Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution

Het algemene doel van dit platform op basis van nanostructuur-chips is om de functie van membraaneiwitten op moleculair niveau op een sterk parallelle wijze te analyseren. Dankzij het vermogen om individuele eiwitten te onderscheiden, worden nieuwe inzichten in membraantransport en flux verkregen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van membraaneiwitten, zoals de geleidbaarheid of het transportgedrag van individuele kanalen of transporters, in het bijzonder die met niet-electrogene vracht.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge parallelliteit die voortvloeit uit het ontwerp van de nanostructuur-chip, met honderdduizenden nanoporen en de fluorescerende uitlezing van transportgebeurtenissen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het creëren van de beste assays van effectieve bibliotheken voor membraaneiwitten, aangezien het chipgebaseerde platform zeer parallelle en automatische registratie van transport mogelijk maakt.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode snel leren hoe ze de gepresenteerde techniek moeten hanteren. Het doel was altijd om een gebruiksvriendelijke assay te creëren, zodat iedereen die geïnteresseerd is deze kan overnemen. Deze membraantransport-assay maakt gebruik van een silicon-on-insulator-wafer, vervaardigd middels reactieve ionenetsing.

Van elke wafer worden ongeveer 1.000 assay-chips gefabriceerd. Elke chip bevat 250.000 microcaviteiten. Deze caviteiten worden afgesloten door lipide dubbellagen die de betreffende transporteiwitten bevatten.

Het membraan vormt de sensorinterface. Aanvankelijk zijn de fluorescerende materialen beperkt tot één zijde van de lipide dubbellaag, wat overeenkomt met het binnenste van de liposomen waaruit ze zijn opgebouwd. Elke holte is adresseerbaar via een multispectrale fluorescentie-uitlezing.

Een ondoorzichtige bovenlaag blokkeert de fluorescentiesignalen uit het bufferreservoir, waardoor de bio-chip compatibel is met geïnverteerde fluorescentiemicroscopen. Met behulp van atoomkrachtmicroscopie werd gemeten dat de gelijkmatig gerangschikte porieopeningen en de oppervlakteruwheid van de siliciumdioxidelaag 3,6 nanometer bedragen, wat optimaal is voor vesikeldefusie. Scanning-elektronenmicroscopie toont een dwarsdoorsnede door een nanopore, die toegang geeft tot de femtolitercaviteiten in de siliciumchip.

Deze video toont de bereiding van de proteoliposomen, de voorbereiding van de chips voor de assay en de basisuitvoering van de assay. Sluit een met ethanol gewassen rondbodemkolf aan op een rotavapor. Droog de lipidefilm gedurende 40 minuten bij 300 millibar, een watertemperatuur van 30 graden Celsius en maximale rotatiesnelheid om een homogene lipidefilm op de glazen wand van de kolf te vormen.

Droog vervolgens de lipidefilm nog 30 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een hogevacuumpomp. Voeg daarna vijf milliliter buffer en acht met ethanol gewassen glazen kraaltjes toe aan de kolf om de multilamellaire vesikels te vormen. Verbind de kolf met de rotatieverdamper en roteer zonder vacuüm bij 50 °C op maximale snelheid.

Na 45 minuten zal de oplossing melkachtig ogen, zonder dat er een residu van een lipidenfilm op de wanden aanwezig is. Verplaats de kolf onder een inerte gasatmosfeer naar een ultrasoonbad en soniceer deze gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Sonicatie fragmenteert de liposomen, waardoor ze unilamellair worden.

Verdeel nu de LUV-oplossing in aliquots van één milliliter en voer vijf vries-dooi-cycli uit met behulp van vloeibare stikstof en een waterbad van 40 °C. Dit leidt tot het openbreken, herordenen en groeien van de liposomen. Bewaar alle monsters bij de laatste vriesstap bij -80 °C.

Voordat een LUV-aliquot wordt gereconstitueerd, moeten de liposomen worden geëxtrudeerd door de aliquot 17 keer door een polycarbonaatfiltermembraan van 400 nanometer te persen met behulp van een mini-extruder. Destabiliseer vervolgens de LUVs door 4% Triton X-100 toe te voegen voor een concentratie van 0,25% in de oplossing. Incubeer het mengsel vijf minuten bij 50 °C.

Meng nu één deel gezuiverd, gemodificeerd MscL met 20 delen detergent-verzadigde liposomen en zet de incubatie voort gedurende 30 minuten. Neem na de incubatie een aliquot van 100 µL en voeg één volume 30 mM calcine toe. Incubeer dit mengsel gedurende vijf minuten bij 50 °C.

Verwijder nu het detergent uit het met calcine behandelde en het onbehandelde monster. Voeg aan beide natte bio-beads in Tris-buffer toe en incubeer deze gedurende de nacht bij vier graden Celsius op een roterende plaat. Test voorafgaand aan het experiment een preparaat met een activiteitsassay.

Begin met het mengen van de elastomeerbasis in het uithardingsmiddel en laat het mengsel volledig uitdrogen tot het gestold is. De kleefstof moet binnen 30 minuten na bereiding worden gebruikt. Reinig ondertussen, met de nodige voorzorgsmaatregelen, een dekglasplaat met vijf milliliters chloroform, aangebracht met een glazen spuit, en laat de plaat drogen.

Breng nu met een pipette van 10 µL de bereide lijm aan op het dekglas. Verwijder vervolgens voorzichtig een chip van de waferplaat met een fijne pincet. Plaats de chip met de gecoate zijde naar boven op de lijm en druk deze zachtjes aan op het objectglas om de lijm gelijkmatig te verdelen.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onderop vast komen te zitten en dat er geen lijm op de chip terechtkomt. Zorg er daarnaast voor dat de assemblage past in de houder voor objectglazen met acht kamers. Desiccate de assemblages nu gedurende twee uur bij 65 °C in een kastdroger.

Verwijder vervolgens de beschermlaag op de chips met enkele oplosmiddelwasbeurten bij 54 °C. Plaats eerst de gemonteerde chips in een objectglashouder. Incubeer ze daarna in drie oplosmiddelbaden gedurende telkens 10 minuten.

Isopropanol, aceton en isopropanol. Was vervolgens de chips voorzichtig en grondig met ultrapuur water. Voltooi het proces door de chips te drogen onder een zachte stroom nitrogengas.

Bereid nu een sticky slide met acht putjes voor en plaats deze ondersteboven op de werkbank. Til vervolgens de dekglasplaatjes voorzichtig op en druk ze op de sticky slide, met de chips gericht naar de putjes. Laat de assemblage een paar minuten rusten voordat u verdergaat.

Voordat u begint met de translocatie-assay, wast u de chipassemblage grondig zoals beschreven in het tekstprotocol, en sluit u dit af met een Tris-bufferbad. Vervang vervolgens de badoplossing door DOPE-Tris-buffer, bestaande uit vijf millimolar calciumchloride en één micromolar Oy647-kleurstof. Voeg daarna proteoliposomen toe aan de chipkamer voor een eindconcentratie van één milligram per milliliter en wacht één uur.

Spoel de chips na een uur vier keer af met 400 µL calciumvrije Tris-buffer. Voeg vervolgens de gecontroleerde kleurstof toe aan elke put tot een concentratie van 5 µM en ga verder met de assay. Monteer daarna de chiphouder op de epifluorescentiemicroscoop en focus op de rand van de nanopore-chip om de microcaviteiten te lokaliseren.

Zodra de microcaviteiten scherp zijn gesteld, scant u de nanopore-array op een regio die de hoogste ceiling-ratio vertoont. Details hiervoor worden gegeven in het tekstprotocol. Liposomen werden geprepareerd en gecontroleerd op hun grootteverdeling en dispersie.

De bereide liposomen waren groter dan de poriediameter voor de assay, wat essentieel is. Monodisperse liposomen zijn eveneens wenselijk. Voorafgaand aan het experiment werd het gemodificeerde MscL-eiwit in de liposoompreparatie gecontroleerd met behulp van een fluorescentie-dequenching-assay.

De ratio van liposomen met actief gemodificeerd MscL was voldoende om door te gaan met het translocatie-experiment. Op de biochip werd de translocatie van een fluorescerend doelsubstraat via het gemodificeerde MscL-kanaal waargenomen. De chemische modulator, MTSET, werd gebruikt om de gemodificeerde MscL-kanalen te openen via elektrostatische afstoting.

De daaropvolgende afname van fluorescentie binnen de holte werd gemonitord. Dit proces bleek zeer reproduceerbaar te zijn, met zeer consistente efflux-gebeurtenissen. De resulterende efflux-curves clusterden in twee verschillende populaties, die overeenkwamen met translocatiegebeurtenissen via een enkel kanaal of via meerdere kanalen.

Het systeem was in staat om tot drie uniek fluorescerende kleurstoffen te volgen met real-time analyse. Dit vergemakkelijkt de nauwkeurige discriminatie van positieve resultaten, mono-exponentiële efflux-gebeurtenissen, complexe kinetiek, lipid-intrusies en membraanrupturen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek worden uitgevoerd in opeenvolgende stappen, namelijk chipvoorbereiding, monsterbereiding, imaging en analyse, waardoor het gehele protocol modulair wordt.