Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression

Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe de effecten van groeifactoren en remmers kunnen worden bepaald in de genexpressie van zich ontwikkelende kippenembryo ledematen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals hoe signaalmoleculen de groei en differentiatie van cellen in vivo beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een methode biedt om deze factoren direct in het embryo te testen.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de ledematontwikkeling, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals neuraal weefsel, somieten of gastrulatie. Het demonstreren van de procedure zal Rebeea Mohammed zijn, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Om te beginnen, brengt u één milliliter van de kralen over van de oorspronkelijke stockoplossing naar een verse buis.

Laat de kralen bezinken, verwijder vervolgens de vloeistof en vervang deze door één milliliter PBS. Herhaal deze stap vijf keer en bewaar de gewassen kralen op vier graden Celsius, als een slurry in PBS. Selecteer de kralen voor het enten door ze uit de gewassen stockoplossing te verwijderen met behulp van een 20 microliter pipette en plaats ze in één milliliter PBS.

Gebruik een stereoscoop om kralen te kiezen die ongeveer 100 micron in diameter zijn. Breng de geselecteerde kralen in twee microliter vloeistof over in een nieuwe petrischaal met een druppel van 20 milliliter PBS. Vervolgens verwijdert u het PBS van de kralen. Eerst met een 20 microliter pipette, en vervolgens verwijdert u het restvocht door capillaire actie met behulp van een fijne horlogemakerstangen.

Het is belangrijk om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen, zodat de groeifactor niet wordt verdund wanneer deze aan de kralen wordt toegevoegd. Pipetteer de groeifactor direct op de kralen. Voor FGF18, voeg 0,5 microliter recombinant FGF18 toe, gereconstitueerd tot 0,5 milligram per milliliter in PBS met 0,1 procent BSA.

Plaats vervolgens enkele druppels water rond de randen van de schaal om te voorkomen dat de vloeistof verdampt. Wanneer u klaar bent, incubeer de kralen gedurende één uur op kamertemperatuur. Na incubatie verwijdert u de waterdruppels uit de schaal met een Pasteur pipette en plaatst u de schaal op ijs.

Derivatiseren van de kralen, door eerst een spatel te gebruiken om de kralen over te brengen naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens één milliliter 0,2 normaal mierenzuur toe en incubeer de kralen in het zuur op een schuddende platform gedurende één uur. Laat vervolgens de kralen bezinken, verwijder het mierenzuur en vervang het door één milliliter water.

Was de kralen gedurende één uur op het schudplatform en herhaal het wassen zes keer om eventueel resterend mierenzuur te verwijderen. Na de laatste wassing, verwijdert u de resterende vloeistof en bewaart u de kralen op vier graden Celsius. Gebruik een spatel om een kleine palet van kralen van ongeveer vijf tot tien microliter in volume van de stock te verwijderen en plaats de kralen in een petrischaal van 30 milliliter.

Voeg vervolgens één milliliter DMSO toe. Gebruik vervolgens een P2 pipette die is ingesteld op twee microliter, om kralen van ongeveer 100 micron in diameter over te brengen naar een druppel van 20 microliter oplosmiddel in een andere petrischaal van 30 milliliter. Verwijder het grootste deel van het oplosmiddel met een 20 microliter pipette en eventueel resterend oplosmiddel met een twee microliter pipette.

Bedek vervolgens de kralen met 20 microliter van het medicijn dat moet worden toegepast, opgelost in DMSO. Incubeer de kralen in de medicijnoplossing gedurende één uur. Bescherm de kralen tegen licht, omdat veel medicijnmoleculen lichtgevoelig zijn.

Om de kralen beter te kunnen visualiseren, brengt u vier tot vijf kralen in twee microliter vloeistof over in 20 microliter van twee procent fenol rood opgelost in water. Verwijder een enkele kraal met fijne horlogemakerstangen en spoel de kraal in PBS. Laat de kralen niet langer dan 15 minuten in de fenolrode oplossing zitten voordat u ze spoelt, omdat dit verlies van activiteit kan veroorzaken.

Snijd fijn wolfraamdraad in stukken van drie tot vier centimeter. Voer vervolgens een stuk van de draad in aan het uiteinde van een glazen Pasteur pipette en smelt deze in een Bunsen-brander om het op zijn plaats te fixeren. Bereid maximaal 10 naalden voor om ervoor te zorgen dat er reserves zijn als ze beschadigd raken. Plaats vervolgens het uiteinde van de draad in de vlammen van een gasbrander en houd het daar totdat het wolfraam witgloeit en de punt scherp is.

Dit duurt ongeveer twee tot drie minuten. Voeg vijf tot zes druppels artist India inkt toe aan 15 milliliter PBS met 100 eenheden Penicilline en 0,1 milligram Streptomycine per milliliter. Om de kippenembryo's voor te bereiden, incubeert u eieren met de stompe kant omhoog tot ze het gewenste stadium bereiken voor de meeste manipulatie van het ledemaatknopje, wat meestal drie tot vijf dagen is.

Wanneer het gewenste tijdstip is bereikt, gebruikt u stompe pincetten om op het stompe uiteinde van het ei te tikken en de schaal te breken. Gebruik vervolgens de pincetten om de schaal te verwijderen en het embryo bloot te leggen. Zorg ervoor dat het eicellenmembraan ook wordt verwijderd.

Om het embryo te visualiseren, injecteert u PBS aangevuld met een paar druppels artist India inkt onder het embryo met een spuit van één milliliter en een naald van 21 gauge. Het vitelline membraan dat het embryo bedekt, kan vervolgens worden verwijderd met fijne pincetten. Voeg vervolgens twee tot drie milliliter van een aangevulde PBS met één procent foetaal runder serum, 100 eenheden per milliliter Penicilline en 0,1 milligram per milliliter Streptomycine toe aan het ei om ervoor te zorgen dat het embryo niet uitdroogt.

Gebruik geslepen horlogemakerstangen om het amnion boven de zich ontwikkelende ledemaatknoppen te openen. In deze sta