Optogenetische Functionele MRI

Het algemene doel van deze beeldgevingsprocedure is om fMRI te combineren met optogenetische stimulatie voor celtype-specifieke mapping van functionele neurale circuits en hun dynamiek in het gehele levende brein. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neurowetenschappen, zoals het bepalen van de rol van specifieke elementen in hersencircuits bij het aansturen van de globale hersenactiviteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het celtype-specifieke stimulatie mogelijk maakt en een relatief hoge ruimtelijke resolutie biedt voor het uitlezen van de globale hersenactiviteit.

Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Jia Liu en Zhongnan Fang, promovendi in mijn laboratorium. Nadat het dier is geanestheseerd zoals beschreven in het tekstprotocol, scheert u de kop met een elektrische scheermachine en voert u een drievoudige chirurgische scrub uit op de huid met Betadine en een spoeling van 70% ethanol. Immobiliseer vervolgens de schedel van het dier in een stereotaxisch apparaat.

Gebruik een scalpel om een midline scalpincisie van 15 tot 20 millimeter te maken. Retraheer de hoofdhuid met behulp van chirurgische hemostaten die aan het periosteum zijn bevestigd. Identificeer de locaties van Lambda en Bregma op de schedel en positioneer vervolgens de boorbit boven de regio van belang, of ROI.

Boor een kleine craniotomie boven de ROI met een tandartsboor, waarbij u er zorg voor draagt het brein niet te puncteren. Voer langzaam een naald, bevestigd aan een microliter-spuit, via de craniotomie in de ROI in het brein. Gebruik vervolgens een controller voor een microspuitpomp om twee microliters van de vectoroplossing in de ROI te injecteren.

Nadat de injectie is voltooid, wacht u 10 minuten en verwijder dan langzaam de spuit met een snelheid van 0,5 millimeter per minuut. Droog na de injectie het oppervlak van de schedel. Bevestig de coördinaten voor de ROI en voeg het ferrule-implantaat in tot de doeldiepte met een snelheid van 0,5 millimeter per minuut.

Bevestig ten slotte het ferrule-implantaat aan de schedel met tandheelkundig cement. Nadat het tandheelkundig cement is gestold, sluit u de incisie met hechtingen rond de dop van het tandheelkundig cement. Begin met het aansluiten van de glasvezelpatchkabel op een laserlichtbron en meet de output aan de punt van de huls van de patchkabel met een powermeter.

Stel het juiste vermogensniveau in om de gewenste output te genereren aan de punt van de glasvezelkabel, die in de hersenen is geïmplanteerd. Voorkom lichtlekkage vanuit het implantaat door de ogen van het dier af te dekken. Plaats vervolgens de spoel over de kop van het dier.

Gebruik een ferrule-huls om de glasvezelkabel in de ferrule-implantaat te fixeren. Plaats de houder met het dier in de boring van de scanner. Bewaak gedurende het gehele experiment de ademhalingsfrequentie, het getijdenvolume van CO2 en de lichaamstemperatuur door de kunstmatige beademing aan te passen om de fysiologische waarden binnen de juiste grenzen te houden.

Sluit de BNC-kabels van de triggerpoort van de MRI-scanner aan op de functiegenerator. Selecteer een positioneringssequentie en klik op 'scan' in het bedieningsvenster. Klik op 'continue' om de locatie van de kop van het dier in beeld te brengen.

Als de hersenen zich niet in het isocentrum bevinden, pas dan de positie van de kop van het dier aan en herhaal de positioneringsscan totdat de hersenen in het isocentrum liggen. Neem een anatomisch beeld met een hoge resolutie op om de algemene integriteit van de hersenen te controleren en om de locatie van het optische vezelimplant te bevestigen. Selecteer vervolgens een T2-gewogen sequentie.

Pas het aantal coupes aan en klik vervolgens op 'scan' om de T2-gewogen coronale anatomische beelden met hoge resolutie te verkrijgen. Selecteer tot slot een multi-slice gradient recalled echo-sequentie en klik op 'continue' om het functionele beeld te verkrijgen. Dit protocol maakt gebruik van optogenetische fMRI om de motorische cortex in een diermodel te stimuleren.

Deze activatiekaart toont geactiveerde voxels in de motorische cortex en de thalamus, wat wijst op lange-afstands synaptische verbindingen tussen deze regio's. Hier wordt het sterke signaal getoond voor actieve voxels in de motorische cortex en de thalamus tijdens optogenetische stimulatie van de motorische cortex. De hemodynamische responsfunctie van de thalamus vertoont een vertraagde respons ten opzichte van de respons in de motorische cortex na stimulatie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u implantatiechirurgie en optogenetische functionele magnetische resonantie-imaging uitvoert. Zodra deze imagingprocedure onder de knie is, kan deze in twee uur worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het zeer belangrijk om het dier te monitoren en de fysiologie binnen de normale grenzen te houden.

Na deze procedure kunnen aanvullende methoden worden gebruikt, zoals elektrofysiologie om de temporele dynamiek van neuroactiviteit te onderzoeken, of immunohistochemie om de expressie en specificiteit van de opsine te valideren. De ontwikkeling van deze techniek maakte het voor neurowetenschappers mogelijk om de functionele connectiviteit in een intact, levend brein te onderzoeken. Vergeet niet dat werken met een MRI-scanner extreem gevaarlijk kan zijn.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het op voldoende afstand van de scanner houden van magnetische apparatuur.