Lotgevallen Toewijzing

Ontwikkelingsbiologen gebruiken fate mapping als een hulpmiddel om celstammen te traceren terwijl een organisme volwassen wordt. Dit wordt gedaan door cellen in een embryonaal stadium te labelen en vervolgens ze en hun nakomelingen doorheen de ontwikkeling van het organisme te volgen. Fate mapping wordt ook gebruikt om celmigratie en differentiatie tijdens de ontwikkeling te bestuderen, evenals regeneratie en herstel tijdens de volwassenheid.

Deze video geeft een overzicht van fate mapping, legt een protocol uit dat wordt gebruikt om een fate map in zebravissen te genereren en toont enkele manieren waarop deze techniek momenteel in laboratoria wordt toegepast.

Voordat we ingaan op de procedurele details, laten we bespreken wat een fate map is en hoe deze wordt opgesteld.

In klassieke fate mapping experimenten, kleuren wetenschappers groepen cellen in een vroeg embryo, zoals die in het gastrulastadium, met een kleurstof die zou worden overgedragen aan alle afstammelingen van deze cellen. Na een bepaalde ontwikkelingsperiode van het embryo, bekeken ze de gekleurde cellen in het meer volwassen organisme. De locatie van de gekleurde cellen in het volwassen organisme werd vervolgens genoteerd. Gecombineerde resultaten van verschillende soortgelijke experimenten maakten de constructie van een diagram mogelijk dat bekend staat als een fate map.

Daarom is een fate map een algemeen plan dat het lot van elk deel van een vroeg embryo schetst. Deze kaarten helpen wetenschappers om dingen te bepalen zoals welke embryonale cellen zich ontwikkelen tot welke functionele volwassen cellen en hoe ze migreren en zich organiseren tot volwassen structuren.

Wetenschappers hebben veel modelorganismen gebruikt om fate maps te creëren, inclusief kikkers, nematoden, vissen, kuikens en muizen. Sommige modelorganismen, zoals de zebravis Danio rerio, hebben een extra voordeel bij dit type experiment. Omdat ze klein zijn en gedurende een groot deel van het ontwikkelingsproces transparant blijven, kunnen wetenschappers cellen gemakkelijk volgen door de vissen onder een lichtmicroscoop te bekijken. Belangrijk is dat vooruitgang in cellabelingtechnieken het nu mogelijk maakt om enkele cellen nauwkeurig te markeren en ze te traceren terwijl het organisme zich ontwikkelt, wat helpt bij het creëren van een uiterst gedetailleerde fate map.

Nu je een idee hebt van wat fate maps zijn, laten we een protocol bespreken voor fate mapping in zebravissen dat fotoactivering gebruikt. Deze relatief nieuwe aanpak is afhankelijk van fotoactiveerbare eiwitten. Dit zijn speciale fluorescente eiwitten, die "gekooiend" zijn, wat betekent dat ze in een specifieke conformatie worden gehouden om fluorescentie te voorkomen. Een toepassing van een gecontroleerde laserpuls veroorzaakt een conformationele verandering, ook wel "ontkooien" genoemd, die resulteert in zichtbare fluorescentie.

Om dit experiment uit te voeren, worden deze gespecialiseerde gekooide eiwitten eerst gesynthetiseerd en vervolgens geïnjecteerd in zebravisembryo's in het enkele of dubbele celstadium. Vervolgens laten de wetenschappers de embryo's volwassen worden tot het gewenste ontwikkelingsstadium vóór fotoactivering.

Vervolgens, om de vissen voor te bereiden op fotoactivering, worden de embryo's gedecorioneerd om het doelweefsel toegankelijk te maken. Vervolgens worden ze gemonteerd in een optisch helder medium, zoals agarose met een lage smelttemperatuur, dat ze veilig in een vaste positie houdt. De monsters worden uitgelijnd om het gebied van belang bloot te leggen en op een laser-uitruste microscoop gemonteerd. Een laserpuls wordt toegepast op het doelgebied dat cellen van belang bevat, wat fotoactivering induceert.

Na de laserbehandeling worden embryo's voorzichtig uit de agarose verwijderd en teruggezet in hun natuurlijke omgeving totdat het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt. Om de fotogeactiveerde cellen te traceren, worden embryo's opnieuw in agarose met een lage smelttemperatuur ingebed en kunnen de fotogeactiveerde cellen vervolgens worden gevisualiseerd en getraceerd met behulp van directe fluorescentie of immunokleuring.

Nu je een algemeen begrip hebt van een fate mapping protocol, laten we eens kijken naar een paar laboratoriumexperimenten die gebruik maken van deze procedure.

Naast het bestuderen van embryonale ontwikkeling, kan fate mapping worden gebruikt om reparatie in volwassen systemen te onderzoeken. In dit experiment werd een specifiek celsubtype afgebroken van een transgenisch zebravisretina. Wetenschappers traceerden vervolgens genetisch gelabelde residente volwassen stamcellen om hun lot na verwonding te bepalen. Ten slotte werd een beeldanalyse uitgevoerd, die activering van volwassen stamcellen en daaropvolgende weefselreparatie aantoonde.

Wetenschappers gebruiken ook vergelijkbare protocollen om de loten van getransplanteerde stamcellen te begrijpen. Hier werden genetisch gelabelde menselijke embryonale stamcellen, of hESC's, getransplanteerd in een immuungecompromitteerde muismodel. De geïmplanteerde cellen werden 8-12 weken lang gedurende differentiatie toegestaan, waarna de resulterende teratoom, een tumor die weefsel van meerdere kiembladen bevat, werd geoogst, gefixeerd en geïmmunokleurigd om het lot van de geïmplanteerde stamcellen te bepalen. Dit type experiment helpt wetenschappers om het differentiatiepotentieel in vivo van gekweekte stamcellen te bevestigen.

Zoals eerder vermeld, voeren wetenschappers fate mapping procedures uit in verschillende modelorganismen, inclusief zoogdieren. In deze specifieke studie markeerden wetenschappers cellen in een specifiek gebied van een vroeg muisembryo met behulp van inductieve genetische benaderingen. Dit gebeurt door het toedienen van een inducerend middel aan een zwangere muis die genetisch gemodificeerde nakomelingen draagt. De gelabelde cellen werden gedurende latere ontwikkelingsstadia gevolgd, wat wetenschappers hielp om hun uiteindelijke lot te bepalen.

Je hebt net de video van JoVE over fate mapping bekeken. Deze video gaf wat inzicht in het maken van fate maps, besprak een specifiek fate mapping protocol en besprak enkele van de modificaties en toepassingen van deze uiterst nuttige techniek. Zoals altijd, bedankt voor het bekijken!