Optogenetische Functionele MRI

Het algemene doel van deze beeldvormingsprocedure is om F-MRI te combineren met optogenetische stimulatie voor celtype-specifieke kartering van functionele neurale circuits en hun dynamica in de gehele levende hersenen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in de neurowetenschappen, zoals het bepalen van de rol van specifieke hersencircuit-elementen bij het aansturen van globale hersenactiviteit. Het grote voordeel van deze techniek is dat het celtype-specifieke stimulatie en relatief hoge ruimtelijke resolutie-uitlezing van globale hersenactiviteit mogelijk maakt.

Deze procedure wordt gedemonstreerd door Jia Liu en Zhongnan Fang, afgestudeerde studenten in mijn laboratorium. Nadat het dier is verdoofd zoals beschreven in het tekstprotocol, scheer het hoofd met een elektrische scheermachine en voer een drievoudige chirurgische scrub op de huid uit met Betadine en een 70% ethanol spoeling. Bevestig vervolgens de schedel van het dier in een stereotactische inrichting.

Gebruik een scalpel om een middenlijn-schedelsnede van 15 tot 20 millimeter te maken. Trek de schedel terug met chirurgische hemostatis die aan het periosteum is bevestigd. Identificeer de Lambda en Bregma locaties op de schedel, en positioneer vervolgens de boorsnijder boven het gebied van interesse, of ROI.

Boor een kleine craniotomie boven het ROI met een tandheelkundige boor, zorg ervoor dat u de hersenen niet puncteert. Breng langzaam een naald aangebracht op de microlieterspuit in de craniotomie door de ROI in de hersenen. Gebruik vervolgens een microsyringe pomp controller om twee microliters van de vectoroplossing in de ROI te injecteren.

Nadat de injectie is voltooid, wacht u 10 minuten en verwijdert u vervolgens langzaam de spuit met een snelheid van 0,5 millimeter per minuut. Droog na de injectie het oppervlak van de schedel. Bevestig de coördinaten voor de ROI en plaats het ferrule implantaat tot de doeldiepte met een snelheid van 0,5 millimeter per minuut.

Monteer ten slotte het ferrule implantaat op de schedel met behulp van tandheelkundig cement. Nadat het tandheelkundig cement is uitgehard, verzegelt u de incisie met hechtingen rond de tandheelkundige cementkap. Begin met het aansluiten van de glasvezel patchkabel op een laserlichtbron, en meet de output aan de punt van de patchkabel met een vermogensmeter.

Pas het juiste vermogensniveau aan om de gewenste output te produceren aan de punt van de glasvezelkabel, die in de hersenen is geïmplanteerd. Voorkom lichtlekkage uit het implantaat door de ogen van het dier te bedekken. Plaats vervolgens de spoel over het hoofd van het dier.

Gebruik een ferrulehuls om de glasvezelkabel vast te houden aan het ferrule implantaat. Plaats de wieg met het dier in de boor van de scanner. Bewaak de ademhalingssnelheid en de CO2 in het ademvolume en de lichaamstemperatuur gedurende het hele experiment door de kunstmatige ventilator aan te passen om de fysiologische waarden binnen de juiste limieten te houden.

Verbind BNC-kabels van de triggerpoort van de MRI-scanner naar de functiegenerator. Selecteer een positioneringssequens en klik op 'scannen' in het bedieningsvenster. Klik op 'doorgaan' om de locatie van het hoofd van het dier te beeldvormen.

Als de hersenen niet op het isocentrum staan, pas dan de locatie van het dierenhoofd aan en herhaal de positioneringsscan tot de hersenen op het isocentrum staan. Verwerf een hoog-resolutie anatomische afbeelding om de algehele integriteit van de hersenen te controleren en om de locatie van de optische vezelimplantatie te bevestigen. Selecteer vervolgens een T2 gewogen sequentie.

Pas het aantal plakken aan en klik vervolgens op 'scannen' om de T2 gewogen hoog-resolutie coronale anatomische beelden te verkrijgen. Selecteer ten slotte een multi-slice gradient recalled echo-sequentie en klik op 'doorgaan' om het functionele beeld te verkrijgen. Dit protocol gebruikt optogenetisch F-MRI om de motorische cortex in een diermodel te stimuleren.

Deze activeringskaart toont geactiveerde voxels in de motorische cortex en thalamus, wat duidt op lange-afstands synaptische verbindingen tussen deze regio's. Hier wordt het bold signaal getoond voor actieve voxels in de motorische cortex en thalamus tijdens optogenetische stimulatie van de motorische cortex. De thalamus hemodynamische responsfunctie toont een vertraagde respons ten opzichte van de respons in de motorische cortex na stimulatie.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van het uitvoeren van implantatieoperaties en optogenetisch functionele magnetische resonantie beeldvorming. Eenmaal beheerst, kan deze beeldvormingsprocedure in twee uur worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het zeer belangrijk om het dier te bewaken en zijn fysiologie binnen de normale grenzen te houden.

Na deze procedure kunnen aanvullende methoden worden gebruikt, zoals elektrofysiologie om de temporele dynamica van neuroactiviteit te onderzoeken, of immunohistochemie om de expressie en specificiteit van de opsine te valideren. De ontwikkeling van deze techniek heeft neurowetenschappers de weg geopend om functionele connectiviteit in een intacte, levende hersenen te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met een MRI-scanner uiterst gevaarlijk kan zijn.

Voorzorgen zoals het houden van magnetisch gereedschap voldoende ver van de scanner moeten altijd worden genomen bij het volgen van deze procedure.