Meten Attachment en internalisering van influenza A-virus in A549 cellen door flowcytometrie

Het algemene doel van deze procedure is om het hechtings- en internalisatieproces van influenza A-virusdeeltjes in 5 49 longepitheelcellen te meten. Dit wordt bereikt door eerst koude binding van een gelabeld influenzavirus aan 5 49-cellen, wat hechting toestaat maar opname van virale deeltjes voorkomt.

Vervolgens wordt het virus toegestaan om te internaliseren door de temperatuur te verhogen naar 37 graden Celsius. Daarna volgt een blokkeringsstap waarbij ongelabeld strp Aden wordt gebonden aan het celoppervlak. Hechting van virussen wordt uitgevoerd om onderscheid te maken tussen gehechte en geïnternaliseerde virale deeltjes.

Ten slotte wordt het cel-geassocieerde biotinyleringsvirus geïncubeerd met CY drie gelabeld streptavidin en stromingscytometrie wordt gebruikt om de gekleurde virussen te detecteren. Uiteindelijk wordt de relatieve hoeveelheid gehechte en geïnternaliseerde virussen berekend. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de relatieve hoeveelheid influenza A-virus die zich hecht en internaliseert in 5 0 9 cellen.

Het kan ook worden toegepast op andere systemen met behulp van verschillende cellijnen of andere virussen Na het genereren van biotinyleringsvirus en het bepalen van de vereiste hoeveelheden van het gelabelde virus strep din en SI drie gelabeld strep din volgens het tekstprotocol, bereid vier diepe buisjes voor, elk met 200.000 A 5 49 cellen. Label de buisjes als nul minuten. Nul minuten, plus STV, 30 minuten en 30 minuten plus STV. Draai vervolgens de buisjes.

Verwijder het supernatant en gebruik 200 microliter PBS om de pellets op te schorsen. Na het opnieuw draaien van de buisjes, gebruik 200 microliter van een 5 49 standaardgroeimedium om de cellen op te schorsen en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na de incubatie worden de monsters gecentrifugeerd en worden de pellets opgeschort in 200 microliter PBS. Na het nogmaals wassen, koel de buisjes gedurende 10 minuten op ijs. Wanneer de buisjes zijn afgekoeld, draai opnieuw en gebruik 100 microliter biotinyleringsvirus verdund in infectie-PBS om de pellets op te schorsen. Na een uur op ijs te hebben geïncubeerd, herhaal het draaien en was twee keer met PBS, en verwerk de volgende monsters zo veel mogelijk parallel voor de nul minuut monsters.

Na het draaien, gebruik 100 microliter van 3,7% paraformaldehyde of PFA om de celpellet op te schorsen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voordat u gaat draaien en gebruik PBS om de cellen twee keer te wassen na fixatie. Bewaar bij vier graden Celsius totdat alle monsters zijn verwerkt.

Om de nul minuut plus STV-monsters te behandelen, draai de buisjes, verwijder het supernatant en gebruik 15 microliter STV 2%BSA en 0,1% natriumazi in PBS om de celpellet op te schorsen. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Centrifugeer en gebruik PBS om de cellen twee keer te wassen na fixatie met PFA zoals zojuist is aangetoond door de monsters bij vier graden Celsius voor de 30-minuten monsters. Na het draaien en verwijderen van het supernatant, gebruik PBS 2%BSA om de monsters op te lossen.

Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius voordat u wast met PBS en fixeert met PFA. Bewaar de monsters vervolgens bij vier graden Celsius voor de 30 minuten plus STV monsters. Na pelleting schorsen we de monsters in 200 microliter PBS 2%BSA, na een incubatie bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Draai en schors de cellen in 50 microliter STV 2%BSA 0,1% natriumazi in PBS. Incubeer op IJS gedurende 30 minuten voordat u wast en fixeert. Na permeabilisatie en kleuring van alle monsters met STV SI drie, volgens de details in het tekstprotocol, worden de monsters bewaard bij vier graden Celsius. Ten slotte worden de monsters geanalyseerd door middel van stromingscytometrie.

Bepaal het percentage CY drie positieve cellen in elk monster. Bereken het percentage gehecht virus en de relatieve hoeveelheid geïnternaliseerd virus. Volgens het tekstprotocol zoals hier getoond in het nul minuut monster, wordt het gelabelde virus koud gebonden aan doelcellen zoals gevisualiseerd door St.V.SI drie kleuring.

Wanneer STV wordt toegepast als een blokkeerfase, kan het virus aan het celoppervlak niet langer worden gedetecteerd door S St.V.SI drie kleuring, wat het signaal sterk vermindert. Wanneer de temperatuur wordt verhoogd tot 37 graden Celsius, wordt het gehechte virus opgenomen in cellen. Geïnternaliseerd virus is niet gevoelig voor blokkering met ongelabeld STV, wat resulteert in een minder dramatische daling van de signaalintensiteit in de 30 minuten plus STV monsters die hier worden getoond.

Hier zijn de percentages SI drie positieve cellen voor alle experimentele omstandigheden beschreven in deze video. Niet-geïnfecteerde cellen geven de achtergrondsignaalintensiteit voor het experiment en fungeren als een negatieve controle voor virushechting. Een andere controle, neuraminidase, vermindert de hechting van IAV sterk met 90% vergeleken met onbehandelde cellen.

Natriumazi, dat een TP afbreekt, remmt dus de endocytose en remmt de internalisatie van virusdeeltjes zowel tijdens als na infectie, zoals hier wordt getoond. Natriumazi-behandelde cellen die gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius werden geïncubeerd, vertoonden een dramatische daling in internalisatie vergeleken met onbehandelde cellen die onder dezelfde omstandigheden werden geïncubeerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u hechting en internalisatie van influenza A-virus in 5 0 9 cellen meet. Dit protocol maakt een gemakkelijke uitlezing mogelijk door middel van stromingscytometrie en kan gemakkelijk worden aangepast aan andere experimentele omstandigheden.