Name: Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Leer membraaneiwitanalyse op enkel molecuulniveau met een nanopore-chipplatform. Deze methode biedt hoge parallelliteit voor het bestuderen van transportdynamica en kan waardevolle inzichten opleveren voor screeningsassays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Barbara Windschiegl voor haar hulp bij het opstellen van SOP's; Dennis Remme voor zijn werk aan de NanoCalcFX software en Alina Kollmannsperger, Markus Braner en Milan Gerovac voor nuttige suggesties over het manuscript. De Duits-Israëlische Projectsamenwerking (DIP) werd verstrekt door de DFG en het Federaal Ministerie van Onderwijs en Onderzoek aan R.T., evenals het Federaal Ministerie van Economie en Technologie (ZIM R&D-project) aan R.T. en Nanospot GmbH ondersteunde dit werk.

<ol><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat Biotechnol. 25, 1119(2007).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+simultaneous+measurements+of+single-molecule+translocation+in+%CE%B1-hemolysin+nanopore+array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array.</a> Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).</li>
<li>Carrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+membrane+capacitance+measurements+for+studying+endocytosis+and+exocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast.</a> Traffic. , (2015).</li>
<li>Giacomini, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+transporters+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Membrane transporters in drug development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).</li>
<li>Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+membrane+protein+inhibition+by+optical+ion+flux+in+a+droplet+interface+bilayer+array%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).</li>
<li>Zollmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+liposome+analysis+of+peptide+translocation+by+the+ABC+transporter+TAPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophys. J. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Wagner, M. L., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+polymer-supported+planar+lipid+bilayers+for+reconstitution+of+integral+membrane+proteins%3A+silane-polyethyleneglycol-lipid+as+a+cushion+and+covalent+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker.</a> Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).</li>
<li>Naumann, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymer-supported+phospholipid+bilayer%3A+tethering+as+a+new+approach+to+substrate-membrane+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization.</a> Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).</li>
<li>Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-BLMs+on+highly+ordered+porous+silicon+substrates%3A+Rupture+process+and+lateral+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility.</a> Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li>
<li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).</li>
<li>Lohr, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Liposomes+Used+to+Study+the+Activity+of+Individual+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters.</a> Biophysical Journal. 106, 229a(2014).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).</li>
<li>Milligan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+multiwell+planar+patch-clamp+for+native+and+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).</li>
<li>Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attolitre-sized+lipid+bilayer+chamber+array+for+rapid+detection+of+single+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Kleefen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+parallel+single+transport+recordings+on+nanopore+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays.</a> Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).</li>
<li>Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensing+of+proteins+with+receptor-modified+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).</li>
<li>Urban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+transport+recordings+on+a+membrane-on-nanopore+chip+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution.</a> Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).</li>
<li>Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-on-a-Chip%3A+Microstructured+Silicon%2FSilicon-Dioxide+Chips+for+High-Throughput+Screening+of+Membrane+Transport+and+Viral+Membrane+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion.</a> ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).</li>
<li>Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+directed+intrinsic+membrane+protein+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Lipid directed intrinsic membrane protein segregation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).</li>
<li>Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Micrometer-Sized+Free-Standing+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes.</a> ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).</li>
<li>Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+attoliter-sized+compartments+using+fluid+pore-spanning+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers.</a> ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).</li>
<li>Winterhalter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Black lipid membranes.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).</li>
<li>Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+utilization+of+reversible+and+irreversible+light-activated+nanovalves+derived+from+the+channel+protein+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL.</a> Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

De techniek die hier kan een zeer parallelle analyse membraaneiwit transport. Gereconstitueerd membraaneiwit systemen kunnen direct worden aangebracht op de biochip, waardoor de aanpassing van theoretisch elke membraantransporter of kanaal mogelijk. Transport analyse wordt alleen beperkt door de oprichting van een tl-read-out systeem, hetzij via directe fluorescentie verandering (translocatie van fluoroforen of fluorescent gelabelde substraten) of indirecte fluorescentie change (pH-gevoelige kleurstoffen, secundaire enz...

De analyse van membraaneiwitten is geworden van de toenemende belangstelling voor fundamenteel en farmaceutisch onderzoek in de afgelopen 20 jaar. De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen is afhankelijk van de identificatie en de gedetailleerde karakterisering van nieuwe targets, momenteel één van de beperkende factoren. Het feit dat ongeveer 60% van alle targets zijn membraaneiwitten 1, maakt de ontwikkeling van technieken om hun belangrijkste functie helderen. In het verleden, zijn technieken voor het bestuderen van elektrogene kanalen en transporters ontwikkeld veelheid 2-4. Non-elektrogene substraten in tegenstelling presenteren een meer uitdagende taak. Zij zijn echter van bijzonder belang als voornaamste drug targets, omdat ze de flux van opgeloste stoffen en voedingsstoffen door het celmembraan en fungeren als de belangrijkste receptoren controle bij het ​​signaleren van cascades 5. Aanzienlijke inspanningen werden in de ontwikkeling van t gezetechniques de functie van membraan transporteiwitten 6, 7 bestuderen. Systemen met vaste drager als membranen meest veelbelovende hulpmiddelen ontstond in dit gebied 8-10, waaronder vaste drager lipidendubbellagen gebonden dubbellagen 11, 12, microblack lipide membranen 13, 14 en inheemse vesicle arrays 15, 16 te noemen. Sommige zijn zelfs verkrijgbaar als commerciële opstellingen 17, 18. Voorbeelden zijn gepubliceerd combineren vermogen enkelvoudige membraaneiwitten te bestuderen op een zeer parallelle wijze 14, 19, een voorwaarde voor screening toepassingen. Echter, deze methoden zelden overbruggen van fundamenteel onderzoek tot de industriële omgeving. Het feitelijke probleem vaak het vermogen van het systeem om automatiseerbare, de kostbare productie en / of bewerkelijke bereiding. Een aanpak overcoming alle hierboven genoemde obstakels is het einddoel. De techniek die hier werd ontwikkeld om membraankanalen en transporters studie in vitro in een gecontroleerde omgeving voor de interne eiwitniveau 20-22. Reconstructie van gezuiverde membraaneiwitten in LUV&#39;s is veel meer gevestigde dan vergelijkbare aanpak voor GUVs 23-26 of zwarte lipide membranen 27. Ze kunnen direct worden aangebracht op het chip oppervlak, waarbij bilaag vorming plaatsvindt via een zelf-assemblageproces. De glazen bodem ontwerp van de nanoporeuze chip (fig. 1) maakt lucht microscopie, die de eenvoudige automatisering van het systeem mogelijk maakt. In combinatie met een gemotoriseerde fase kan meerdere chips worden gemeten op hetzelfde tijdstip, waarbij elke gezichtsveld met duizenden afgesloten holtes voor analyse. Figuur 1. Ontwerp van multiplex nanogaatje biochips. A) een silicon-on-insulator (SOI) wafer wordt gestructureerd door reactief-ion etsen. Ongeveer 1.150 individuele chips worden vervaardigd uit elk wafer met identieke eigenschappen en kwaliteit. B) Elke chip bestaat uit 250.000 individuele microcaviteiten met nano openingen. Schaal bar:. 200 pm C) elke holte is adresseerbare via multispectrale fluorescentie uitlezing. Een ondoorzichtige bovenlaag blokkeert de fluorescentiesignalen uit het bufferreservoir, waardoor de biochip compatibel met omgekeerde fluorescentie microscoop. D) Atomic Force Microscopy (AFM) beeldvorming openbaart gelijk geschikt poriënopeningen en oppervlakteruwheid van de siliciumdioxide-laag van 3,6 nm (n = 40) optimaal voor blaasje fusion. Schaal bar:. 5 micrometer E) Scanning electron microscopy beeld (SEM) toont een dwarsdoorsnede door de nanoporiën de toegang tot de femtoliter holten in de siliciumchip. Dit cijfer werd hergebruikt met toestemming van 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Alle data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van freeware naar onbeperkte toegang voor eindgebruikers te garanderen. Tijdreeksen worden geanalyseerd met behulp van gratis software voor beeldverwerking en een custom build curve analyse software die batch processing en ongecompliceerd correlatie van grote datasets met meerdere fluorescerende kanalen en duizenden bochten. De model-eiwit gebruikt in dit protocol is de mechanosensitieve kanaal van grote geleidbaarheid (MscL) kanaal eiwitten afkomstig van E. coli. Het functioneert als een klep om osmotische shock aard vrij, maar werd aangepast zodanig dat rationeel ontworpen Synthetic functionaliteiten kunnen covalent aan de kanalen vernauwing zijde worden bevestigd. Via charge-afstoting van het covalent gebonden activator (MTSET) het kanaal wordt geactiveerd om te openen, het creëren van een nano-klep. Kleine moleculen zoals ionen, water, kleine eiwitten, maar ook kleine fluoroforen kan doordringen door het kanaal. Hier wordt het eiwit gebruikt als een model om het vermogen van het systeem om eiwit gemedieerde translocatie detecteren tonen.

<table><tbody><tr><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[2-(Trimethylammonium)ethyl] methaanthiosulfonaat</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td>T792900</td><td>MTSET; gehydrolyseerd door water. Bewaar als droog poeder in porties bij -80 &deg;C. Direct gebruiken (30 minuten) na oplossing in buffer.</td></tr><tr><td>1 ml gasdichte spuit</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ronde fles</td><td>Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,7 mm glaskralen</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30 cm Luer-Lock verlengingsbuis</td><td>Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbens</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>moet geactiveerd worden voor het eerste gebruik</td></tr><tr><td>CaCl2 Dihydraat</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td>bewaar in het donker bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Chloroform reagent grade</td><td>VWR Chemicals</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPEATTO390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>bewaar in het donker bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Ethanol absoluut</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt eenmalige spuit</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F eenmalige spuit</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Keck klemmen</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-Fosfatidylcholine, 20% (Soy)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>5416016</td><td>bewaar onder inert gas bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>NaCl 99,5% p.a.</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 wafer/chips</td><td>Micromotive (Mainz/Germany)</td><td></td><td>beschikbaar op aanvraag</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etch Membraan 0,4 &micro;m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td><td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>bewaar in het donker bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&uuml;nster/Germany)</td><td>OY-647-T-1mg</td><td>bewaar in het donker bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Rotilabo-slangenfilter, onsteriel, poriegrootte 0,22 &micro;m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>kolom materiaal voor grootte-exclusiechromatografie</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>uithardingsmiddel voor chipbevestiging op glasondersteuning</td></tr><tr><td>sticky-Slide 8-well</td><td>ibidi</td><td>80828</td><td>multi-well kamer voor de montage op glasplaten (chip houder)</td></tr><tr><td>Driewegkraan blauw</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99,9% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0,2 &micro;m cellulose nitraat membraanfilter</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml;chi 461 waterbad</td><td>B&uuml;chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml;chi Rotavapor RE 111</td><td>B&uuml;chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary Eclipse Fluorescerende Spectrophotometer&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast Mini Extruder</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membraanpomp&nbsp;</td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight Nanoparticle Tracking Microscoop</td><td>Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>NyONE microscoop</td><td>Synentec</td><td></td><td>beschikbaar op aanvraag</td></tr><tr><td>Pompsturing</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bad Sonorex RK100H</td><td>Brandelin electronic</td><td>31200001107477</td><td></td></tr><tr><td>Vacuumpomp RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner PDC-37G</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Open Source</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td>wetenschappelijke beeldverwerkingssoftware</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>Freeware</td><td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/</td><td>gegevensanalyse-/evaluatiesoftware voor massieve transportkinetische datasets</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Analytische Software</td><td>Nanosight</td><td></td><td>gegevensverwervings- en analysesoftware voor nanoparticle tracking microscoop</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Temperatuur Comms</td><td>Nanosight</td><td></td><td>temperatuurcontrolesoftware voor nanoparticle tracking microscoop</td></tr></tbody></table>

membraan transportprocessen geanalyseerd door een highly parallel nanopore chip system aan single protein resolution

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membraaneiwit vervoer op de enkel eiwit niveau ontwijkt nog een gedetailleerde analyse, wanneer het substraat translocatie is niet elektrogene. Aanzienlijke inspanningen zijn gedaan op dit gebied, maar technieken voor directe high-throughput transport analyse in combinatie met oplosmiddelvrije lipide bilaag technieken die nodig zijn voor de analyse van membraan transporters zijn zeldzaam. Deze klasse van vervoerders is echter van cruciaal belang in cel homeostase en dus een belangrijke doelgroep in de ontwikkeling en methodologieën om nieuwe inzichten drug hard nodig. De hier gepresenteerde manuscript beschrijft de inrichting en het beheer van een nieuwe biochip voor de analyse van membraaneiwit gemedieerd transportprocessen in één transporter resolutie. De biochip bestaat uit microcavities omsloten door nanoporiën die zeer parallel in het ontwerp en kunnen in industriële kwaliteit en kwantiteit. Eiwit-herbergen liposomen kunnen direct worden aangebracht opde chip oppervlak vormen van zelf-geassembleerde poriën verspreid over lipidedubbellagen behulp van SSM-technieken (vast ondersteund lipide membranen). Pore ​​omspant delen van het membraan vrijstaand, door een interface voor translocatie substraat in of uit de holle ruimte, eventueel gevolgd door multispectrale de fluorescentie in real-time. De oprichting van Standard Operating Procedures (SOP&#39;s) maakt het mogelijk de eenvoudige oprichting van-eiwit herbergen lipidedubbellagen op de chip oppervlak van vrijwel elke membraaneiwit dat functioneel kan worden opgelost. De enige voorwaarde is de oprichting van een tl-read-out systeem voor niet-elektrogene transport substraten. High content toepassingen accomplishable door geautomatiseerde omgekeerde fluorescentie microscoop opnamen meerdere chips parallel. Grote datasets worden geanalyseerd met de vrij beschikbare maat gemaakt analysesoftware. Drie-kleuren multi-spectrale tlVerder lees-out zorgt voor een onpartijdige discriminatie data in verschillende event klassen, waardoor vals-positieve resultaten. De chiptechnologie is momenteel gebaseerd op SiO2 oppervlakken, maar verdere functionalisering behulp goud gecoate chip oppervlakken mogelijk.

-Pore spanning membranen kunnen eenvoudig worden gemaakt op de nanostructuur chip oppervlak in een zelf-geassembleerde manier. Maar het onderliggende proces is nog steeds delicaat en beïnvloed door vele parameters zoals liposoom omvang, monodispersiteit van het liposoom bevolking, lamellarity, lipide en zout-concentratie en chemische oppervlakte-eigenschappen. De meeste van deze parameters zijn zorgvuldig gekarakteriseerd en gestandaardiseerd in bovenstaande protocol. Andere parameters e...

Het gepresenteerde protocol beschrijft de analyse van membraaneiwitgemedieerde transport op het niveau van enkelvoudige transporteurs met behulp van porie-overspande, oplosmiddelvrije lipide dubbellagen. Dit wordt bereikt door de creatie van in grote aantallen geproduceerde nanopore-arraychips, gecombineerd met zeer parallelle dataverwerving en analyse, waardoor de toekomstige vestiging van membraaneiwiteffectorscreenings mogelijk wordt.

Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Het algemene doel van dit platform op basis van nanostructuur-chips is om de functie van membraaneiwitten op moleculair niveau op een sterk parallelle wijze te analyseren. Dankzij het vermogen om individuele eiwitten te onderscheiden, worden nieuwe inzichten in membraantransport en flux verkregen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van membraaneiwitten, zoals de geleidbaarheid of het transportgedrag van individuele kanalen of transporters, in het bijzonder die met niet-electrogene vracht.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge parallelliteit die voortvloeit uit het ontwerp van de nanostructuur-chip, met honderdduizenden nanoporen en de fluorescerende uitlezing van transportgebeurtenissen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het creëren van de beste assays van effectieve bibliotheken voor membraaneiwitten, aangezien het chipgebaseerde platform zeer parallelle en automatische registratie van transport mogelijk maakt.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode snel leren hoe ze de gepresenteerde techniek moeten hanteren. Het doel was altijd om een gebruiksvriendelijke assay te creëren, zodat iedereen die geïnteresseerd is deze kan overnemen. Deze membraantransport-assay maakt gebruik van een silicon-on-insulator-wafer, vervaardigd middels reactieve ionenetsing.Van elke wafer worden ongeveer 1.000 assay-chips gefabriceerd. Elke chip bevat 250.000 microcaviteiten. Deze caviteiten worden afgesloten door lipide dubbellagen die de betreffende transporteiwitten bevatten.Het membraan vormt de sensorinterface. Aanvankelijk zijn de fluorescerende materialen beperkt tot één zijde van de lipide dubbellaag, wat overeenkomt met het binnenste van de liposomen waaruit ze zijn opgebouwd. Elke holte is adresseerbaar via een multispectrale fluorescentie-uitlezing.Een ondoorzichtige bovenlaag blokkeert de fluorescentiesignalen uit het bufferreservoir, waardoor de bio-chip compatibel is met geïnverteerde fluorescentiemicroscopen. Met behulp van atoomkrachtmicroscopie werd gemeten dat de gelijkmatig gerangschikte porieopeningen en de oppervlakteruwheid van de siliciumdioxidelaag 3,6 nanometer bedragen, wat optimaal is voor vesikeldefusie. Scanning-elektronenmicroscopie toont een dwarsdoorsnede door een nanopore, die toegang geeft tot de femtolitercaviteiten in de siliciumchip.Deze video toont de bereiding van de proteoliposomen, de voorbereiding van de chips voor de assay en de basisuitvoering van de assay. Sluit een met ethanol gewassen rondbodemkolf aan op een rotavapor. Droog de lipidefilm gedurende 40 minuten bij 300 millibar, een watertemperatuur van 30 graden Celsius en maximale rotatiesnelheid om een homogene lipidefilm op de glazen wand van de kolf te vormen.Droog vervolgens de lipidefilm nog 30 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een hogevacuumpomp. Voeg daarna vijf milliliter buffer en acht met ethanol gewassen glazen kraaltjes toe aan de kolf om de multilamellaire vesikels te vormen. Verbind de kolf met de rotatieverdamper en roteer zonder vacuüm bij 50 °C op maximale snelheid.Na 45 minuten zal de oplossing melkachtig ogen, zonder dat er een residu van een lipidenfilm op de wanden aanwezig is. Verplaats de kolf onder een inerte gasatmosfeer naar een ultrasoonbad en soniceer deze gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Sonicatie fragmenteert de liposomen, waardoor ze unilamellair worden.Verdeel nu de LUV-oplossing in aliquots van één milliliter en voer vijf vries-dooi-cycli uit met behulp van vloeibare stikstof en een waterbad van 40 °C. Dit leidt tot het openbreken, herordenen en groeien van de liposomen. Bewaar alle monsters bij de laatste vriesstap bij -80 °C.Voordat een LUV-aliquot wordt gereconstitueerd, moeten de liposomen worden geëxtrudeerd door de aliquot 17 keer door een polycarbonaatfiltermembraan van 400 nanometer te persen met behulp van een mini-extruder. Destabiliseer vervolgens de LUVs door 4% Triton X-100 toe te voegen voor een concentratie van 0,25% in de oplossing. Incubeer het mengsel vijf minuten bij 50 °C.Meng nu één deel gezuiverd, gemodificeerd MscL met 20 delen detergent-verzadigde liposomen en zet de incubatie voort gedurende 30 minuten. Neem na de incubatie een aliquot van 100 µL en voeg één volume 30 mM calcine toe. Incubeer dit mengsel gedurende vijf minuten bij 50 °C.Verwijder nu het detergent uit het met calcine behandelde en het onbehandelde monster. Voeg aan beide natte bio-beads in Tris-buffer toe en incubeer deze gedurende de nacht bij vier graden Celsius op een roterende plaat. Test voorafgaand aan het experiment een preparaat met een activiteitsassay.Begin met het mengen van de elastomeerbasis in het uithardingsmiddel en laat het mengsel volledig uitdrogen tot het gestold is. De kleefstof moet binnen 30 minuten na bereiding worden gebruikt. Reinig ondertussen, met de nodige voorzorgsmaatregelen, een dekglasplaat met vijf milliliters chloroform, aangebracht met een glazen spuit, en laat de plaat drogen.Breng nu met een pipette van 10 µL de bereide lijm aan op het dekglas. Verwijder vervolgens voorzichtig een chip van de waferplaat met een fijne pincet. Plaats de chip met de gecoate zijde naar boven op de lijm en druk deze zachtjes aan op het objectglas om de lijm gelijkmatig te verdelen.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onderop vast komen te zitten en dat er geen lijm op de chip terechtkomt. Zorg er daarnaast voor dat de assemblage past in de houder voor objectglazen met acht kamers. Desiccate de assemblages nu gedurende twee uur bij 65 °C in een kastdroger.Verwijder vervolgens de beschermlaag op de chips met enkele oplosmiddelwasbeurten bij 54 °C. Plaats eerst de gemonteerde chips in een objectglashouder. Incubeer ze daarna in drie oplosmiddelbaden gedurende telkens 10 minuten.Isopropanol, aceton en isopropanol. Was vervolgens de chips voorzichtig en grondig met ultrapuur water. Voltooi het proces door de chips te drogen onder een zachte stroom nitrogengas.Bereid nu een sticky slide met acht putjes voor en plaats deze ondersteboven op de werkbank. Til vervolgens de dekglasplaatjes voorzichtig op en druk ze op de sticky slide, met de chips gericht naar de putjes. Laat de assemblage een paar minuten rusten voordat u verdergaat.Voordat u begint met de translocatie-assay, wast u de chipassemblage grondig zoals beschreven in het tekstprotocol, en sluit u dit af met een Tris-bufferbad. Vervang vervolgens de badoplossing door DOPE-Tris-buffer, bestaande uit vijf millimolar calciumchloride en één micromolar Oy647-kleurstof. Voeg daarna proteoliposomen toe aan de chipkamer voor een eindconcentratie van één milligram per milliliter en wacht één uur.Spoel de chips na een uur vier keer af met 400 µL calciumvrije Tris-buffer. Voeg vervolgens de gecontroleerde kleurstof toe aan elke put tot een concentratie van 5 µM en ga verder met de assay. Monteer daarna de chiphouder op de epifluorescentiemicroscoop en focus op de rand van de nanopore-chip om de microcaviteiten te lokaliseren.Zodra de microcaviteiten scherp zijn gesteld, scant u de nanopore-array op een regio die de hoogste ceiling-ratio vertoont. Details hiervoor worden gegeven in het tekstprotocol. Liposomen werden geprepareerd en gecontroleerd op hun grootteverdeling en dispersie.De bereide liposomen waren groter dan de poriediameter voor de assay, wat essentieel is. Monodisperse liposomen zijn eveneens wenselijk. Voorafgaand aan het experiment werd het gemodificeerde MscL-eiwit in de liposoompreparatie gecontroleerd met behulp van een fluorescentie-dequenching-assay.De ratio van liposomen met actief gemodificeerd MscL was voldoende om door te gaan met het translocatie-experiment. Op de biochip werd de translocatie van een fluorescerend doelsubstraat via het gemodificeerde MscL-kanaal waargenomen. De chemische modulator, MTSET, werd gebruikt om de gemodificeerde MscL-kanalen te openen via elektrostatische afstoting.De daaropvolgende afname van fluorescentie binnen de holte werd gemonitord. Dit proces bleek zeer reproduceerbaar te zijn, met zeer consistente efflux-gebeurtenissen. De resulterende efflux-curves clusterden in twee verschillende populaties, die overeenkwamen met translocatiegebeurtenissen via een enkel kanaal of via meerdere kanalen.Het systeem was in staat om tot drie uniek fluorescerende kleurstoffen te volgen met real-time analyse. Dit vergemakkelijkt de nauwkeurige discriminatie van positieve resultaten, mono-exponentiële efflux-gebeurtenissen, complexe kinetiek, lipid-intrusies en membraanrupturen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek worden uitgevoerd in opeenvolgende stappen, namelijk chipvoorbereiding, monsterbereiding, imaging en analyse, waardoor het gehele protocol modulair wordt.

membrane-transport-processes-analyzed-highly-parallel-nanopore-chip

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Enkel molecuul microscopie Approach die nieuwe inzichten naar nucleaire transport.

Single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten

Een methode van het gebruik van solid-state nanoporiën om de niet-specifieke adsorptie van eiwitten te controleren op een anorganisch oppervlak is beschreven. De methode maakt gebruik van de resistieve-puls principe, waardoor de adsorptie aan gezocht worden in real-time en op de single-molecule-niveau. Omdat het proces van enkel eiwit-adsorptie wordt ver van evenwicht, stellen wij de werkgelegenheid van parallelle arrays van synthetische nanoporiën, waardoor voor de kwantitatieve bepaling van...

Monitoring eiwitadsorptie met Solid-state Nanoporiën

Een methodologie voor het bereiden van solid-state nanoporiën in oplossing voor biomoleculaire translocatie experimenten wordt gepresenteerd. Door het toepassen van korte pulsen van hoge elektrische velden kan de nanopore diameter beheersbaar worden uitgebreid met subnanometer precisie en zijn elektrische ruis kenmerken aanzienlijk verbeterd. Deze procedure wordt uitgevoerd in situ met behulp van standaard laboratoriumapparatuur onder experimentele omstandigheden.

Fine-tuning van de grootte en het minimaliseren van de Noise van Solid-state Nanoporiën

Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van discrete metalen zuurstof clusters, polyoxometalates (POMs), bij de enkelvoudige molecuul limiet met behulp van een biologisch nano-gebaseerd elektronisch platform. De methode biedt een complementaire benadering van traditionele analytische chemie instrumenten die worden gebruikt in de studie van deze moleculen.

Fysische karakterisering van enkele metallische nanodeeltjes in hoge resolutie

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van het moleculaire mechanisme van proton translocatie in verschillende lipide membranen van één liposomen, met behulp van cytochroom bo3  als voorbeeld. Het combineren van de elektrochemie en fluorescentie microscopie, pH-veranderingen in het lumen van enkele blaasjes, bevattende één of meerdere enzym, kan worden gedetecteerd en individueel geanalyseerd.

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Nanogaatje sequencing is een nieuwe technologie die het mogelijk maakt kosteneffectieve sequencing in afgelegen locaties en resource-arme instellingen. Hier, presenteren wij een protocol voor het rangschikken van mRNAs van geheel bloed dat met dergelijke voorwaarden compatibel is.

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

Dit protocol beschrijft een iSCAT-gebaseerde beeldverwerking en single-particle tracking-benadering die het gelijktijdige onderzoek van de moleculaire massa en het diffusieve gedrag van macromoleculen die interageren met lipidemembranen mogelijk maakt. Stapsgewijze instructies voor monstervoorbereiding, massa-naar-contrastconversie, filmacquisitie en nabewerking worden gegeven naast aanwijzingen om mogelijke valkuilen te voorkomen.

Massagevoelige deeltjestracking om membraangeassocieerde macromolecuuldynamica te karakteriseren

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

Leer membraaneiwitanalyse op enkel molecuulniveau met een nanopore-chipplatform. Deze methode biedt hoge parallelliteit voor het bestuderen van transportdynamica en kan waardevolle inzichten opleveren voor screeningsassays.

Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution

Meer video's verkennen