Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression

Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe de effecten van groeifactoren en inhibitoren op de genexpressie in ontwikkelende ledematen van kippenembryo's kunnen worden bepaald. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals de manier waarop signaleringsmoleculen de groei en differentiatie van cellen in vivo beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een methode biedt om deze factoren direct in het embryo te testen.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de ontwikkeling van de ledematen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals neuraal weefsel, somieten of gastrulatie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Rebeea Mohammed, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin met het overbrengen van één milliliter van de kralen uit de oorspronkelijke voorraadoplossing naar een nieuwe buis.

Laat de kraaltjes bezinken, verwijder vervolgens de vloeistof en vervang deze door één milliliter PBS. Herhaal deze stap vijf keer en bewaar de gewassen kraaltjes bij vier graden Celsius als suspensie in PBS. Selecteer de kraaltjes voor het enten door ze met een 20 microliter pipette uit de gewassen voorraadoplossing te halen en in één milliliter PBS te plaatsen.

Kies met een stereomicroscoop kralen met een diameter van ongeveer 100 microns. Draag de geselecteerde kralen in twee micro-liters vloeistof over naar een nieuwe Petrischaal met een druppel van 20 milliliter PBS Next, en verwijder het PBS van de kralen. Doe dit eerst met een 20 micro-liter pipette, en verwijder vervolgens de resterende vloeistof door capillaire werking met een fijne horlogemakerspincet.

Het is belangrijk om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen, zodat de groeifactor niet wordt verdund wanneer deze aan de beads wordt toegevoegd. Pipetteer de groeifactor direct op de beads. Voeg voor FGF18 0,5 µL recombinant FGF18 toe, gereconstitueerd in 0,5 mg/mL in PBS met 0,1% BSA.

Plaats vervolgens enkele druppels water langs de randen van de schaal om te voorkomen dat de vloeistof verdampt. Incubeer de kraaltjes vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder na incubatie de waterdruppels uit de schaal met een Pasteurpipet en plaats de schaal op ijs.

Derivatiseer de kralen door eerst met een spatel de kralen over te brengen naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens één milliliter 0,2 normaal mierenzuur toe en incubeer de kralen in het zuur op een schudplatform gedurende één uur. Laat de kralen daarna bezinken, verwijder het mierenzuur en vervang dit door één milliliter water.

Was de kraaltjes gedurende één uur op het schudplatform en herhaal het wassen zes keer om eventuele resterende mierenzuur te verwijderen. Verwijder na de laatste wasbeurt de resterende vloeistof en bewaar de kraaltjes bij vier graden Celsius. Gebruik een spatel om een kleine hoeveelheid kraaltjes van ongeveer vijf tot tien µL uit de voorraad te halen en plaats de kraaltjes in een Petri-schaal van 30 milliliter.

Voeg vervolgens één milliliter DMSO toe. Gebruik daarna een P2-pipet ingesteld op twee microliter om kralen met een diameter van ongeveer 100 micron over te brengen naar een druppel oplosmiddel van 20 microliter in een andere Petri-schaal van 30 milliliter. Verwijder het grootste deel van het oplosmiddel met een 20 microliter pipet en het resterende oplosmiddel met een pipet van twee microliter.

Bedek de kralen vervolgens met 20 µL van het toe te passen geneesmiddel, opgelost in DMSO. Incubeer de kralen gedurende één uur in de geneesmiddeloplossing. Bescherm de kralen tegen licht, aangezien veel geneesmiddelmoleculen lichtgevoelig zijn.

Om de beads beter zichtbaar te maken, brengt u vier tot vijf beads in 2 µL vloeistof over naar 20 µL twee procent fenolrood opgelost in water. Verwijder één enkele bead met een fijne horlogemakerspincet en spoel de bead met PBS. Laat de beads niet langer dan 15 minuten in de fenolrood-oplossing liggen voordat u ze spoelt, omdat dit kan leiden tot verlies van activiteit.

Knip fijne wolfraamdraad in stukken van drie tot vier centimeter. Steek vervolgens een stuk van de draad in het uiteinde van een glazen Pasteurpipet en smelt deze vast met een Bunsenbrander om de positie te fixeren. Bereid tot 10 naalden voor om er reserve te hebben als ze beschadigd raken. Plaats vervolgens het uiteinde van de draad in de vlam van een brander en houd deze daar totdat het wolfraam witgloeiend wordt en de punt scherp is.

Dit duurt ongeveer twee tot drie minuten. Voeg vijf tot zes druppels India-inkt voor kunstenaars toe aan 15 milliliters PBS met 100 units Penicilline en 0,1 milligram Streptomycine per milliliter. Om de kippenembryo's voor te bereiden, worden de eieren met de stompe zijde naar boven geïncubeerd totdat ze het gewenste stadium voor de meeste manipulaties van de ledemaatknop hebben bereikt, wat doorgaans drie tot vijf dagen is.

Wanneer het gewenste tijdstip is bereikt, tik dan met stompe pincetten tegen de stompe zijde van het ei om de schaal te breken. Gebruik vervolgens de pincetten om de schaal te verwijderen en het embryo bloot te leggen. Zorg ervoor dat het celmembraan van het ei ook wordt verwijderd.

Om het embryo te visualiseren, injecteert u PBS aangevuld met een paar druppels vloeibare India-inkt onder het embryo met een spuit van één milliliter en een naald van 21 gauge. Het vitellijnmembraan boven het embryo kan vervolgens met een fijne pincet worden verwijderd. Voeg daarna twee tot drie milliliter aangevulde PBS met één procent foetaal kalfserum, 100 units per milliliter penicilline en 0,1 milligram per milliliter streptomycine toe aan het ei om te voorkomen dat het embryo uitdroogt.

Open met verscherpte horlogemakerpincetten het amnion boven de ontwikkelende ledemaatknoppen. In deze stadia zal het embryo doorgaans draaien, zodat de rechterzijde bovenaan komt te liggen. Voorkom dat het embryo uitdroogt door indien nodig extra aangevulde PBS-oplossing toe te voegen.

Het amnion rondom het embryo kan worden geopend met een fijne wolfraamnaald om het ontwikkelende ledemaat bloot te leggen. Gebruik vervolgens de aangescherpte wolfraamdraad om een incisie te maken in de ledemaatknop op de plaats waar de bead zal worden geïmplanteerd. Vermijd het waar mogelijk om volledig door de ledemaatknop heen te snijden.

Hoewel dit in jongere stadia moeilijk is. Pak een kraal, gecoat met ofwel de groeifactor of het medicijn, op met extra fijne horlogemakerspincetten. Als de kraal is geweekt in DMSO of fenolrood, zorg er dan voor dat deze wordt gespoeld met PBS voordat deze op het embryo wordt aangebracht.

Breng de kraal met de pincet over naar het embryo en gebruik vervolgens de aangescherpte wolfraamdraad om de kraal in de incisielocatie te plaatsen. Voeg nog één tot twee milliliter van de aangevulde PBS-oplossing toe aan het ei om ervoor te zorgen dat het embryo gehydrateerd blijft. Vermijd het direct aanbrengen van de oplossing op het embryo zelf, omdat dit het embryo kan beschadigen en ertoe kan leiden dat de kraal losraakt.

Gebruik vervolgens een spuit van tien milliliter, uitgerust met een naald van 19 gauge, om slechts zoveel albumine te verwijderen als nodig is om te voorkomen dat het embryo in contact komt met de tape die wordt gebruikt om het ei af te dichten. Zorg ervoor dat de naald het eigeel niet beschadigt door deze langs de binnenzijde van de schaal naar beneden te schuiven. Sluit het ei tot slot af met tape en plaats het terug in de incubator.

Om te bevestigen dat FGF18 in staat is om via MEK ERK te fosforyleren, werden de embryo's één uur na het enten van de kraaltjes geoogst en immunogekleurd voor de aanwezigheid van gefosforyleerd ERK, wat zichtbaar is rondom het geënte kraaltje in de afbeelding rechts. In HH-stadium 21 wordt MyoD niet tot expressie gebracht in ontwikkelende ledemaat-myoblasten. Kleuring is echter wel zichtbaar in het myotoom van de ontwikkelende somieten.

Zes uur na een FGF18-beadtransplantaat kan worden waargenomen dat MyoD wordt geïnduceerd in myoblasten dicht bij de bead. Terwijl er geen expressie is in het contralaterale ledemaat. Deze expressie kan worden geremd door gelijktijdig een bead te transplanteren die is gecoat met een MEK-remmer zoals U0126.

Op vergelijkbare wijze vermindert het enten van een U0126-kraal bij HH-stadium 21 de endogene expressie van MyoD na 24 uur, vergeleken met de onbehandelde contralaterale ledemaat. In ledemaatknoppen, bij HH-stadium 19, induceert FGF18 geen MyoD. Co-enten van kralen gedrenkt in FGF18 en een retinoïnezuurantagonist kan dit echter overwinnen, waarna ectopische MyoD wordt gedetecteerd.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie tot vier minuten worden uitgevoerd, mits deze correct wordt toegepast. De ontwikkeling van deze techniek stelde onderzoekers op het gebied van de ontwikkelingsbiologie in staat om groeifactorsignalering bij embryo-ontwikkeling te onderzoeken. Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om erop te letten dat het embryo niet uitdroogt.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe kralen in ontwikkelende embryo's kunnen worden geënt om te bepalen hoe signalering door groeifactoren de ontwikkeling beïnvloedt.