Name: Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Leer hoe u kralen ent in kippenembryo's om de effecten van groeifactoren en inhibitoren op genexpressie in ledematen te onderzoeken. Deze methode biedt waardevolle inzichten in signaaltransductieprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door een University of Nottingham Early Career-beurs aan DS. RM wordt gefinancierd door het Higher Committee for Education Development of Iraq.

Ethiek Verklaring: Al deze experimenten volgen het dier zorg en ethische richtlijnen van de Universiteit van Nottingham. 1. Voorbereiding van de Heparine Kralen voor Enten <ol><li> Was heparine korrels grondig in PBS vóór gebruik. Opmerking: Parels kunnen bij 4 ° C worden bewaard als een suspensie in PBS. <ol><li> Selecteer kralen voor enten door het verwijderen van hen uit de voorraad met een 20 ul pipet in een 1 ml daling van PBS. Gebruik een micropipet ingesteld op 2 pl kralen over in een 20 ul druppel PBS in een petrischaal 3 cm. Kies kralen op basis van grootte en met behulp van een stereo dissectiemicroscoop, transfer geselecteerd kralen met een P2 pipet tip; die rond 100 micrometer diameter zijn ideaal. </li></ol></li><li> Verwijder de PBS uit de korrels. Verwijder het meeste vocht met een 20 ul pipet en de residuele vloeistof door capillaire werking met fijne horlogemakers pincet. Opmerking: Het is van belang om zoveel mogelijk te verwijderen, zodat de groei factor is niet verdund wanneer het wordt toegevoegd aan de korrels. </li><li> Pipetteer de groeifactor direct op de korrels. Voor FGF18 voeg 0,5 ul recombinant FGF18 gereconstitueerd in 0,5 mg / ml in 0,1% BSA in PBS. Plaats enkele druppels water rond de randen van de schotel naar het verhinderen dat vloeistof verdampen. </li><li> Incubeer de kralen voor 1 uur bij KT. Verwijder de druppels water uit de schotel met een Pasteur pipet en plaats op ijs klaar voor transplantatie. </li><li> Indien nodig (voor transparante kralen) overdracht 4-5 kralen tot 2% fenol rood voor het enten te helpen visualiseren. Spoel in PBS alvorens naar het embryo. </li></ol> 2. Voorbereiding van AG 1-X2 Kralen voor Enten <ol><li> Vóór derivatiseren kraaltjes met 0,2 N mierenzuur. <ol><li> Gebruik hiervoor een spatel kralen overdracht naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml 0,2 N mierenzuur en was op een schudplateau gedurende 1 uur. </li><li> Verwijder vervolgens de mierenzuur met een P1000 pipet en te vervangen door 1ml water. Wassen 1 uur en herhaal zesmaal resterende mierenzuur verwijderen. </li><li> Verwijder overblijvende vloeistof met een P1000 pipet en bewaar de korrels bij 4 ° C. Opmerking: Het is niet nodig om al het restwater in dit stadium te verwijderen. </li></ol></li><li> Verwijderen van een kleine pellet van kralen van ongeveer 5-10 ul volume van de voorraad met een kleine spatel in een 3 cm petrischaal en voeg 1 ml DMSO (of een ander oplosmiddel wordt het geneesmiddel opgelost in). Opmerking: Dit moet honderden parels om die van de juiste grootte te selecteren verschaffen. </li><li> Gebruik een pipet P2 ingesteld op 2 pl aan kralen overdracht van ongeveer 100 urn diameter een 20 ul druppel oplosmiddel in een 3 cm petrischaal. </li><li> Verwijder oplosmiddel met een 20 ul pipet en eventuele achtergebleven oplosmiddel met 2 pi pipet. Vervang door 20 gl van het geneesmiddel aan te passen. Opmerking: Om consistent te lossen het geneesmiddel bij een concentratie van 100 uM in DMSO (of die ooit oplosmiddel wordt gebruikt),20 pl aliquot in en bewaar bij -80 ° C als een kleine molecule inhibitoren zijn onstabiel en is het best om herhaalde vries-dooien te voorkomen. Eventueel verdun het geneesmiddel voor de gewenste concentratie voor het weken kralen. Doeltreffende concentraties moeten empirisch worden bepaald voor elk geneesmiddel. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur. Beschermen tegen licht als veel van deze moleculen zijn gevoelig voor licht. </li><li> Voor enten overdracht 05/04 kralen met een pipet p2 ingesteld op 2 pi in 20 gl 2% fenolrood opgelost in water. Voer deze stap met behulp van een stereo dissectiemicroscoop om de kralen te visualiseren. Verwijder een enkele kraal met fijne horlogemakers pincet of een draad lus en spoel in PBS alvorens naar het embryo. Niet parels in 2% fenolrood reactie langer dan 15 min vóór gebruik als dit verlies aan activiteit kan veroorzaken. </li></ol> 3. Voorbereiding Tungsten Naalden <ol><li> Snijd fijne wolfraam draad in 3-4 cm lengte. Steek een stuk draad in het uiteinde vaneen glazen Pasteur pipet en smelten in een Bunsen brander te fixeren. Bereid tot 10 naalden zodat er reserveonderdelen als ze beschadigd tijdens gebruik. </li><li> Plaats het uiteinde van de draad in een steekvlam vlam en houd hem daar tot de wolfraam gloeit witte en de tip is scherp (ongeveer 2-3 minuten). Opmerking: Tijdens het gebruik van de naald kan worden gereinigd en opnieuw aangescherpt in de brander als dat nodig is. OPMERKING: Deze naalden kunnen ook gebruikt worden om lussen te maken voor overdracht kralen. Zachtjes aanraken van de naald naar de bank en het zal buigen om een ​​lus te vormen. </li></ol> 4. De voorbereiding van embryo&#39;s voor Bead Enten <ol><li> Broeden eieren met de stompe eind tot ze de gewenste fase (3-5 dagen voor de meeste ledematen knop manipulaties) te bereiken. Met behulp van stompe tang tik op de stomp uiteinde aan de schaal te breken en vervolgens met de tang om de schil te verwijderen en het embryo bloot te leggen. Zorg ervoor dat de eierschaal membraan wordt ook verwijderd. OPMERKING: 1-2 ml PBS kan worden toegevoegd met een pasteurpipet te helpen metDit als het membraan vasthoudt aan de dooier. Voorzichtig pipet de PBS op het oppervlak van de dooier, het grijpen van de membraan met de tang, het verzorgen van de dooier niet te beschadigen, en trek het voorzichtig uit de buurt van het ei. </li><li> Verwijder tot 5 ml van albumine uit het ei met een spuit 10 ml en een 19 G naald. Neem slechts zoveel als nodig is om de embryo maakt contact met de cassette om het ei het verwijderen van grotere hoeveelheden afdichting embryo overleving verminderen niet te garanderen. </li><li> Visualiseren het embryo voeg een 5-6 druppels kunstenaars india inkt 15 ml PBS met 100 U penicilline en 0,1 mg streptomycine / ml. Injecteren 0,5-1 ml direct onder het embryo met een spuit van 1 ml en een 25 G naald. </li><li> Voeg 2-3 ml PBS met 1% foetaal kalfsserum en 100 U penicilline en 0,1 mg streptomycine / ml in het ei om het embryo niet uitdrogen garanderen. Met behulp van geslepen horlogemakers pincet verwijder de vitelline membraan en open de amnion over de ontwikkeling van ledematen. Zorg ervoor dat de embryo niet uitdroogt enIndien nodig, voeg meer PBS / FCS. Opmerking: De ledematen is duidelijk te zien als gepaarde uitwassen op de flank van het embryo. Op deze fasen wordt het embryo slag zodanig rechts gewoonlijk boven. Daardoor gewoonlijk gemakkelijker parels enten in de juiste ledematen en gebruik de linker die als contralaterale controles. </li><li> Gebruik een scherp wolfraamdraad om een ​​incisie te maken in de ledemaatknop wanneer de hiel wordt geïmplanteerd. Zaag niet helemaal door de ledemaatknop indien mogelijk, maar op jongere stadia dit moeilijk. Opmerking: In oudere embryo&#39;s (HH fase 22 en hoger) is het mogelijk specifieke gebieden van de ledemaatknop selecteren voor enting maar op jongere stadia is moeilijker omdat de ledemaatknop zelf is klein. Het is ook belangrijk om te onthouden dat de ledemaatknop voorbij de geënte hiel zal groeien zo, vooral bij jonge stadia, de hiel wordt in de proximale extremiteit blijven. </li><li> Pick-up een kraal van zowel de groeifactor of drugs met behulp van extra fijn watchmakers pincet of een lus gemaakt van een wolfraam naald. Als de kraal is gedrenkt in hetzij DMSO en fenolrood, spoelen in PBS alvorens het embryo. Breng de kraal naar de embryo met de tang / draad lus. Gebruik dan de geslepen wolfraamdraad aan de korrel te voegen in de incisie. </li><li> Voeg 1-2 ml PBS / FCS om het ei te zorgen dat het embryo gehydrateerd wordt gehouden, maar vermijd direct aanbrengen op het embryo zich als dit de embryo&#39;s kunnen beschadigen en de kraal te worden verdreven. Verzegel het ei met tape en terug naar de incubator. </li></ol>

<ol><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li>
<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).</li>
<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest%3A+a+long+and+still+ongoing+story%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li>
<li>Bell, E., Brickell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+retroviral+vectors+for+expressing+genes+in+avian+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo.</a> Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).</li>
<li>Abu-Elmagd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2FLef1+signaling+acts+via+Pitx2+to+regulate+somite+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis.</a> Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).</li>
<li>Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+signals+from+the+neural+tube%2C+floor+plate+and+notochord+induce+myogenic+bHLH+gene+expression+in+the+somite%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite.</a> Development. 121, 651-660 (1995).</li>
<li>McGrew, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+germline+transgenic+chickens+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors.</a> EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).</li>
<li>Valasek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+investigations+into+the+development+of+the+pectoral+girdle%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle.</a> Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).</li>
<li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).</li>
<li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li>
<li>Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+application+of+retinoic+acid+to+the+limb+bond+mimics+the+action+of+the+polarizing+region%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region.</a> Nature. 296, 564-566 (1982).</li>
<li>Rosello-Diez, A., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulative+patterning+in+limb+bud+transplants+is+induced+by+distalizing+activity+of+apical+ectodermal+ridge+signals+on+host+limb+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells.</a> Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).</li>
<li>Anakwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+regulates+myogenic+differentiation+in+the+developing+avian+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing.</a> Development. 130, 3503-3514 (2003).</li>
<li>Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+timing+differentiation+during+limb+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The importance of timing differentiation during limb muscle development.</a> Current Biology. 8, 642-652 (1998).</li>
<li>Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scatter+factor%2Fhepatocyte+growth+factor+%28SF%2FHGF%29+induces+emigration+of+myogenic+cells+at+interlimb+level+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo.</a> Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).</li>
<li>Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+FGF18+and+retinoic+acid+regulate+differentiation+of+chick+embryo+limb+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts.</a> Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).</li>
<li>Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klhl31+is+associated+with+skeletal+myogenesis+and+its+expression+is+regulated+by+myogenic+signals+and+Myf-5%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5.</a> Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).</li>
<li>Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28beta%29-catenin+in+the+developing+chick+myotome+is+regulated+by+myogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals.</a> Development. 127, 4105-4113 (2000).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Martinez-Morales, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+and+retinoic+acid+activity+gradients+control+the+timing+of+neural+crest+cell+emigration+in+the+trunk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk.</a> Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).</li>
<li>Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signals+provide+a+timing+mechanism+for+the+FGF-retinoid+differentiation+switch+during+vertebrate+body+axis+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension.</a> Development. 134, 2125-2135 (2007).</li>
<li>Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-box+and+homeobox+transcription+factors+suggests+roles+in+controlling+chick+limb-type+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity.</a> Development. 125, 2825-2835 (1998).</li>
<li>Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somite+patterning+by+Sonic+hedgehog+and+its+downstream+signal+response+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes.</a> Development. 125, 777-790 (1998).</li>
<li>Sweetman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-4+signaling+is+involved+in+mir-206+expression+in+developing+somites+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).</li>
<li>Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+paraxial+and+lateral+plate+mesoderm+cells+emerging+from+the+late+primitive+streak+is+controlled+by+different+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals.</a> BMC Developmental Biology. 8, 63(2008).</li>
<li>Scott, B. B., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tissue-specific+transgenic+birds+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).</li>
<li>Seidl, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+quail+as+a+model+for+research+in+the+avian+nervous+system%3A+a+comparative+study+of+the+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gebruik van kralen grafts rechtstreeks op ontwikkelende weefsels in ovo is een krachtig hulpmiddel om de rol van de groeifactor signalering ontleden tijdens de ontwikkeling die ongekende controle over het ontwikkelingsstadium waarin zij worden toegepast en de blootstellingsduur. De keuze van de kraal voor elk type molecuul van belang. Kleine hydrofobe moleculen, zoals beschreven remmers en retinoïnezuur, goed binden gewoonlijk gederivatiseerde AG 1-X2 korrels hoewel het noodzakelijk om d...

Aviaire embryo&#39;s een krachtig hulpmiddel voor de studie van ontwikkeling bedoeld jaren 1. Een van hun meest nuttige eigenschappen is dat ze relatief gemakkelijk te manipuleren. Externe ontwikkeling maakt het mogelijk om het ei te openen om het embryo en uitvoeren van verschillende micromanipulations met voorbeelden zoals de klassieke kwartel-chick chimera voor het bestuderen lot van de cel 2,3, de injectie van retrovirussen voor overexpressie in specifieke weefsels tijdens de ontwikkeling 4,5 en explantatie cultuur ontwikkelingsstoornissen signalering bronnen 6 identificeren. Meer recent hersenschimmen gegenereerd tussen ongelabelde gastheren met enten van een transgene kippen lijn die GFP heeft aangetoond dat de combinatie van klassieke enten en genetische modificatie belangrijke inzichten kunnen geven in de ontwikkeling van 7,8. Het gemak waarmee het aviaire embryo kan worden gemanipuleerd heeft gemaakt een uitstekend model voor de studie ledematenontwikkeling 9. Toepassing van specifieke groeifactoren aan de ontwikkeling van ledematen in vivo is behulpzaam geweest bij het ​​identificeren van factoren die ledematen patronen 10,11 veranderen en blijft om inzicht te geven in dit proces 12 geweest. Deze aanpak is ook gebruikt om de factoren die spierontwikkeling regelen bestuderen en heeft rollen voor diverse signalen zoals Wnts 13, BMP&#39;s 14 en 15 HGF blootgelegd. Recent werd deze techniek gebruikt om de signalen te besturen myogene genexpressie in de ledemaatknop onderzoeken en blijkt dat de interacties tussen FGF18 en retinoïnezuur het tijdstip van MyoD expressie 16 kan besturen. Met een combinatie van groeifactoren en kleine moleculen die op kralen kunnen worden geladen en vervolgens direct geënt in specifieke weefsels in ontwikkelingsstadia gedefinieerde geeft de mogelijkheid om op bijna elk moment en omgeving ingrijpen tijdens de ontwikkeling. Deze is gebruikt om INVEstigate veel processen waaronder somiet patroonvorming 17,18, neurale specificatie 19, neurale lijst migratie 20 en as uitbreiding 21. Hier beschrijven we een werkwijze voor het enten korrels geweekt in beide groeifactoren of inhibitors in ontwikkelende kippenembryo ledematen. Deze is gebruikt om het effect van deze signalen op myogenesis bepalen door het analyseren spieren genexpressie met in situ hybridisatie. We beschrijven implantaten met behulp van heparine geweekte korrels, die worden gebruikt voor groeifactoren of AG 1-X2 parels voor kleine hydrofobe moleculen zoals retinoïnezuur of kleine molecule inhibitoren van specifieke signaleringsroutes. Maar andere kralen zijn ook beschikbaar, die zijn gebruikt om zowel FGF&#39;s 22 en 23 Shh leveren.

<table><tbody><tr><td>Heparine acrylkralen</td><td>Sigma</td><td>H5263</td><td>De acryl-heparine kralen die zijn gebruikt, zijn niet langer verkrijgbaar. Er is echter een alternatief product beschikbaar, heparine agarose kralen, cat no H6508. Deze zijn transparant dus moeilijker om mee te werken, maar kunnen op dezelfde manier als AG 1-X2 kralen met fenol rood worden gekleurd,</td></tr><tr><td>AG 1-X2 kralen</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr><tr><td>Affi Gel blauwe kralen</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301; 153-7302</td><td>Deze kralen zijn gebruikt met een reeks groeifactoren, waaronder Shh en FGF's en kunnen worden gebruikt om heparine kralen te vervangen</td></tr><tr><td>FGF18</td><td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>Resuspendeer in PBS met 0/1% BSA, bereid eenmalige gebruiksaliquots van 0,5-1ul en bewaar bij -80&deg;C. Batches en leveranciers kunnen variëren, dus verschillende concentraties moeten worden getest om een effectieve dosis te bepalen.</td></tr><tr><td>U0126</td><td>Cell Signalling</td><td>9903</td><td>Maak een 20mM stockoplossing in DMSO en bewaar in eenmalige gebruiksaliquots bij -80&deg;C. Bescherm tegen licht.</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td><td>Resuspendeer in DMSO en bewaar in eenmalige gebruiksaliquots bij -80&deg;C. Bescherm tegen licht.</td></tr><tr><td>Zwarte Indiase inkt</td><td>Windsor and Newton</td><td>5012572003384 (30 ml)</td><td>Hoewel er alternatieven voor dit product beschikbaar zijn, moet u voorzichtig zijn, omdat sommige inkten giftig zijn voor embryo's</td></tr><tr><td>Wolfraamdraad, 0,1 mm dia. 99,95%</td><td>Alfa Aesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline / streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Verdun 100X in PBS/inkt en PBS/FCS</td></tr></tbody></table>

enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed gene expression

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Met behulp van kippenembryo&#39;s is het mogelijk om direct de effecten van beide groeifactoren of specifieke remmers van signaaltransductiewegen op genexpressie en activering van signaaltransductieroutes testen. Deze techniek maakt de afgifte van signaalmoleculen op exact gedefinieerde ontwikkelingsstadia specifieke tijden. Na deze embryo&#39;s kunnen worden geoogst en genexpressie onderzocht, bijvoorbeeld door in situ hybridisatie, of activering van signaaltransductieroutes waargenomen met immunokleuring. In deze video heparine kralen gedrenkt in FGF18 of AG 1-X2 kralen gedrenkt in U0126, een MEK-inhibitor, worden geënt in de ledematen kiem in ovo. Hieruit blijkt dat FGF18 induceert expressie van MyoD en ERK fosforylatie en zowel endogene als FGF18 MyoD geïnduceerde expressie wordt geremd door U0126. Kralen gedrenkt in een retinoïnezuur antagonist kan voortijdige MyoD inductie versterken door FGF18. Deze aanpak kan onsed met een groot aantal verschillende groeifactoren en remmers en wordt gemakkelijk aangepast aan andere weefsels in het ontwikkelende embryo.

Bij HH stadium 21 MyoD niet wordt uitgedrukt in ontwikkelingslanden ledematen myoblasten hoewel kleuring te zien in de myotoom van de ontwikkeling somieten (Figuur 1A). Figuur 1B toont in situ hybridisatie voor MyoD 6 uur na FGF18 kraal graft. MyoD wordt geïnduceerd in myoblasten nabij de hiel terwijl er geen expressie in de contralaterale ledemaat. Co-enten een kraal gedrenkt in U0126, een specifieke remmer van MEK, blokken FGF18 inductie van MyoD (figuur 1C)....

Door kralen gedrenkt in groeifactoren of specifieke remmers van signaalroutes in zich ontwikkelende embryo's te enten, is het mogelijk om hun effecten direct in vivo te testen. In dit protocol worden kralen in de ledemaatknop geënt om de effecten van deze moleculen op genexpressie en signaaltransductie te bepalen.

Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe de effecten van groeifactoren en inhibitoren op de genexpressie in ontwikkelende ledematen van kippenembryo's kunnen worden bepaald. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals de manier waarop signaleringsmoleculen de groei en differentiatie van cellen in vivo beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een methode biedt om deze factoren direct in het embryo te testen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de ontwikkeling van de ledematen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals neuraal weefsel, somieten of gastrulatie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Rebeea Mohammed, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin met het overbrengen van één milliliter van de kralen uit de oorspronkelijke voorraadoplossing naar een nieuwe buis.Laat de kraaltjes bezinken, verwijder vervolgens de vloeistof en vervang deze door één milliliter PBS. Herhaal deze stap vijf keer en bewaar de gewassen kraaltjes bij vier graden Celsius als suspensie in PBS. Selecteer de kraaltjes voor het enten door ze met een 20 microliter pipette uit de gewassen voorraadoplossing te halen en in één milliliter PBS te plaatsen.Kies met een stereomicroscoop kralen met een diameter van ongeveer 100 microns. Draag de geselecteerde kralen in twee micro-liters vloeistof over naar een nieuwe Petrischaal met een druppel van 20 milliliter PBS Next, en verwijder het PBS van de kralen. Doe dit eerst met een 20 micro-liter pipette, en verwijder vervolgens de resterende vloeistof door capillaire werking met een fijne horlogemakerspincet.Het is belangrijk om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen, zodat de groeifactor niet wordt verdund wanneer deze aan de beads wordt toegevoegd. Pipetteer de groeifactor direct op de beads. Voeg voor FGF18 0,5 µL recombinant FGF18 toe, gereconstitueerd in 0,5 mg/mL in PBS met 0,1% BSA.Plaats vervolgens enkele druppels water langs de randen van de schaal om te voorkomen dat de vloeistof verdampt. Incubeer de kraaltjes vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder na incubatie de waterdruppels uit de schaal met een Pasteurpipet en plaats de schaal op ijs.Derivatiseer de kralen door eerst met een spatel de kralen over te brengen naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens één milliliter 0,2 normaal mierenzuur toe en incubeer de kralen in het zuur op een schudplatform gedurende één uur. Laat de kralen daarna bezinken, verwijder het mierenzuur en vervang dit door één milliliter water.Was de kraaltjes gedurende één uur op het schudplatform en herhaal het wassen zes keer om eventuele resterende mierenzuur te verwijderen. Verwijder na de laatste wasbeurt de resterende vloeistof en bewaar de kraaltjes bij vier graden Celsius. Gebruik een spatel om een kleine hoeveelheid kraaltjes van ongeveer vijf tot tien µL uit de voorraad te halen en plaats de kraaltjes in een Petri-schaal van 30 milliliter.Voeg vervolgens één milliliter DMSO toe. Gebruik daarna een P2-pipet ingesteld op twee microliter om kralen met een diameter van ongeveer 100 micron over te brengen naar een druppel oplosmiddel van 20 microliter in een andere Petri-schaal van 30 milliliter. Verwijder het grootste deel van het oplosmiddel met een 20 microliter pipet en het resterende oplosmiddel met een pipet van twee microliter.Bedek de kralen vervolgens met 20 µL van het toe te passen geneesmiddel, opgelost in DMSO. Incubeer de kralen gedurende één uur in de geneesmiddeloplossing. Bescherm de kralen tegen licht, aangezien veel geneesmiddelmoleculen lichtgevoelig zijn.Om de beads beter zichtbaar te maken, brengt u vier tot vijf beads in 2 µL vloeistof over naar 20 µL twee procent fenolrood opgelost in water. Verwijder één enkele bead met een fijne horlogemakerspincet en spoel de bead met PBS. Laat de beads niet langer dan 15 minuten in de fenolrood-oplossing liggen voordat u ze spoelt, omdat dit kan leiden tot verlies van activiteit.Knip fijne wolfraamdraad in stukken van drie tot vier centimeter. Steek vervolgens een stuk van de draad in het uiteinde van een glazen Pasteurpipet en smelt deze vast met een Bunsenbrander om de positie te fixeren. Bereid tot 10 naalden voor om er reserve te hebben als ze beschadigd raken. Plaats vervolgens het uiteinde van de draad in de vlam van een brander en houd deze daar totdat het wolfraam witgloeiend wordt en de punt scherp is.Dit duurt ongeveer twee tot drie minuten. Voeg vijf tot zes druppels India-inkt voor kunstenaars toe aan 15 milliliters PBS met 100 units Penicilline en 0,1 milligram Streptomycine per milliliter. Om de kippenembryo's voor te bereiden, worden de eieren met de stompe zijde naar boven geïncubeerd totdat ze het gewenste stadium voor de meeste manipulaties van de ledemaatknop hebben bereikt, wat doorgaans drie tot vijf dagen is.Wanneer het gewenste tijdstip is bereikt, tik dan met stompe pincetten tegen de stompe zijde van het ei om de schaal te breken. Gebruik vervolgens de pincetten om de schaal te verwijderen en het embryo bloot te leggen. Zorg ervoor dat het celmembraan van het ei ook wordt verwijderd.Om het embryo te visualiseren, injecteert u PBS aangevuld met een paar druppels vloeibare India-inkt onder het embryo met een spuit van één milliliter en een naald van 21 gauge. Het vitellijnmembraan boven het embryo kan vervolgens met een fijne pincet worden verwijderd. Voeg daarna twee tot drie milliliter aangevulde PBS met één procent foetaal kalfserum, 100 units per milliliter penicilline en 0,1 milligram per milliliter streptomycine toe aan het ei om te voorkomen dat het embryo uitdroogt.Open met verscherpte horlogemakerpincetten het amnion boven de ontwikkelende ledemaatknoppen. In deze stadia zal het embryo doorgaans draaien, zodat de rechterzijde bovenaan komt te liggen. Voorkom dat het embryo uitdroogt door indien nodig extra aangevulde PBS-oplossing toe te voegen.Het amnion rondom het embryo kan worden geopend met een fijne wolfraamnaald om het ontwikkelende ledemaat bloot te leggen. Gebruik vervolgens de aangescherpte wolfraamdraad om een incisie te maken in de ledemaatknop op de plaats waar de bead zal worden geïmplanteerd. Vermijd het waar mogelijk om volledig door de ledemaatknop heen te snijden.Hoewel dit in jongere stadia moeilijk is. Pak een kraal, gecoat met ofwel de groeifactor of het medicijn, op met extra fijne horlogemakerspincetten. Als de kraal is geweekt in DMSO of fenolrood, zorg er dan voor dat deze wordt gespoeld met PBS voordat deze op het embryo wordt aangebracht.Breng de kraal met de pincet over naar het embryo en gebruik vervolgens de aangescherpte wolfraamdraad om de kraal in de incisielocatie te plaatsen. Voeg nog één tot twee milliliter van de aangevulde PBS-oplossing toe aan het ei om ervoor te zorgen dat het embryo gehydrateerd blijft. Vermijd het direct aanbrengen van de oplossing op het embryo zelf, omdat dit het embryo kan beschadigen en ertoe kan leiden dat de kraal losraakt.Gebruik vervolgens een spuit van tien milliliter, uitgerust met een naald van 19 gauge, om slechts zoveel albumine te verwijderen als nodig is om te voorkomen dat het embryo in contact komt met de tape die wordt gebruikt om het ei af te dichten. Zorg ervoor dat de naald het eigeel niet beschadigt door deze langs de binnenzijde van de schaal naar beneden te schuiven. Sluit het ei tot slot af met tape en plaats het terug in de incubator.Om te bevestigen dat FGF18 in staat is om via MEK ERK te fosforyleren, werden de embryo's één uur na het enten van de kraaltjes geoogst en immunogekleurd voor de aanwezigheid van gefosforyleerd ERK, wat zichtbaar is rondom het geënte kraaltje in de afbeelding rechts. In HH-stadium 21 wordt MyoD niet tot expressie gebracht in ontwikkelende ledemaat-myoblasten. Kleuring is echter wel zichtbaar in het myotoom van de ontwikkelende somieten.Zes uur na een FGF18-beadtransplantaat kan worden waargenomen dat MyoD wordt geïnduceerd in myoblasten dicht bij de bead. Terwijl er geen expressie is in het contralaterale ledemaat. Deze expressie kan worden geremd door gelijktijdig een bead te transplanteren die is gecoat met een MEK-remmer zoals U0126.Op vergelijkbare wijze vermindert het enten van een U0126-kraal bij HH-stadium 21 de endogene expressie van MyoD na 24 uur, vergeleken met de onbehandelde contralaterale ledemaat. In ledemaatknoppen, bij HH-stadium 19, induceert FGF18 geen MyoD. Co-enten van kralen gedrenkt in FGF18 en een retinoïnezuurantagonist kan dit echter overwinnen, waarna ectopische MyoD wordt gedetecteerd.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie tot vier minuten worden uitgevoerd, mits deze correct wordt toegepast. De ontwikkeling van deze techniek stelde onderzoekers op het gebied van de ontwikkelingsbiologie in staat om groeifactorsignalering bij embryo-ontwikkeling te onderzoeken. Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om erop te letten dat het embryo niet uitdroogt.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe kralen in ontwikkelende embryo's kunnen worden geënt om te bepalen hoe signalering door groeifactoren de ontwikkeling beïnvloedt.

grafting-beads-into-developing-chicken-embryo-limbs-to-identify

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een verscheidenheid van groeifactoren en eiwitten interageren te bewegen cellen op zich te nemen andere cel lot tijdens de ontwikkeling. Hier laten we zien het gebruik van een in-ovo voorbereiding op mogelijke interacties tussen verschillende eiwitten in de ontwikkeling te pakken door het plaatsen van kralen op E2.5 kippenembryo's.

Het plaatsen van Growth Factor-Coated Kralen op Early Stage kippenembryo&#39;s

Neurale inductie is de eerste stap in de vorming van de hersenen. Het is een mechanisme waarmee Hensen's node (organisator), instrueert aangrenzend weefsel aan te nemen een neurale lot, dat wil zeggen om aanleiding te geven aan het zenuwstelsel. Deze video toont een test voor neurale inductie bij kippenembryo.

Test voor Neurale Inductie in het kippenembryo

Het kuiken chorion-membraan (CAM) is een uniek, natuurlijk immunodeficiënte ondersteunende cultuur omgeving om angiogenese en tumorigenese studie. Deze video artikel demonstreert de verschillende stappen in het...

Kuiken Ex ovo Cultuur en Ex ovo CAM test: Hoe het echt werkt

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatie techniek die is ontworpen om de signalering en patroonvorming eigenschappen van de oppervlakte Cephalic ectoderm tijdens de craniofaciale ontwikkeling test.

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

Source: Delalande, J., et.al. Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the transplantation of a GFP-labeled donor neural tube from a stage-matched transgenic chicken embryo into a recipient embryo at the level of somites one to seven, followed by vascular labeling using a lipophilic fluorescent dye. The combined approach allows for direct...

Visualization of Neural and Vascular Networks in a Chicken Embryo

Het bekijken en toegang krijgen tot het kippenembryo tijdens de ontwikkeling kan een uitdaging zijn. We hebben een ex ovo methode ontwikkeld die eenvoudig, kosteneffectief is en gemakkelijk kan worden gebruikt in een klaslokaal of onderzoeksomgeving. Deze methode biedt toegang tot het embryo tot in de late stadia van de embryonale ontwikkeling (HH 40).

Geoptimaliseerd Ex-ovo Het kweken van kippenembryo's tot geavanceerde stadia van ontwikkeling

Hier melden we dubbele etikettering van neurale kuifcellen en bloedvaten met behulp van chickGFP neurale buis intraspecies enting in combinatie met intra-vasculaire DiI injectie. Deze experimentele techniek stelt ons in staat om tegelijkertijd de ontwikkeling van het NCC-afgeleide (enterische) zenuwstelsel en het vasculaire systeem te visualiseren en te bestuderen, tijdens organogenese.

Dual Labeling van neurale kuifcellen en bloedvaten in kippenembryo's met behulp van ChickGFP Neural Tube Enting en Carbocyanine Dye DiI Injection

De zebravis is een uitstekend modelsysteem voor genetische en ontwikkelingsstudies. Het implanteren van kralen is een waardevolle techniek voor weefselmanipulatie die kan worden gebruikt om ontwikkelingsmechanismen te onderzoeken door veranderingen in lokale cellulaire omgevingen te introduceren. Dit protocol beschrijft hoe microkralenimplantatie in de zebravis-embryo moet worden uitgevoerd.

Microkraal Implantatie in de zebravis embryo

Protocollen die ondoordringbare barrières gebruiken om inductie-evenementen te blokkeren tussen weefsels van de hoofdlichaamsas en de flank in het kippenembryo, die nodig zijn voor ledeformatie, worden beschreven. Kralen gedrenkt in kandidaat-inductieve signalen worden gebruikt om het effect van barrièreplaatsing te overwinnen en analyse van genexpressie bevestigt dit.

Toepassing van Waterdicht Barrières In combinatie met de kandidaat-Factor Soaked Beads om Inductive Signalen studie in de Chick

Recombinante ledematen zijn een krachtig experimenteel model dat het mogelijk maakt om het proces van celdifferentiatie en het genereren van patronen onder invloed van embryonale signalen te bestuderen. Dit protocol presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van recombinante ledematen met kippen ledemaat-mesodermale cellen, aanpasbaar aan andere celtypen verkregen uit verschillende organismen.

Kip recombinante ledematen test om morfogenese, patroonvorming en vroege stappen in celdifferentiatie te begrijpen

De geweekte kraaltest omvat gerichte toediening van testreagens op elk ontwikkelingstijdpunt om de regulatie van celdifferentiatie en morfogenese te bestuderen. Een gedetailleerd protocol, toepasbaar op elk proefdiermodel, voor het bereiden van drie verschillende soorten geweekte kralen en het implanteren hiervan in de interdigit van een kippenembryo wordt gepresenteerd.

Analyse van celdifferentiatie, morfogenese en patronen tijdens kippenembrogenese met behulp van de soaked-bead assay

Leer hoe u kralen ent in kippenembryo's om de effecten van groeifactoren en inhibitoren op genexpressie in ledematen te onderzoeken. Deze methode biedt waardevolle inzichten in signaaltransductieprocessen.

Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression (Video) | JoVE Journal

Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression

Meer video's verkennen