Lotgevallen Toewijzing
Ontwikkelingsbiologen gebruiken fate mapping als een hulpmiddel om celstammen te traceren terwijl een organisme volwassen wordt. Dit wordt gedaan door cellen in een embryonaal stadium te labelen en vervolgens ze en hun nakomelingen doorheen de ontwikkeling van het organisme te volgen. Fate mapping wordt ook gebruikt om celmigratie en differentiatie tijdens de ontwikkeling te bestuderen, evenals regeneratie en herstel tijdens de volwassenheid.
Deze video geeft een overzicht van fate mapping, legt een protocol uit dat wordt gebruikt om een fate map in zebravissen te genereren en toont enkele manieren waarop deze techniek momenteel in laboratoria wordt toegepast.
Voordat we ingaan op de procedurele details, laten we bespreken wat een fate map is en hoe deze wordt opgesteld.
In klassieke fate mapping experimenten, kleuren wetenschappers groepen cellen in een vroeg embryo, zoals die in het gastrulastadium, met een kleurstof die zou worden overgedragen aan alle afstammelingen van deze cellen. Na een bepaalde ontwikkelingsperiode van het embryo, bekeken ze de gekleurde cellen in het meer volwassen organisme. De locatie van de gekleurde cellen in het volwassen organisme werd vervolgens genoteerd. Gecombineerde resultaten van verschillende soortgelijke experimenten maakten de constructie van een diagram mogelijk dat bekend staat als een fate map.
Daarom is een fate map een algemeen plan dat het lot van elk deel van een vroeg embryo schetst. Deze kaarten helpen wetenschappers om dingen te bepalen zoals welke embryonale cellen zich ontwikkelen tot welke functionele volwassen cellen en hoe ze migreren en zich organiseren tot volwassen structuren.
Wetenschappers hebben veel modelorganismen gebruikt om fate maps te creëren, inclusief kikkers, nematoden, vissen, kuikens en muizen. Sommige modelorganismen, zoals de zebravis Danio rerio, hebben een extra voordeel bij dit type experiment. Omdat ze klein zijn en gedurende een groot deel van het ontwikkelingsproces transparant blijven, kunnen wetenschappers cellen gemakkelijk volgen door de vissen onder een lichtmicroscoop te bekijken. Belangrijk is dat vooruitgang in cellabelingtechnieken het nu mogelijk maakt om enkele cellen nauwkeurig te markeren en ze te traceren terwijl het organisme zich ontwikkelt, wat helpt bij het creëren van een uiterst gedetailleerde fate map.
Nu je een idee hebt van wat fate maps zijn, laten we een protocol bespreken voor fate mapping in zebravissen dat fotoactivering gebruikt. Deze relatief nieuwe aanpak is afhankelijk van fotoactiveerbare eiwitten. Dit zijn speciale fluorescente eiwitten, die "gekooiend" zijn, wat betekent dat ze in een specifieke conformatie worden gehouden om fluorescentie te voorkomen. Een toepassing van een gecontroleerde laserpuls veroorzaakt een conformationele verandering, ook wel "ontkooien" genoemd, die resulteert in zichtbare fluorescentie.
Om dit experiment uit te voeren, worden deze gespecialiseerde gekooide eiwitten eerst gesynthetiseerd en vervolgens geïnjecteerd in zebravisembryo's in het enkele of dubbele celstadium. Vervolgens laten de wetenschappers de embryo's volwassen worden tot het gewenste ontwikkelingsstadium vóór fotoactivering.
Vervolgens, om de vissen voor te bereiden op fotoactivering, worden de embryo's gedecorioneerd om het doelweefsel toegankelijk te maken. Vervolgens worden ze gemonteerd in een optisch helder medium, zoals agarose met een lage smelttemperatuur, dat ze veilig in een vaste positie houdt. De monsters worden uitgelijnd om het gebied van belang bloot te leggen en op een laser-uitruste microscoop gemonteerd. Een laserpuls wordt toegepast op het doelgebied dat cellen van belang bevat, wat fotoactivering induceert.
Na de laserbehandeling worden embryo's voorzichtig uit de agarose verwijderd en teruggezet in hun natuurlijke omgeving totdat het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt. Om de fotogeactiveerde cellen te traceren, worden embryo's opnieuw in agarose met een lage smelttemperatuur ingebed en kunnen de fotogeactiveerde cellen vervolgens worden gevisualiseerd en getraceerd met behulp van directe fluorescentie of immunokleuring.
Nu je een algemeen begrip hebt van een fate mapping protocol, laten we eens kijken naar een paar laboratoriumexperimenten die gebruik maken van deze procedure.
Naast het bestuderen van embryonale ontwikkeling, kan fate mapping worden gebruikt om reparatie in volwassen systemen te onderzoeken. In dit experiment werd een specifiek celsubtype afgebroken van een transgenisch zebravisretina. Wetenschappers traceerden vervolgens genetisch gelabelde residente volwassen stamcellen om hun lot na verwonding te bepalen. Ten slotte werd een beeldanalyse uitgevoerd, die activering van volwassen stamcellen en daaropvolgende weefselreparatie aantoonde.
Wetenschappers gebruiken ook vergelijkbare protocollen om de loten van getransplanteerde stamcellen te begrijpen. Hier werden genetisch gelabelde menselijke embryonale stamcellen, of hESC's, getransplanteerd in een immuungecompromitteerde muismodel. De geïmplanteerde cellen werden 8-12 weken lang gedurende differentiatie toegestaan, waarna de resulterende teratoom, een tumor die weefsel van meerdere kiembladen bevat, werd geoogst, gefixeerd en geïmmunokleurigd om het lot van de geïmplanteerde stamcellen te bepalen. Dit type experiment helpt wetenschappers om het differentiatiepotentieel in vivo van gekweekte stamcellen te bevestigen.
Zoals eerder vermeld, voeren wetenschappers fate mapping procedures uit in verschillende modelorganismen, inclusief zoogdieren. In deze specifieke studie markeerden wetenschappers cellen in een specifiek gebied van een vroeg muisembryo met behulp van inductieve genetische benaderingen. Dit gebeurt door het toedienen van een inducerend middel aan een zwangere muis die genetisch gemodificeerde nakomelingen draagt. De gelabelde cellen werden gedurende latere ontwikkelingsstadia gevolgd, wat wetenschappers hielp om hun uiteindelijke lot te bepalen.
Je hebt net de video van JoVE over fate mapping bekeken. Deze video gaf wat inzicht in het maken van fate maps, besprak een specifiek fate mapping protocol en besprak enkele van de modificaties en toepassingen van deze uiterst nuttige techniek. Zoals altijd, bedankt voor het bekijken!
Lotbestemmingskaart maken is een techniek die wordt gebruikt om te begrijpen hoe embryonale cellen zich delen, differentiëren en migreren tijdens de o…
Ontwikkelingsbiologen gebruiken fate mapping als een hulpmiddel om celstammen te traceren terwijl een organisme volwassen wordt. Dit wordt gedaan door cellen in een embryonaal stadium te labelen en vervolgens ze en hun nakomelingen doorheen de ontwikkeling van het organisme te volgen. Fate mapping wordt ook gebruikt om celmigratie en differentiatie tijdens de ontwikkeling te bestuderen, evenals regeneratie en herstel tijdens de volwassenheid.
Deze video geeft een overzicht van fate mapping, legt een protocol uit dat wordt gebruikt om een fate map in zebravissen te genereren en toont enkele manieren waarop deze techniek momenteel in laboratoria wordt toegepast.
Voordat we ingaan op de procedurele details, laten we bespreken wat een fate map is en hoe deze wordt opgesteld.
In klassieke fate mapping experimenten, kleuren wetenschappers groepen cellen in een vroeg embryo, zoals die in het gastrulastadium, met een kleurstof die zou worden overgedragen aan alle afstammelingen van deze cellen. Na een bepaalde ontwikkelingsperiode van het embryo, bekeken ze de gekleurde cellen in het meer volwassen organisme. De locatie van de gekleurde cellen in het volwassen organisme werd vervolgens genoteerd. Gecombineerde resultaten van verschillende soortgelijke experimenten maakten de constructie van een diagram mogelijk dat bekend staat als een fate map.
Daarom is een fate map een algemeen plan dat het lot van elk deel van een vroeg embryo schetst. Deze kaarten helpen wetenschappers om dingen te bepalen zoals welke embryonale cellen zich ontwikkelen tot welke functionele volwassen cellen en hoe ze migreren en zich organiseren tot volwassen structuren.
Wetenschappers hebben veel modelorganismen gebruikt om fate maps te creëren, inclusief kikkers, nematoden, vissen, kuikens en muizen. Sommige modelorganismen, zoals de zebravis Danio rerio, hebben een extra voordeel bij dit type experiment. Omdat ze klein zijn en gedurende een groot deel van het ontwikkelingsproces transparant blijven, kunnen wetenschappers cellen gemakkelijk volgen door de vissen onder een lichtmicroscoop te bekijken. Belangrijk is dat vooruitgang in cellabelingtechnieken het nu mogelijk maakt om enkele cellen nauwkeurig te markeren en ze te traceren terwijl het organisme zich ontwikkelt, wat helpt bij het creëren van een uiterst gedetailleerde fate map.
Nu je een idee hebt van wat fate maps zijn, laten we een protocol bespreken voor fate mapping in zebravissen dat fotoactivering gebruikt. Deze relatief nieuwe aanpak is afhankelijk van fotoactiveerbare eiwitten. Dit zijn speciale fluorescente eiwitten, die "gekooiend" zijn, wat betekent dat ze in een specifieke conformatie worden gehouden om fluorescentie te voorkomen. Een toepassing van een gecontroleerde laserpuls veroorzaakt een conformationele verandering, ook wel "ontkooien" genoemd, die resulteert in zichtbare fluorescentie.
Om dit experiment uit te voeren, worden deze gespecialiseerde gekooide eiwitten eerst gesynthetiseerd en vervolgens geïnjecteerd in zebravisembryo's in het enkele of dubbele celstadium. Vervolgens laten de wetenschappers de embryo's volwassen worden tot het gewenste ontwikkelingsstadium vóór fotoactivering.
Vervolgens, om de vissen voor te bereiden op fotoactivering, worden de embryo's gedecorioneerd om het doelweefsel toegankelijk te maken. Vervolgens worden ze gemonteerd in een optisch helder medium, zoals agarose met een lage smelttemperatuur, dat ze veilig in een vaste positie houdt. De monsters worden uitgelijnd om het gebied van belang bloot te leggen en op een laser-uitruste microscoop gemonteerd. Een laserpuls wordt toegepast op het doelgebied dat cellen van belang bevat, wat fotoactivering induceert.
Na de laserbehandeling worden embryo's voorzichtig uit de agarose verwijderd en teruggezet in hun natuurlijke omgeving totdat het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt. Om de fotogeactiveerde cellen te traceren, worden embryo's opnieuw in agarose met een lage smelttemperatuur ingebed en kunnen de fotogeactiveerde cellen vervolgens worden gevisualiseerd en getraceerd met behulp van directe fluorescentie of immunokleuring.
Nu je een algemeen begrip hebt van een fate mapping protocol, laten we eens kijken naar een paar laboratoriumexperimenten die gebruik maken van deze procedure.
Naast het bestuderen van embryonale ontwikkeling, kan fate mapping worden gebruikt om reparatie in volwassen systemen te onderzoeken. In dit experiment werd een specifiek celsubtype afgebroken van een transgenisch zebravisretina. Wetenschappers traceerden vervolgens genetisch gelabelde residente volwassen stamcellen om hun lot na verwonding te bepalen. Ten slotte werd een beeldanalyse uitgevoerd, die activering van volwassen stamcellen en daaropvolgende weefselreparatie aantoonde.
Wetenschappers gebruiken ook vergelijkbare protocollen om de loten van getransplanteerde stamcellen te begrijpen. Hier werden genetisch gelabelde menselijke embryonale stamcellen, of hESC's, getransplanteerd in een immuungecompromitteerde muismodel. De geïmplanteerde cellen werden 8-12 weken lang gedurende differentiatie toegestaan, waarna de resulterende teratoom, een tumor die weefsel van meerdere kiembladen bevat, werd geoogst, gefixeerd en geïmmunokleurigd om het lot van de geïmplanteerde stamcellen te bepalen. Dit type experiment helpt wetenschappers om het differentiatiepotentieel in vivo van gekweekte stamcellen te bevestigen.
Zoals eerder vermeld, voeren wetenschappers fate mapping procedures uit in verschillende modelorganismen, inclusief zoogdieren. In deze specifieke studie markeerden wetenschappers cellen in een specifiek gebied van een vroeg muisembryo met behulp van inductieve genetische benaderingen. Dit gebeurt door het toedienen van een inducerend middel aan een zwangere muis die genetisch gemodificeerde nakomelingen draagt. De gelabelde cellen werden gedurende latere ontwikkelingsstadia gevolgd, wat wetenschappers hielp om hun uiteindelijke lot te bepalen.
Je hebt net de video van JoVE over fate mapping bekeken. Deze video gaf wat inzicht in het maken van fate maps, besprak een specifiek fate mapping protocol en besprak enkele van de modificaties en toepassingen van deze uiterst nuttige techniek. Zoals altijd, bedankt voor het bekijken!</
Ontwikkelingsbiologen gebruiken fate mapping als een hulpmiddel om celstammen te traceren terwijl een organisme volwassen wordt. Dit wordt gedaan door cellen in een embryonaal stadium te labelen en vervolgens ze en hun nakomelingen doorheen de ontwikkeling van het organisme te volgen. Fate mapping wordt ook gebruikt om celmigratie en differentiatie tijdens de ontwikkeling te bestuderen, evenals regeneratie en herstel tijdens de volwassenheid.
Deze video geeft een overzicht van fate mapping, legt een protocol uit dat wordt gebruikt om een fate map in zebravissen te genereren en toont enkele manieren waarop deze techniek momenteel in laboratoria wordt toegepast.
Voordat we ingaan op de procedurele details, laten we bespreken wat een fate map is en hoe deze wordt opgesteld.
In klassieke fate mapping experimenten, kleuren wetenschappers groepen cellen in een vroeg embryo, zoals die in het gastrulastadium, met een kleurstof die zou worden overgedragen aan alle afstammelingen van deze cellen. Na een bepaalde ontwikkelingsperiode van het embryo, bekeken ze de gekleurde cellen in het meer volwassen organisme. De locatie van de gekleurde cellen in het volwassen organisme werd vervolgens genoteerd. Gecombineerde resultaten van verschillende soortgelijke experimenten maakten de constructie van een diagram mogelijk dat bekend staat als een fate map.
Daarom is een fate map een algemeen plan dat het lot van elk deel van een vroeg embryo schetst. Deze kaarten helpen wetenschappers om dingen te bepalen zoals welke embryonale cellen zich ontwikkelen tot welke functionele volwassen cellen en hoe ze migreren en zich organiseren tot volwassen structuren.
Wetenschappers hebben veel modelorganismen gebruikt om fate maps te creëren, inclusief kikkers, nematoden, vissen, kuikens en muizen. Sommige modelorganismen, zoals de zebravis Danio rerio, hebben een extra voordeel bij dit type experiment. Omdat ze klein zijn en gedurende een groot deel van het ontwikkelingsproces transparant blijven, kunnen wetenschappers cellen gemakkelijk volgen door de vissen onder een lichtmicroscoop te bekijken. Belangrijk is dat vooruitgang in cellabelingtechnieken het nu mogelijk maakt om enkele cellen nauwkeurig te markeren en ze te traceren terwijl het organisme zich ontwikkelt, wat helpt bij het creëren van een uiterst gedetailleerde fate map.
Nu je een idee hebt van wat fate maps zijn, laten we een protocol bespreken voor fate mapping in zebravissen dat fotoactivering gebruikt. Deze relatief nieuwe aanpak is afhankelijk van fotoactiveerbare eiwitten. Dit zijn speciale fluorescente eiwitten, die "gekooiend" zijn, wat betekent dat ze in een specifieke conformatie worden gehouden om fluorescentie te voorkomen. Een toepassing van een gecontroleerde laserpuls veroorzaakt een conformationele verandering, ook wel "ontkooien" genoemd, die resulteert in zichtbare fluorescentie.
Om dit experiment uit te voeren, worden deze gespecialiseerde gekooide eiwitten eerst gesynthetiseerd en vervolgens geïnjecteerd in zebravisembryo's in het enkele of dubbele celstadium. Vervolgens laten de wetenschappers de embryo's volwassen worden tot het gewenste ontwikkelingsstadium vóór fotoactivering.
Vervolgens, om de vissen voor te bereiden op fotoactivering, worden de embryo's gedecorioneerd om het doelweefsel toegankelijk te maken. Vervolgens worden ze gemonteerd in een optisch helder medium, zoals agarose met een lage smelttemperatuur, dat ze veilig in een vaste positie houdt. De monsters worden uitgelijnd om het gebied van belang bloot te leggen en op een laser-uitruste microscoop gemonteerd. Een laserpuls wordt toegepast op het doelgebied dat cellen van belang bevat, wat fotoactivering induceert.
Na de laserbehandeling worden embryo's voorzichtig uit de agarose verwijderd en teruggezet in hun natuurlijke omgeving totdat het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt. Om de fotogeactiveerde cellen te traceren, worden embryo's opnieuw in agarose met een lage smelttemperatuur ingebed en kunnen de fotogeactiveerde cellen vervolgens worden gevisualiseerd en getraceerd met behulp van directe fluorescentie of immunokleuring.
Nu je een algemeen begrip hebt van een fate mapping protocol, laten we eens kijken naar een paar laboratoriumexperimenten die gebruik maken van deze procedure.
Naast het bestuderen van embryonale ontwikkeling, kan fate mapping worden gebruikt om reparatie in volwassen systemen te onderzoeken. In dit experiment werd een specifiek celsubtype afgebroken van een transgenisch zebravisretina. Wetenschappers traceerden vervolgens genetisch gelabelde residente volwassen stamcellen om hun lot na verwonding te bepalen. Ten slotte werd een beeldanalyse uitgevoerd, die activering van volwassen stamcellen en daaropvolgende weefselreparatie aantoonde.
Wetenschappers gebruiken ook vergelijkbare protocollen om de loten van getransplanteerde stamcellen te begrijpen. Hier werden genetisch gelabelde menselijke embryonale stamcellen, of hESC's, getransplanteerd in een immuungecompromitteerde muismodel. De geïmplanteerde cellen werden 8-12 weken lang gedurende differentiatie toegestaan, waarna de resulterende teratoom, een tumor die weefsel van meerdere kiembladen bevat, werd geoogst, gefixeerd en geïmmunokleurigd om het lot van de geïmplanteerde stamcellen te bepalen. Dit type experiment helpt wetenschappers om het differentiatiepotentieel in vivo van gekweekte stamcellen te bevestigen.
Zoals eerder vermeld, voeren wetenschappers fate mapping procedures uit in verschillende modelorganismen, inclusief zoogdieren. In deze specifieke studie markeerden wetenschappers cellen in een specifiek gebied van een vroeg muisembryo met behulp van inductieve genetische benaderingen. Dit gebeurt door het toedienen van een inducerend middel aan een zwangere muis die genetisch gemodificeerde nakomelingen draagt. De gelabelde cellen werden gedurende latere ontwikkelingsstadia gevolgd, wat wetenschappers hielp om hun uiteindelijke lot te bepalen.
Je hebt net de video van JoVE over fate mapping bekeken. Deze video gaf wat inzicht in het maken van fate maps, besprak een specifiek fate mapping protocol en besprak enkele van de modificaties en toepassingen van deze uiterst nuttige techniek. Zoals altijd, bedankt voor het bekijken!</
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a fate map and how do scientists construct one?
A fate map is a diagram outlining the fate of each part of an early embryo. Scientists construct fate maps by staining groups of cells in early embryos, such as gastrula stage cells, with dye that passes to all descendants. After allowing development, they note stained cell locations in mature organisms. Pooled results from multiple experiments create the complete fate map.
Q2: Why is zebrafish a preferred model organism for fate mapping experiments?
Zebrafish are ideal for fate mapping because they are small and remain transparent throughout much of development, allowing scientists to easily track cells under a light microscope. This transparency advantage, combined with advances in cell labeling techniques, enables precise marking of single cells and creation of extremely detailed fate maps during embryonic development.
Q3: How does photoactivation work in fate mapping protocols?
Photoactivation uses special fluorescent proteins that are caged, preventing fluorescence until activated. A controlled laser pulse causes uncaging, a conformational change that results in visible fluorescence. Scientists inject these photoactivatable proteins into early zebrafish embryos, then apply laser pulses to targeted cells at desired developmental stages to induce fluorescence and trace cell lineages.
Q4: What preparation steps are necessary before photoactivating embryonic cells?
Before photoactivation, embryos must be dechorionated to make target tissue accessible. They are then mounted in optically clear medium, such as low melting temperature agarose, which maintains steady positioning. Samples are aligned to expose the area of interest and mounted onto a laser-equipped microscope for precise photoactivation of targeted cells.
Q5: How can fate mapping be applied to study tissue repair in adult organisms?
Fate mapping can examine repair in mature systems by ablating specific cell subtypes and tracing genetically labeled resident adult stem cells to determine their fate following injury. Image analysis demonstrates activation of adult stem cells and subsequent tissue regeneration with somatic stem cells, revealing how stem cells respond to damage and contribute to healing.
Q6: What do scientists learn from transplanting labeled stem cells into animal models?
Scientists transplant genetically tagged human embryonic stem cells into immunocompromised mice and allow differentiation for 8-12 weeks. The resulting teratoma, a tumor containing tissue from multiple germ layers, is harvested and immunostained to determine implanted cell fate. This confirms the in vivo differentiative potential of cultured stem cells.
Q7: How do inducible genetic approaches enable fate mapping in mammalian embryos?
Scientists mark cells in specific regions of early mouse embryos using inducible genetic approaches by administering an inducing agent to pregnant mice carrying genetically modified offspring. Labeled cells are tracked throughout later developmental stages to determine their ultimate fate, providing detailed lineage information in mammalian development.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
0:48
Principles of Fate Mapping
2:38
Fate Mapping in Zebrafish Using Photoactivation
4:29
Applications
6:31
Summary