen kan worden versterkt door een elektrisch veld, kan deze methode inzicht bieden in de intracellulaire elektrische eigenschappen van tumorcellen.Het kan ook worden toegepast op huidregeneratieprocessen, zoals wondgenezing. Begin met het gebruik van een teken- en ontwerpprogramma om een patroon voor een individuele acryllayer te tekenen. Sla het patroon op en zet vervolgens de lasersnijder aan.Verbind de graveerunit met de besturingslaptop en klik op het ontworpen patroonbestand om het patroon voor

electrotaxis-studies-lung-cancer-cells-using-multichannel-dual

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol laat zien methoden die worden gebruikt om 2D-en 3D-omgevingen tot stand in de speciaal ontworpen electrotactic kabinet, kan volgen...

Electric Field-gecontroleerde Directed migratie van neurale stamcellen in 2D-en 3D-omgevingen

In dit protocol we zien hoe aangepaste kamers die de toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld op time-lapse beeldvorming van volwassen hersenen afgeleide neurale voorlopercel translocatie in galvanotaxis schakelen mogelijk te construeren.

Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

Een semi-automatische micro-electro-fluidisch methode om on-demand motoriek induceren...

Microfluïdische-based Electrotaxis voor On-demand Kwantitatieve analyse van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Een microfluïdische vortex bijgestaan ​​elektroporatie platform is ontwikkeld voor sequentiële levering van verschillende moleculen in dezelfde cel populaties met een nauwkeurige en onafhankelijke dosering controle. Het systeem afmeting gebaseerd doelcel zuiveringsstap voorgaande elektroporatie geholpen om moleculaire levering efficiëntie en verwerkt levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren.

Microschaal-Vortex bijgestaan ​​Electroporatie voor Sequential Molecular Delivery

We presenteren een methode om een fysiologisch elektrisch veld toe te passen op migrerende, geïmmortaliseerde prostaatcellen in een op maat gemaakte galvanotaxiekamer. Met behulp van deze methode, tonen we aan dat 2 lijnen van niet-tumorigene prostaatcellen verschillende graden van migratiedirectionaliteit in het veld vertonen.

Gebruik te maken van op maat ontworpen galvanotaxis Chambers naar Study Directional Migratie van Prostaat Cellen

Micro-gefabriceerde apparaten geïntegreerd met vloeistofcomponenten bieden een in vitro platform voor celstudies die het in vivo micro-milieu nabootsen. We ontwikkelden op polymethylmethacrylaat gebaseerde microfluïdische chips voor het bestuderen van cellulaire reacties onder enkele of naast elkaar bestaande chemische/elektrische/schuifspanningsstimuli.

Het ontwerpen van microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties Onder Single of bestaande chemische / Elektro / Shear Stress Stimuli

We presenteren een microfluïdische Cancer-on-chip-model, de "Evolution Accelerator"-technologie, die een controleerbaar platform biedt voor langdurige realtime kwantitatieve studies van kanker dynamiek binnen goed gedefinieerde omgevingscondities op de eencellige Niveau. Deze technologie wordt verwacht te werken als een in vitro model voor fundamenteel onderzoek of pre-klinische ontwikkeling van de drug.

Generatie van heterogene drugs gradiënten over kanker populaties op een Microfluïdische evolution Accelerator voor real-time observatie

In deze studie presenteren we een protocol voor de differentiatie van neurale stam- en voorlopercellen (NPC's) die uitsluitend worden geïnduceerd door gelijkstroom (DC) pulsstimulatie in een microfluïdisch systeem.

Elektrisch-veld-geïnduceerde neurale precursor celdifferentiatie in microfluïdische apparaten

Dit protocol beschrijft de microfabricagetechnieken die nodig zijn om een lab-on-a-chip, microfluïdisch elektroporatieapparaat te bouwen. De experimentele opstelling voert gecontroleerde transfecties op één celniveau uit in een continue stroom en kan worden uitgebreid naar hogere doorvoersnelheden met populatiegebaseerde controle. Er wordt een analyse verstrekt die de mogelijkheid toont om de mate van celmembraanpermeabilisatie in realtime elektrisch te bewaken.

De fabricage en werking van een continu flow, micro-elektroporatiesysteem met permeabilisatiedetectie

Borstkankercellen vertonen verschillende diëlektrische eigenschappen in vergelijking met niet-tumor borstepitheelcellen. Er is verondersteld dat, op basis van dit verschil in diëlektrische eigenschappen, de twee populaties kunnen worden gescheiden voor immunotherapiedoeleinden. Om dit te ondersteunen, modelleren we een microfluïdisch apparaat om MCF-7- en MCF-10A-cellen te sorteren.

Microfluïdisch apparaat voor de scheiding van niet-gemetastaseerde (MCF-7) en niet-tumor (MCF-10A) borstkankercellen met behulp van AC-dielectroforese

Hier presenteren we een protocol om een uniek tweelaags microfluïdisch apparaat te fabriceren om de elektromechanische regulatie van de homeostase van epitheelweefsel te bestuderen. Het apparaat past statische fysiologische elektrische stromen toe die loodrecht op het weefselvlak staan, wat van invloed is op de adhesie, proliferatie en extrusie van cellen tot cel. Beeldvorming van levende cellen en mechanische stressmetingen onthullen mechanismen van deze processen.

Onthullende elektromechanische controle van weefselhomeostase met behulp van een tweelaags microfluïdisch apparaat

Leer hoe je elektrotaxis van longkankercellen bestudeert met een microfluïdische chip met dubbel elektrisch veld. Deze methode helpt bij het evalueren van kinaseremmers en het begrijpen van migratiemechanismen.

Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip

Meer video's verkennen