Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution

Het algemene doel van deze nano-structuur chip-gebaseerde platform is om de functie van membraaneiwitten op het enkele moleculaire niveau in een zeer parallelle manier te analyseren. Door zijn vermogen om enkele eiwitten op te lossen, worden nieuwe inzichten in membraantransport en flux bereikt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van membraaneiwitten, zoals de geleidbaarheid of transportgedrag van enkele kanalen of transporters, met name die met niet-elektrogene lading.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge parallelliteit die voortkomt uit het nano-structuur chipontwerp, met honderdduizenden nanoporiën en de fluorescente uitlezing van transportgebeurtenissen. De implicaties van deze techniek reiken tot het creëren van de beste assays van effectieve bibliotheken voor membraaneiwitten. Omdat de chip-gebaseerde platform een hoogparallel en automatisch transportrecord mogelijk maakt.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode snel leren hoe ze de gepresenteerde techniek moeten behandelen. De focus was altijd om een gebruiksvriendelijke assay te creëren, zodat iedereen die geïnteresseerd is, deze kan toepassen. Deze membraantransport assay maakt gebruik van een siliconen op geïsoleerde wafer, geconstrueerd met behulp van reactieve ionisatie-etsen.

Ongeveer 1.000 assaychips worden gemaakt van elke wafer. Elke chip bevat 250.000 microcavities. Deze holtes worden afgesloten door lipide dubbellagen die de transportproteïnen van belang bevatten.

Het membraan vormt de sensorinterface. Aanvankelijk worden fluorescerende materialen op één zijde van de lipide dubbellaag bevat, overeenkomend met het binnenste van de liposomen waaruit ze zijn samengesteld. Elke holte is aanspreekbaar via een multispectraal fluorescente uitlezing.

Een ondoorzichtige bovenlaag blokkeert de fluorescerende signalen van de bufferreservoir, waardoor de bio-chip compatibel is met omgekeerde fluorescentiemicroscopen. Met behulp van atoomkrachtmicroscopie werd de gelijkmatig gerangschikte porieopeningen en oppervlakte ruwheid van de siliciumdioxidelaag gemeten op 3,6 nanometer, optimaal voor vesikelfusie. Scanning Electron Microscopie toont een doorsnede door een nanopore, die toegang biedt tot de femtoliterholtes binnenin de siliciumchip.

Deze video toont de bereiding van de proteoliposomen, de voorbereiding van de chips voor de assay en de basisuitvoering van de assay. Verbind een ethanol-gewassen rondbodemkolf aan een roterende verdamper. Droog de lipidefilm gedurende 40 minuten bij 300 millibar, 30 graden Celsius waterbadtemperatuur en maximale rotatiesnelheid om een homogene lipidefilm op de glazen wand van de kolf te vormen.

Vervolgens droog je de lipidefilm gedurende nog eens 30 minuten met behulp van een hoog-vacuümpomp op kamertemperatuur. Voeg vervolgens vijf milliliter buffer en acht ethanol-gewassen glazen kralen toe aan de kolf om de multilamellaire vesicles te maken. Verbind de kolf met de roterende verdamper en roteer zonder vacuüm op 50 graden Celsius met maximale snelheid.

Na 45 minuten zal de oplossing melkachtig lijken, zonder resterende lipidefilm op de wanden. Breng de kolf onder een inert gas over naar een ultrasoon bad en soniceer deze gedurende vier minuten op kamertemperatuur. Sonicatie verstoort de liposomen en maakt ze unilamelair.

Deel nu de LUV-oplossing in een milliliter aliquots en voer vijf vries-ontdoodcycli uit met behulp van vloeibare stikstof en een 40 graden Celsius waterbad. Dit leidt tot breking, herschikking en groei van de liposomen. Bij de laatste vriesstap bewaar je alle monsters bij minus 80 graden Celsius.

Voordat je een LUV-aliquot reconstrueert, extrudeer je de liposomen door de aliquot 17 keer door een 400 nanometer polycarbonaat filtermembraan te laten passeren met behulp van een mini-extruder. Destabiliseer vervolgens de LUV's door 4%Triton X-100 toe te voegen voor 0,25%in oplossing. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten op 50 graden Celsius.

Meng nu één deel gezuiverd, gemodificeerd MscL in 20 delen van de detergent-verzadigde liposomen en vervolg de incubatie gedurende 30 minuten. Neem na de incubatie een 100 microliter aliquot en voeg één volume van 30 millimolair calcine toe. Incubeer dit mengsel gedurende vijf minuten op 50 graden Celsius.

Verwijder nu het detergent uit het calcine-behandelde en onbehandelde monster. Voeg natte bio-beads in Tris buffer toe aan elk en incubeer ze een nacht op een roterende plaat bij vier graden Celsius. Test voor het experiment een voorbereiding met behulp van een activiteitsassay.

Om te beginnen, meng de elastomeerbasis in het uithardingsmiddel en laat de mixtur volledig uitdrogen tot het een kleverige massa is. Het kleefmiddel moet binnen 30 minuten worden gebruikt wanneer het klaar is. Ondertussen, met de nodige voorzorgsmaatregelen, reinig een dekglaasje met vijf milliliter chloroform, aangebracht vanuit een glazen spuit, en laat het schuifje drogen.

Breng nu met behulp van een 10 microliter pipet de voorbereide kleefstof aan op het dekglaasje. Verwijder vervolgens voorzichtig een chip van het waferbord met behulp van fijne pincetten. Met de gecoate kant van de chip naar boven, breng deze aan op de kleefstof en wrijf hem voorzichtig in de schuif om de kleefstof gelijkmatig te verdelen.

Laat geen luchtbellen onder of kleefstof bovenop de chip achter. Maak ook de assemblage zodat deze past in de acht-kamerhouder. Droog nu de assemblages gedurende twee uur bij 65 graden Celsius in een kastdroogkast.

Verwijder later de beschermlaag op de chips met een paar oplosmiddelwasbeurten bij 54 graden Celsius. Plaats eerst de gemonteerde chips in een schuifjehouder. Incubeer ze vervolgens in drie oplosmiddelbaden gedurende 10 minuten per bad.

Isopropanol, aceton en isopropanol. Was vervolgens de chips voorzichtig en grondig met ultrapuur water. Voltooi het proces door de chips te drogen onder een zachte stroom stikstofgas.

Bereid nu een acht-putjes plakbare schuif voor en leg deze achteruit op de werkbank. Til vervolgens voorzichtig en