Efficiënte isolatie protocol voor B- en T-lymfocyten van Human Palatine Amandelen
16 november 2015
Palatinale amandelen zijn een rijke bron van B- en T-lymfocyten. Hier bieden we een eenvoudig, efficiënt en snel protocol om B- en T-lymfocyten te isoleren uit menselijke palatinale amandelen. De beschreven methode is specifiek aangepast voor studies naar de virale etiologie van amandelontsteking, bekend als tonsillitis.
Het algemene doel van deze procedure is om BNT-lymfocytfracties uit humane tonsil-monsters te verkrijgen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen op het gebied van virologie, zoals wat de rollen zijn van BT-lymfocytfracties in de pathogenese van virale ziekten Binnen drie uur na hun chirurgische verwijdering. Vervoer het tonsilweefsel naar het laboratorium in een centrifugeerbuis van 50 milliliter gevuld met ijskou, steriele HBSS met supplementen.
Gebruik vervolgens de geschikte bioveiligheidsprocedures die worden aanbevolen voor het hanteren van menselijk weefsel. Bevochtig het weefsel met vers supplement bevattend HBSS en breng de tonsils over naar een 60 millimeter plastic celcultuurplaat op ijs. Gebruik pincetten om zichtbare bloedstolsels of vet- en bindweefsel te verwijderen en breng de tonsils vervolgens over naar een nieuwe 60 millimeter plaat met vijf milliliter HBSS met supplementen.
Snijd vervolgens. De tonsil-weefselklomp in drie tot 10 millimeter fragmenten, gevolgd door overbrengen van de fragmenten naar een plastic celzeef van 100 micrometer in een nieuwe 60 millimeter celcultuurplaat met 10 milliliter vers HBSS met supplementen met behulp van het plunjer-uiteinde van een plastic spuit glad. Knijp de weefselfragmenten door de celzeef, zorg ervoor dat de tonsilfragmenten volledig ondergedompeld blijven in de HBSS wanneer al het weefsel is gemacereerd, gooi de zeef weg en breng de resulterende celsuspensie over in een plastic centrifugeerbuis van 50 milliliter op ijs.
Breng de celoplossing tot een eindvolume van 35 milliliter met vers HBSS met supplementen en voeg vervolgens 10 milliliter kamertemperatuur dichtheidsgradiëntoplossing toe aan een paar 50 milliliter conische buizen. Leg de celsuspensies voorzichtig bovenop de dichtheidsgradiënten, zorg ervoor dat de oplossingen niet worden gemengd en scheid vervolgens de cellen door centrifugatie. De mononucleaire cellen zullen zich scheiden in een weelderige witte laag op het grensvlak met de rode bloedcellen fibroblasten en celafval in het sediment op de bodem van de buis.
Gebruik een pipet van 10 milliliter om voorzichtig de mononucleaire cel laag te verzamelen en trek de mononucleaire cellen in een nieuwe buis van 50 milliliter. Was vervolgens de cellen drie keer in 25 milliliter ijskou PBS per wasbeurt en suspendeer het uiteindelijke pellet in 15 milliliter PBS. Na het tellen van het aantal levensvatbare cellen, plaats de cellen op ijs om de tonsor T-cellen te isoleren door magnetische parelafscheiding.
Centrifugeer de mononucleaire celsuspensie en suspendeer het pellet in 80 microliter ijskou scheidingsbuffer per een keer 10 tot de zeven cellen. Breng vervolgens de celsuspensie over in een steriele buis van twee milliliter en incubeer in 20 microliter CD drie magnetisch antilichaam gedurende één uur bij vier graden Celsius met voortdurend zacht mengen om de cellen en suspensie aan het einde van de incubatie te houden, breng de cellen over in een buis van 15 milliliter met vijf milliliter ijskou scheidingsbuffer en was ze tijdens het wassen. Bevestig de magnetische scheider aan de standaard en laad een kolom op de magneet.
Was de kolom met 500 microliter ijskou scheidingsbuffer en plaats vervolgens een zeef van 40 micrometer op de kolom. Re suspendeer nu het celpellet in 500 microliter vers scheidingsbuffer en laad de cellen door de zeef op de kolom waarbij het B-cel bevattende EIT in een conische buis van 15 milliliter wordt verzameld. Twee op ijs wanneer alle cellen in de verzamelbuis zijn gepasseerd.
Was de kolom vier keer met 500 microliter scheidingsbuffer per een keer 10 tot de zeven cellen wachten tot de kolomreservoir leeg is voordat de volgende was wordt aangebracht. Breng na de laatste wasbeurt de kolom over in een nieuwe verzamelbuis van 15 milliliter. Gebruik vervolgens de kolomplunjer om twee milliliter scheidingsbuffer door de kolom in de buis te drukken om de CD drie positieve T-celfractie te verzamelen.
Om de geïsoleerde B- en t-tonsorcelfracties te analyseren, pellet de CD drie positieve en CD drie negatieve celfracties en was beide sets cellen in één milliliter PBS gesupplementeerd met 0,2% BSA of PBSA na de tweede draai. Verdeel 100 microliter aliquoten van de cellen en PBSA over het juiste aantal buizen voor fax-labeling en voeg de juiste hoeveelheid fluoro vier geconjugeerd monoklonaal of controle-antilichaam toe aan elke buis. Vorm vervolgens de buizen kort en incubeer ze gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker aan het einde van de incubatie.
Was de buizen twee keer met vers PBSA en fixeer vervolgens de celkleuring met 1% paraform aldehyde om de aanwezigheid van adenovirus-DNA in de cellen te detecteren door PCR. Voer de PCR-amplificatie uit onder de juiste cyclusvoorwaarden, scheid de resulterende PCR-amplificatieproducten op een 1,5% AGROS-gel en interestaat EDTA-buffer. Beeld tenslotte de resulterende banden af met de juiste nucleïnezuurkleuring.
Volgens standaardprotocollen resulteert een succesvolle scheiding van de tonsor mononucleaire cellen in sterk gezuiverde subpopulaties van BNT-lymfocyten, zoals bevestigd door flowcytometrische analyse met behulp van anti-CD 20 en anti-CD twee antilichamen om respectievelijk de b- en t-lymfocytpopulaties te detecteren. In tegenstelling hiermee resulteert een inefficiënte scheiding van de mononucleaire cellen in celfracties die een mengsel zijn van cellen van zowel de b- als t-lymfocyten. Subpopulaties, DNA en RNA kunnen worden geëxtraheerd uit de magnetische parel gescheiden b- en t-lymfocyten voor downstream-analyse zoals zojuist is aangetoond.
Bijvoorbeeld, hier wordt de specifieke detectie van adenovirus-DNA in TONSOR T-lymfocyten gedetecteerd door PCR getoond kwaliteitscytoplasmatisch. RNA kan ook worden geëxtraheerd uit geïsoleerde tonsor B NT-lymfocyten. Eens monster twee tonsil-monsters kunnen binnen zes uur worden verwerkt als de techniek correct wordt uitgevoerd.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de tonsil-monsters zo snel mogelijk te verwerken. Het aantal wasstappen en he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een snel protocol voor het isoleren van B- en T-lymfocyten uit menselijke palatine amandelen. De methode is ontworpen om studies naar de virale oorzaken van tonsillitis te vergemakkelijken.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Virologie
- Celbiologie
Achtergrond
- De palatinale amandelen vormen een belangrijke bron van B- en T-lymfocyten.
- Tonsillitis kan virale etiologieën hebben die nader onderzoek vereisen.
- Kennis van de rol van lymfocyten bij virale ziekten is cruciaal voor de vooruitgang van de virologie.
- Een efficiënte isolatie van lymfocyten is essentieel voor onderzoek.
Doel van de studie
- Om een gestroomlijnd protocol te bieden voor de isolatie van lymfocyten.
- Om de onderzoeksmogelijkheden op het gebied van virale pathogenese te verbeteren.
- Om studies naar de immuunrespons bij tonsillitis te ondersteunen.
Gebruikte methoden
- Transporteer tonsilverweefsel in steriele HBSS op ijs.
- Verwijder zichtbare bloedstolsels en bindweefsel.
- Hanteer passende biosafety-procedures voor het werken met menselijk weefsel.
- Bevochtig het weefsel met HBSS-supplementen vóór de verwerking.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt de isolatie van levensvatbare B- en T-lymfocyten mogelijk.
- Geïsoleerde lymfocyten kunnen worden gebruikt voor verdere virologische studies.
- De resultaten ondersteunen het onderzoek naar de rol van lymfocyten bij virale infecties.
- De methode is efficiënt en kan binnen drie uur na de operatie worden voltooid.
Conclusies
- Dit protocol is een waardevol instrument voor onderzoekers die tonsillitis bestuderen.
- Het draagt bij aan het begrip van de immuunrespons op virale infecties.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om lymfocytfuncties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol maakt de snelle isolatie van gezuiverde B- en T-lymfocytenfracties uit menselijk tonsilweefsel mogelijk, ter ondersteuning van mechanistische studies naar virale pathogenese in lymfoïde weefsels. Door een reproduceerbare methode te bieden om levensvatbare immuuncellen binnen drie uur na chirurgische resectie te verkrijgen, faciliteert het de validatie van targets en de ontwikkeling van assays voor antivirale therapeutica. De aanpak verhoogt het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door directe analyse van menselijke lymfocytenresponsen op pathogenen mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met betrekking tot lymfocyt-specifiek viraal tropisme en mechanismen van immuunontwijking.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde workflow voor het isoleren van zuivere B- en T-celpopulaties uit hetzelfde weefselmonster, waardoor de variabiliteit in daaropvolgende functionele assays wordt verminderd.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert hooggezuiverde lymfocyten-subsets die geschikt zijn voor kwantitatieve infectie-assays en studies naar interacties tussen pathogeen en gastheer.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays door een consistente celopbrengst en levensvatbaarheid, wat betrouwbare screening van verbindingen tegen virale targets mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert de directe toepasbaarheid bij het bestuderen van menselijke adenovirusinfecties in tonsillaire T-cellen, waardoor de stap van ontdekking naar mechanische risicoanalyse wordt overbrugd.
- Operationele waarde: Maakt de extractie van DNA en RNA uit geïsoleerde lymfocyten mogelijk voor daaropvolgende PCR- en qPCR-analyse van de virale load en genexpressie.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode past binnen het continuüm van vroege ontdekking, waardoor hypothese-testen in de immunologie en virologie mogelijk is voordat men overgaat naar de fasen van lead-identificatie en preklinische validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de functionele validatie van de rol van lymfocyten bij virale pathogenese via geïsoleerde cellfracties.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, levensvatbare lymfocytpreparaten voor reproduceerbare infectie- en geneesmiddelrespons-assays.
- Analytica: Maakt kwantitatieve read-outs mogelijk via flowcytometrie en PCR om de zuiveringsefficiëntie en de aanwezigheid van pathogenen te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Biedt een menselijk relevant systeem voor het bestuderen van interacties tussen lymfocyten en pathogenen, wat bijdraagt aan de selectie van preklinische modellen.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een herbruikbaar isolatieplatform voor meerdere studies naar lymfoïde weefsels, waardoor redundante protocolontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in lymfocyt-virusinteracties te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de isolatie van immuuncellen voor high-throughput toepassingen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege, mens-relevante gegevens te leveren over target-engagement en pathogenenspecificiteit.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van antivirale kandidaten mogelijk op basis van lymfocytspecifieke effectiviteit en veiligheidsprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de aseptische behandeling van menselijk weefsel en technieken voor scheiding met magnetische beads.
- Afhankelijk van toegang tot steriel HBSS, dichtheidsgradiëntoplossingen en CD3 magnetische antilichaamconjugaten.
- Vereist gestandaardiseerde wasprotocollen en temperatuurbeheersing om de levensvatbaarheid en zuiverheid van de cellen te behouden.
- Aanpassing aan andere lymfoïde weefsels kan optimalisatie van de enzymatische digestie en filtratieparameters vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de beschikbaarheid van weefsel en de noodzaak van snelle verwerking binnen zes uur na resectie om degradatie te voorkomen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:32
Mononuclear Cell (MNC) Isolation from Human Palatine Tonsils
2:45
Tonsillar T Lymphocyte Positive Selection
4:24
Isolated Tonsillar B and T Lymphocyte Flow Cytometric and PCR Analysis
5:39
Results: Representative Tonsillar B and T Lymphocyte Isolation
6:34
Conclusion
