Name: Meten Attachment en internalisering van influenza A-virus in A549 cellen door flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Leer hoe u hechting en internalisatie van influenza A-virus meet in A549 longepitheelcellen met behulp van flowcytometrie. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van virus-celinteracties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de Swiss National Science Foundation (31003A_135278) naar SSt. MOP is de begunstigde van een doctoraal subsidie ​​van het Fonds AXA Research. Wij danken Patricia Nigg voor hulp bij het ​​ontwerp van figuur 1.

Let op voor de start: Gebruik laminaire stroming kap en passende biocontainment bij het werken met levend virus. Hier beschrijven we de groei omstandigheden die geschikt zijn om de cultuur influenzavirusstam A / WSN / 33. Veelvoud van infectie (MOI) en incubatietijden kunnen variëren afhankelijk van virusstam gebruikt. 1. Bereiding van gebiotinyleerd A / WSN / 33 virus <ol><li> Seed Madin-Darby canine kindey (MDCK) cellen in een T175 cm2 kolf gebruikt Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (Pen / Strep). Kweekcellen bij 37 ° C tot ongeveer 70% confluentie bereikt. </li><li> Vóór infectie Verwijder medium en wassen cellen met met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH7.0-7.3) door toevoeging van een voldoende grote hoeveelheid om de cel monolaag bedekken. </li><li> Verwijder PBS en cellen te infecteren met A / WSN / 33 met een MOI van 10 -4. Verdun virus in PBS gesupplementeerd met 0,02 mg Mg2 +, 0,01 mg Ca 2+ &lt;/ sup&gt;, 0,3% runderserumalbumine (BSA) en 1% Pen / Strep (infectie-PBS). Gebruik een inoculum van 4 ml voor T175 cm2 kolf. </li><li> Incubeer de cellen 1 uur bij 37 ° C. Inoculum verwijderd door aspiratie en pipetteer 10 ml DMEM aangevuld met 0,3% BSA, 20 mM HEPES en 1% Pen / Strep in de kolf. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende ongeveer 3 dagen tot cytopathisch effect (CPE) zichtbaar is, en oogsten supernatant. CPE kan worden herkend als afronden van cellen gevolgd door onthechting en dood van cellen 14. </li><li> Spin supernatant bij 450 xg gedurende 5 min celresten te verwijderen. Transfer supernatant in een nieuwe Falcon-buis en herhaal deze stap nog een keer. Gooi de pellets. </li><li> Transfer supernatanten in ultracentrifuge buizen en onderlaag supernatanten met 5 ml 30% sucrose NTE verdund in buffer (10 mM Tris [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Evenwicht buizen voor ultracentrifugeren en vul met PBS om een ​​eind volume van 30 ml te bereiken. Spin Supernatants bij 112.398 xg (overeenkomend met 25.000 rpm gedurende een SW28 rotor) gedurende 90 min in een ultracentrifuge. </li><li> Verwijder voorzichtig supernatant door pipetteren en genieten viruspellet overnacht bij 4 ° C in 250 pi PBS. Resuspendeer pellet door en neer te pipetteren. Meet eiwitgehalte van gezuiverd virus door Bradford assay 15. </li><li> Gebruik een biotinylering kit genereren gebiotinyleerd A / WSN / 33. Volg de instructies van de fabrikant. </li><li> Kortom, voeg de juiste hoeveelheid biotine aan het gezuiverde virus en incubeer gedurende 2 uur op ijs. Transfer virus een ultracentrifuge buis en vul de buis met PBS om een ​​eind volume van 30 ml te bereiken. Spin virus bij 112.389 g gedurende 90 min in een ultracentrifuge. Verwijder supernatant door pipetteren en voeg 250 ul PBS. Genieten pellet gedurende de nacht bij 4 ° C. Aliquot en bewaar het gebiotinyleerde virus opgeslagen bij -80 ° C waar het stabiel voor minstens 24 maanden. NB: Het kan nuttig zijn om de titer van de gebiotinyleerde p bepalenreparatie van IAV door standaard plaque assay. Er moet echter worden opgemerkt dat het volgende protocol enige gebiotinyleerde virusdeeltjes meet. Resterende gebiotinyleerde deeltjes door onvolledige biotinylering zal bijdragen tot de infectieuze titer door plaque assay, maar niet het signaal gemeten in de vast- / internalisatie assay. </li></ol> 2. Bepaal de benodigde hoeveelheid Gebiotinyleerde Virus OPMERKING: Voor het vast- / internalisering test wordt uitgevoerd, is het belangrijk om de hoeveelheid gebiotinyleerd virus nodig om alle cellen van een monster besmetten bepalen. <ol><li> Cultuur en trypsinize A549 cellen volgens instructies van de fabrikant. Tel de cellen met behulp van een cel kamer. Pipetteer 200.000 A549 cellen in FACS buisjes deepwell. Spin 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet met 200 pi PBS. Koele cellen neer op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Bereid 5-voudige seriële verdunningen van de biotinylated virus voorraad in infectie-PBS. </li><li> Spin buizen die de cellen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet met 100 pi-virus bevatten infectie-PBS. Zoals mock controle gebruik infectie-PBS zonder gebiotinyleerd virus. Incubeer buizen op ijs gedurende 1 uur. </li><li> Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 ui PBS. Herhaal deze stap nog een keer. </li><li> Voor bevestiging, rotatie buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 100 pl 3,7% paraformaldehyde (PFA). Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Herhaal vervolgens wasstap in 2,4 beschreven). </li><li> Voor permeabilisatie, rotatie buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 100 pl PBS dat 0,5% Triton X-100. Incubeer gedurende 6 min bij RT. Herhaal vervolgens wasstap in 2,4 beschreven). </li><li> Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 50 pl 2% BSA verdund in PBS dat STV-Cy3. (Let op, de juiste concentratie van STV-Cy3 moet worden bepaald voordat het experiment te starten met een concentratie van 1:. 200 en test 2-voudige verdunningen tot 1:. 2400 In onze handen, een verdunning van 1: 1000 bewezen om optimaal.) </li><li> Incubeer 1 uur in het donker bij kamertemperatuur. Vervolgens herhaalt wasstap beschreven in 2.4, maar resuspendeer de pellet in 200 ul 2% BSA verdund in PBS. </li><li> Analyseer de monsters met flowcytometrie 16. Poort op de Cy3-positieve populatie. Kies de laagste concentratie van gebiotinyleerd virus waardoor het maximum aantal Cy3-positieve cellen in de populatie A549. </li></ol> 3. Bepaal de benodigde hoeveelheid Streptavidine Opmerking: De efficiëntie van het blokkeren van het signaal afkomstig van extracellulaire virus bepaalt het detectiebereik van de assay. Daarom is het belangrijk om de STV-Cy3 signaal zoveel mogelijk teniet. The benodigde hoeveelheid STV nodig is afhankelijk van de hoeveelheid van gebiotinyleerd virus voorraad gebruikt (bepaald in paragraaf 2). <ol><li> Volg de stappen 2,1-2,4, maar gebruik virus concentratie bepaald in punt 2. </li><li> Bereid vijfvoudige seriële verdunningen van STV verdund in PBS met 2% BSA en 0,1% natriumazide. </li><li> Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 50 ul STV verdunning. Zoals mock controle gebruik PBS met 2% BSA en 0,1% natriumazide zonder STV. Incubeer buizen voor 30 min op ijs. Vervolgens herhaalt wasstap beschreven in 2.4. </li><li> Volg de stappen 2,5-2,9. Voor de internalisatie assay kiezen voor de laagste concentratie STV resulteert in een sterke blok van de Cy3-signaal (in vergelijking met het monster waarin geen STV aanwezig was). Hiervoor kan het percentage CY3-positieve cellen of de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de Cy3 signaal gebruikt. Idealiter zou de Cy3 signaal STV-behandelde monsters zo dicht mogelijk bij het signaal van mock-geïnfecteerdcellen mogelijk. </li></ol> 4. Attachment / Internalizatie Assay OPMERKING: Zorg ervoor dat alle reagentia te bereiden voor aanvang van de test. Voor de drie controlegroepen gepresenteerd in de resultaten sectie (mock-geïnfecteerde cellen, neuraminidase voorbehandeld cellen en natriumazide behandelde cellen) kleine wijzigingen in het protocol vereist. <ol><li> Bereid 16 buizen deepwell elk 200.000 A549 cellen. Naast de experimentele set bestaande uit 4 tubes, zijn er 3 controle omstandigheden, die elk 4 tubes: mock-geïnfecteerde cellen, neuraminidase (NA) -pretreated cellen en natrium-azide behandelde cellen. Elke groep bestaat uit 4 tubes bestempeld als &quot;0 min&quot;, &quot;0 min + STV &#39;, &#39;30 min&#39;, &#39;30 min + STV &#39;. </li><li> Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 ui PBS. </li><li> Spin buizen bij 4 ° C bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 ul DMEM met 0,3% BSA, 20 mM HEPES en 1% penicilline-streptomycine (incubatiemedium). Incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C. OPMERKING: Bij de neuraminidase control: Gebruik bacteriële neuraminidase (sialidase bijvoorbeeld van Vibrio cholera) bij een concentratie van 200 mU / ml verdund in incubatiemedium om de cellen te resuspenderen. </li><li> Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 ui PBS. Herhaal deze stap nog een keer, daarna afkoelen buizen neer op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Spin buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 100 ul gebiotinyleerd virus (gebruik het virus concentratie bepaald in punt 2 verdund in infectie-PBS). Incubeer 1 uur op ijs. Vervolgens herhaalt wasstap beschreven in 2.4. LET OP: Voor de mock-geïnfecteerde controle: Gebruik infectie-PBS zonder virus. Voor natriumazide control: Gebruik virus infectie verdund in PBS, aangevuld met 0,1% natriumazide. </li><li> Proverwerking van de monsters na de infectie op het ijs: <ol><li> Voor het &quot;0 min&quot; monsters, volgt stap 2,5 en bewaar monsters bij 4 ° C tot de andere monsters worden gefixeerd. </li><li> Voor het &quot;0 min + STV&quot; monsters, rotatie buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 50 ul STV (gebruik de concentratie bepaald in punt 3) verdund in PBS met 2% BSA en 0,1% natriumazide (tot internalisatie te voorkomen tijdens het hanteren van het monster). Incubeer 30 min op ijs. Volg stap 2,4-2,5 en bewaar de monsters bij 4 ° C. </li><li> Voor de &#39;30 min &#39;samples, rotatie buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 gl PBS met 2% BSA. Incubeer 30 min bij 37 ° C. Volg stap 2,4-2,5 en bewaar de monsters bij 4 ° C. OPMERKING: Bij de natriumazide control: Gebruik PBS aangevuld met 2% BSA en 0,1% natriumazide voor 30 min incubatie bij 37 ° C. </li><li> Voor de &#39;30 min + STV monsters draaien buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 gl PBS met 2% BSA. Incubeer 30 min bij 37 ° C. Vervolgens, rotatie buizen bij 4 ° C gedurende 3 min bij 450 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 50 ul STV (gebruik de concentratie bepaald in punt 3) verdund in PBS met 2% BSA en 0,1% natriumazide (tot internalisatie te voorkomen tijdens het hanteren van het monster). Incubeer 30 min op ijs. Volg stap 2,4-2,5 en bewaar de monsters bij 4 ° C. OPMERKING: Bij de natriumazide control: Gebruik PBS aangevuld met 2% BSA en 0,1% natriumazide voor 30 min incubatie bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Volg de stappen 2,6-2,8 en monsters analyseren door flowcytometrie. Bepaal het percentage Cy3-positieve cellen in elk monster. </li><li> Bereken het percentage bevestigd virus en de relatieve hoeveelheid virus geïnternaliseerd. <ol><li> Om de hoeveelheid bijgevoegde virus te berekenen, gebruikt het percentage van Cy3-positive gated cellen of de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de Cy3 signaal. Ter vergelijking, ingesteld onbehandelde cellen tot 100% (figuur 4B). Opmerking: Het percentage bijgevoegde virus wordt beschreven door de &quot;0 min&quot; sample. </li><li> Om de hoeveelheid virus geïnternaliseerd berekenen, neemt de verhouding van de &quot;30 min + STV&quot; monster tot &quot;30 min&quot; sample (Figuur 5B). Opmerking: Zoals hierboven vermeld, kan het percentage positieve Cy3 gated cellen of de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de Cy3 signaal gebruikt. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+influenza+A+virus%3A+host+factors+and+antiviral+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virolog%22">Fields Virolog</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329(2011).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li>
<li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li>
<li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li>
<li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li>
<li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu%3A+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemothe%22%5BJournal%5D)">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li>
<li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li>
<li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death%2C+and+disease%22%5BJournal%5D)">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacey%2C+MG+%22Flow+Cytometry+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry Principles and Applications</a>. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).</li>
<li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Viro%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Ons protocol beschrijft een gemakkelijke manier van meten virusbinding en internalisatie onder toepassing van stroomcytometrie. Het maakt gebruik van gemerkte wildtype virus dat nabootst nauwer virusinfecties vergelijking met het gebruik van virus-achtige deeltjes (VLP). Terwijl onze protocol is geoptimaliseerd voor bevestiging en internalisering van IAV meten kan gemakkelijk worden aangepast voor andere virussen. Bovendien, als flowcytometrie wordt gebruikt voor het uitlezen, co-kleuringen eenvoudig worden toegevoegd a...

De vermelding van influenza A virus (IAV) is een meerstaps proces dat begint met de binding van het virus aan receptoren op het plasmamembraan van doelcellen 1. De receptor voor IAV is siaalzuur dat aanwezig is op een grote verscheidenheid aan glycoproteïnen en glycolipiden is. Het hemagglutinine (HA) -eiwit van IAV die in de virale omhulling bindt aan siaalzuur en daardoor medieert hechting van het virale deeltjes naar de plasmamembraan van doelwitcellen 2. Het virus komt in de cellen via clathrine-gemedieerde endocytose, maar ook alternatieve ingang trajecten, zoals macropinocytose, beschreven 06/03. De interactie tussen HA en siaalzuur lijkt voldoende te bemiddelen zowel bevestiging en triggering internalisatie van virale deeltjes 7 zijn. Toch hebben alternatieve ingang receptoren voorgesteld en hun rol in IAV binnenkomst worden momenteel onderzocht 1,8,9. Curteel wordt gestreefd naar gastheerfactoren die betrokken zijn in de virale levenscyclus met als doel het ontwikkelen dringend nieuwe antivirale therapieën 10-12 identificeren. Virusingang zou een gunstige stap voor het richten IAV groei om virale infectie te blokkeren in zijn vroegste punt. Meten verschillende stadia van IAV binnenkomst experimenteel is uitdagend gewoonlijk grote hoeveelheden virus moeten binnenkomende virus op te sporen. Bovendien, het detectiebereik veranderingen in virusingang alleen lineair door het ontbreken van virale replicatie. Dit onderstreept de behoefte aan assays met hoge gevoeligheid. De assay hier geïntroduceerde maakt detectie mogelijk van bijgevoegde virus op het celoppervlak en detectie van geïnternaliseerde virus in verhouding tot de totale hoeveelheid van cel-geassocieerd virus. Het gebruik van gebiotinyleerde wildtype virus maakt handig meting door middel van kleuring met STV-Cy3 en uitlezing door flowcytometrie. Gebiotinyleerde virus is koud-gebonden aan cels beslaglegging laten maar internalisatie van virale deeltjes te voorkomen. Cellen kunnen worden gefixeerd, permeabel en gekleurd met STV-Cy3 bijgevoegde virus te meten. Het signaal van extracellulaire, verbonden virions kunnen worden ingetrokken wanneer een blokkeringsstap wordt aangebracht voordat fixatie waarin de cellen worden geïncubeerd met niet-gemerkt streptavidine (STV). In een volgende stap, na binding van gebiotinyleerd IAV, temperatuur verschoven naar 37 ° C en internalisatie van virale deeltjes mag plaatsvinden. Geïnternaliseerde deeltjes worden beschermd tegen de binding van STV waardoor de discriminatie tussen extra- en intracellulaire virussen. Per experimentele conditie, zijn vier monsters vereist: &#39;0 min&#39;: Het eerste monster gelabeld &quot;0 min&quot;, om koud virus gebonden aan het celoppervlak te meten. &quot;0 min + STV De tweede monster gelabeld&quot; 0 min + STV &quot;, geeft de basislijn signaalintensiteit van het experiment. Bijgevoegde virus wordt geblokkeerd with STV en het signaal na kleuring met STV-Cy3 moet veel lager zijn in vergelijking met het &quot;0 min&quot; sample. &#39;30 Min &#39;: Het derde monster &#39;30 min&#39; bevat bevestigd en geïnternaliseerd virus vanwege de temperatuurverandering tot 37 ° C gedurende 30 min. &#39;30 Min + STV &#39;: De vierde monster, &#39;30 min + STV&#39; maatregelen de intracellulaire fractie van virussen. De STV blokkeringsstap wordt toegepast na de 30 min incubatieperiode. Hierdoor worden virale deeltjes aan het celoppervlak gebonden STV waarbij alleen geïnternaliseerd virussen vindt kleuring met STV-Cy3. De relatieve hoeveelheid virus geïnternaliseerd kan worden berekend als de verhouding van geïnternaliseerde virus (gemeten in de &#39;30 min + STV &quot;sample) gedeeld door de totale hoeveelheid virus (beschreven door &#39;30 min &#39;sample). Als controles raden we aan mock-geïnfecteerde cellen bevatten. Het signaal volgende STV-Cy3 kleuring van mock-geïnfecteerde cellen geeft de achtergrondals gevolg van de kleuringsprotocol. Hendel om IAV bevestiging is de voorbehandeling van cellen met bacteriële neuraminidase (NA). NA splitst siaalzuur van cellulaire glycoproteïnen, waardoor het verwijderen hechting receptoren van het celoppervlak. Natriumazide (SA) is een krachtige metabole remmer en blokkeert daarbij endocytose 13. Cellen behandeld met natriumazide moet positief voor virus bindend, maar negatief voor internalisatie zijn.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td><td>Fisher Scientific</td><td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&nbsp;</a></td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&nbsp;Lucerna chem&nbsp; Electron microscopy sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge tubes</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>bacterial neuraminidase/sialidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

meten attachment en internalisering van influenza a-virus in a549 cellen door flowcytometrie

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Hechting aan doelcellen gevolgd door internalisatie zijn de allereerste stappen van de levenscyclus van het influenza A-virus (IAV). We bieden hier een gedetailleerd protocol voor het meten van relatieve veranderingen in de hoeveelheid virale deeltjes die zich hechten aan A549-cellen, een menselijke longepitheelcellijn, evenals in de hoeveelheid deeltjes die in de cel worden geïnternaliseerd. We gebruiken gebiotineerde virussen die gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd na kleuring met Cy3-gelabelde streptavidine (STV-Cy3). We beschrijven de groei, zuivering en biotinylering van A/WSN/33, een veel gebruikte laboratoriumstam van IAV. Koud-gebonden gebiotineerde IAV-deeltjes op A549-cellen worden gekleurd met STV-Cy3 en gemeten met behulp van flowcytometrie. Om de opname van virale deeltjes te onderzoeken, wordt koud-gebonden virus toegestaan om te internaliseren bij 37 °C. Om onderscheid te maken tussen externe en geïnternaliseerde virale deeltjes, wordt een blokkeerfase toegepast: Vrije bindingsplaatsen op de biotine van het gehechte virus op het celoppervlak worden gebonden door ongelabelde streptavidine (STV). Vervolgens worden de cellen gepermeabiliseerd en gekleurd met STV-Cy3, waardoor detectie van geïnternaliseerde virale deeltjes mogelijk wordt. We presenteren een berekening om de relatieve hoeveelheid geïnternaliseerd virus te bepalen. Deze test is geschikt om effecten van geneesmiddelbehandelingen of andere manipulaties op hechting of internalisatie van IAV te meten.

Een cartoon beschrijving van de vier experimentele condities getoond in figuur 1 Resultaten van een representatief experiment zijn weergegeven in de figuren 2 -. 5. In de &quot;0 min&quot; sample, gebiotinyleerd virus koud gebonden aan cellen die kan worden gevisualiseerd door STV Cy3-kleuring gericht (figuren 1 en 2). Wanneer een blokkeringsstap (in de &quot;0 min + STV&quot; monster) wordt toegepast, kan virus op het ...

We presenteren een protocol dat een semi-kwantitatief methode beschrijft voor het meten van zowel de aanhechting van influenza A-virus aan A549-cellen als de internalisatie van virusdeeltjes in de doelcellen door middel van flowcytometrie.

Meten Attachment en internalisering van influenza A-virus in A549 cellen door flowcytometrie

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de aanhechting en internalisatie van influenzavirusdeeltjes in A549-longepitheelcellen. Dit wordt bereikt door eerst influenzavirus bij lage temperatuur te binden aan A549-cellen, wat aanhechting mogelijk maakt maar de opname van virusdeeltjes voorkomt.Vervolgens krijgt het virus de kans om te internaliseren door de temperatuur te verhogen naar 37 °C. Daarna wordt een blokkeringsstap uitgevoerd, waarbij ongelabelde strp Aden aan het celoppervlak wordt gebonden, om onderscheid te maken tussen aanghechte en geïnternaliseerde virusdeeltjes.Ten slotte wordt het celgeassocieerde gebiotinyleerde virus geïncubeerd met Cy3-gelabeld streptavidine en wordt flowcytometrie gebruikt om de gekleurde virussen te detecteren. Uiteindelijk wordt de relatieve hoeveelheid aangehechte en geïnternaliseerde virussen berekend. Deze methode kan inzicht verschaffen in de relatieve hoeveelheid influenza, een virus dat zich hecht aan en internaliseert in 5 0 9 cellen.Het kan ook worden toegepast op andere systemen met gebruik van verschillende cellijnen of andere virussen. Na het genereren van het gebiotinyleerde virus en het bepalen van de benodigde hoeveelheden van het gelabelde virus, strep din en SI drie gelabelde strep din volgens het tekstprotocol, bereidt u vier deep-well buisjes voor die elk 200.000 A 5 49 cellen bevatten. Label de buisjes als nul minuten, nul minuten plus STV, 30 minuten en 30 minuten plus STV. Centrifugeer vervolgens de buisjes.Verwijder het supernatant en gebruik 200 µL PBS om de pellets opnieuw te suspenderen. Centrifugeer de buisjes vervolgens opnieuw en gebruik 200 µL van een 5 49 standaard groeimedium om de cellen te resuspenderen; incubeer deze gedurende 30 minuten bij 37 °C. Centrifugeer na de incubatie de monsters en resuspendeer de pellets in 200 µL PBS. Nadat de wasstap nogmaals is herhaald, worden de buisjes gedurende 10 minuten op ijs gekoeld. Wanneer de buisjes zijn afgekoeld, worden ze opnieuw gecentrifugeerd en wordt 100 µL gebiotineerd virus, verdund in infectie-PBS, gebruikt om de pellets te resuspenderen. Na incubatie op ijs gedurende één uur wordt de centrifugatiestap herhaald en worden de monsters tweemaal gewassen met PBS, waarbij de volgende monsters voor de nulminuten-meting zoveel mogelijk parallel worden verwerkt.Gebruik na het centrifugeren 100 µL 3,7% paraformaldehyde of PFA om de celpellet opnieuw te suspenderen. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur, centrifugeer vervolgens en gebruik PBS om de cellen na fixatie twee keer te wassen. Bewaar bij 4 °C totdat alle monsters zijn verwerkt.Om de monsters van nul minuten plus STV te behandelen, centrifugeert u de buisjes, verwijdert u het supernatant en gebruikt u 15 µL STV 2% BSA en 0,1% natriumazide in PBS om de celpellet opnieuw te suspenderen; incubeer dit gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens en gebruik PBS om de cellen tweemaal te wassen na fixatie met PFA, zoals zojuist gedemonstreerd, bij vier graden Celsius voor de monsters van 30 minuten. Na het centrifugeren en verwijderen van het supernatant gebruikt u PBS 2% BSA om de monsters op te lossen.Incubeer 30 minuten bij 37 °C voordat u wast met PBS en fixeert met PFA. Bewaar de monsters vervolgens 30 minuten bij 4 °C, inclusief de STV-monsters. Na het centrifugeren resuspenderen we de monsters in 200 µL PBS 2%BSA, gevolgd door een incubatie bij 37 °C gedurende 30 minuten.Centrifugeer de cellen en resuspendeer ze in 50 µL STV 2% BSA 0,1% natriumazide in PBS; incubeer op ijs gedurende 30 minuten vóór het wassen en fixeren. Nadat alle monsters zijn gepermeabiliseerd en gekleurd met STV SI drie, volgens de details in het tekstprotocol, werden de monsters bewaard bij 4 °C. Analyseer de monsters tot slot via flowcytometrie.Bepaal het percentage CY drie positieve cellen in elk monster. Bereken het percentage gebonden virus en de relatieve hoeveelheid geïnternaliseerd virus. Volgens het tekstprotocol zoals hier getoond, is in het monster van nul minuten het gebonden virus koud gebonden aan doelcellen, zoals gevisualiseerd door St.V.SI drie kleuring.Wanneer STV wordt toegepast als blokkeringsstap, kan virus aan het celoppervlak niet langer worden gedetecteerd door S St.V.SI drie kleuring, wat het signaal sterk vermindert. Wanneer de temperatuur wordt verhoogd naar 37 °C, wordt gebonden virus door de cellen opgenomen. Geïnternaliseerd virus is niet gevoelig voor blokkering met ongelabeld STV, wat resulteert in een minder dramatische daling van de signaalintensiteit in de getoonde monsters van 30 minuten plus STV.Hier zijn de percentages SI drie-positieve cellen voor alle experimentele condities die in deze video worden beschreven. Mock-geïnfecteerde cellen geven de achtergrondsignaalintensiteit voor het experiment weer en dienen als negatieve controle voor virusaanhechting. Een andere controle, neuraminidase, vermindert de IAV-aanhechting sterk met 90% vergeleken met onbehandelde cellen.Natriumazide, dat een TP uitput en daarmee endocytose remt, remde de internalisatie van virusdeeltjes zowel tijdens als na de infectie; zoals hier wordt getoond, vertoonden cellen die na behandeling met natriumazide 30 minuten bij 37 °C waren geïncubeerd een dramatische daling in internalisatie vergeleken met onbehandelde cellen die onder dezelfde omstandigheden waren geïncubeerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de hechting en internalisatie van het influenzavirus in 5 0 9-cellen kunt meten. Dit protocol maakt een handige uitlezing via flowcytometrie mogelijk en kan eenvoudig worden aangepast aan andere experimentele opstellingen.

measuring-attachment-internalization-influenza-virus-a549-cells-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Methode voor het meten van virale Fusion Kinetics bij de Single Particle Level

Deze methode beschrijft het gebruik van Infrared kleurstofinkt imaging systeem voor detectie van H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen op een hoog gevoeligheid. Deze methodologie kan worden uitgevoerd in een 96 - of 384-wells plaat, vereist &lt;10 pi volume van testmateriaal en heeft het potentieel voor gelijktijdige screening van meerdere pathogenen.

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

We beschrijven de snelle isolatie van primaire murine type II alveolaire epitheelcellen (AECII) door flowcytometrische negatieve selectie. Deze AECII vertonen hoge levensvatbaarheid en zuiverheid en zijn geschikt voor diverse functionele en moleculaire studies over hun rol bij luchtwegaandoeningen zoals auto of infectieziekten.

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

In this video, we discuss the correlation between the CIT50 and the multiplicity of viral infections. The virus-infected cells display cytopathic effects, causing their death and detachment from the gold microelectrode, which in turn, reduces the impedance.

Impedance-Based Cellular Assay to Measure Multiplicity of Infection of Influenza Virus

This video demonstrates the bacterial adherence assay to evaluate GFP-tagged bacterial adherence to epithelial cell culture to study the dynamics of host-pathogen interactions using fluorescence microscopy-based imaging.

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging

This video demonstrates an assay measuring the antibody-mediated activation of T cell effector functions. Adding an influenza virus hemagglutinin (HA)-specific monoclonal antibody to transfected mammalian cells expressing HA results in the formation of immune complexes with HA. Upon introducing engineered T cells expressing Fc receptors and a luciferase reporter, the T cells are activated by the antibody-HA complexes, and this activation is detected by adding a luciferase substrate and...

Measuring the Activation of Fc-Mediated Effector Functions by HA Antibodies

De eerste stap in de arenavirus levenscyclus is het hechten van virale deeltjes aan gasthercellen. We rapporteren een kwantitatief (q)RT-PCR-gebaseerde test voor ultragevoelige detectie en kwantificering van arenavirus-hechtingsgebeurtenissen.

Zeer gevoelige test voor het meten van arenavirus-cel Attachment

We beschrijven de enzym-gekoppelde lectin-assay (ELLA) voor het meten van influenza-neuraminidase (NA)-remmingsantilichaam-titers in sera. De assay gebruikt pinda-agglutinine om galactoseresiduen te kwantificeren die toegankelijk worden wanneer NA siaalzuur verwijdert van fetuïne-gecoate, 96-well platen.

Meten Influenza neuraminidase Remming antilichaamtiters door Enzyme-linked lectine Assay

Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van Fc-gemedieerde effector functies door antilichamen die gericht het influenza virus hemagglutinine. Deze test kan ook worden aangepast voor de beoordeling van het vermogen van monoclonal antilichamen of polyclonal sera gericht op andere virale oppervlakte glycoproteïnen ertoe Fc-gemedieerde immuniteit.

Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen

Hier is een protocol gerapporteerd voor de kwantificering van infectieuze virale deeltjes met behulp van real-time monitoring van elektrische impedantie van geïnfecteerde cellen. Een praktische toepassing van deze methode wordt gepresenteerd door het kwantificeren van influenza A-virusverval onder verschillende fysisch-chemische parameters die omgevingsomstandigheden nabootsen.

Monitoring influenzavirusoverleving buiten de gastheer met behulp van real-time celanalyse

Leer hoe u hechting en internalisatie van influenza A-virus meet in A549 longepitheelcellen met behulp van flowcytometrie. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van virus-celinteracties mogelijk.

Meten Attachment en internalisering van influenza A-virus in A549 cellen door flowcytometrie

Meer video's verkennen