Name: Efficiënte isolatie protocol voor B- en T-lymfocyten van Human Palatine Amandelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Leer een snel protocol voor het isoleren van B- en T-lymfocyten uit humane palatine amandelen. Deze methode ondersteunt virologisch onderzoek naar de rol van lymfocyten bij virale infecties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Zweedse Kanker Vereniging (11 0253, 13 0469), de Zweedse Onderzoeksraad (K2012-99X-21959-01-3), Marcus Borgströms Stichting en de Zweedse Onderzoeksraad via een subsidie aan het Uppsala RNA Onderzoekscentrum (2006-5038-36531-16). We zijn dankbaar aan de BioVis-kernfaciliteit aan de Universiteit van Uppsala voor veel hulp met de FACS-analyse.

Het protocol beschrijft de isolatie van lymfoïde cellen van menselijke patiënt materiaal en vereist daarom een ​​ethische goedkeuring. Het werk in het huidige onderzoek werd door de Uppsala Ethische Review Board (DNR. 2013/387) toegekend. 1. Isolatie van mononucleaire cellen (MNC) van Human Palatine Amandelen LET OP: Alle niet-afgeschermde materiaal van menselijke oorsprong, zoals bloed, weefsels of lichaamsvloeistoffen moet worden beschouwd als potentieel besmet materiaal. Daarom moet bioveiligheidspraktijken aanbevolen voor de behandeling van het menselijk weefsel te volgen. Opmerking: Om besmetting te voorkomen, moeten alle oplossingen en celcultuur apparatuur steriel zijn. Alle buffers en oplossingen moeten vooraf worden gekoeld en op ijs bewaard. Tonsillen weefsels en geïsoleerde cellen moet worden behandeld en verwerkt op ijs. <ol><li> Verkrijgen verse amandelen uit patiënten die tonsillectomie of tonsillotomy (figuur 2). Dompelen het weefsel Clumps in een 50 ml centrifugebuis gevuld met ijskoude steriele Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 10 mM glutamine, 0,05 mg / ml gentamicine en 1% antibiotica Antimycoticum mix (Penicillin, streptomycine en amfotericine B). </li><li> Laat de buizen met de ondergedompelde tonsil weefsel monsters te allen tijde op ijs. Proberen om de amandelen zo snel mogelijk te verwerken, en niet later dan 3 uur na operatieve verwijdering. </li><li> Plaats de tonsillen op een 60 mm plastic celcultuur plaat op ijs en houden het weefsel bevochtigd met HBSS. Verwijder toegankelijk bloedstolsels, vet en bindweefsel met een schone pincet uit de tonsil oppervlak. </li><li> Gebruik een nieuwe 60 mm celcultuur plaat met 5 ml HBSS. Snijd de tonsil weefsel klomp in 3-10 mm fragmenten met een steriele schaar en / of een scalpel. </li><li> Bereid een nieuwe 60 mm celcultuur plaat met 10 ml HBSS en plaats een 100 micrometer plastic cel zeef in de HBSS oplossing. </li><li> Breng de Dissecteerd tonsil fragmenten in de cel zeef met een steriele pincet. De zuiger uiteinde van een plastic injectiespuit, soepel knijp het weefsel fragmenten door de cel zeef. Zorg ervoor dat de tonsillen fragmenten volledig worden ondergedompeld in de HBSS. </li><li> Gooi de cel zeef met het weefsel blijft en breng de verkregen celsuspensie van 60 mm celkweek plaat in een 50 ml plastic centrifugebuis. Laat de buis op het ijs, terwijl u doorgaat met de stappen 1.8 en 1.9. </li><li> Bij grote amandelen, groter dan 2 cm in grootte (figuur 2), knijp de tonsillen fragmenten twee cel zeven om verstopping van de mazen van de zeef te voorkomen. </li><li> Verkrijgen van het eindvolume van 35 ml van de celsuspensie. Opmerking: In deze stap is het mogelijk om de celsuspensie te bereiden op cryopreservatie (zie paragraaf 2). </li><li> Voeg 10 ml dichtheidsgradiënt oplossing zoals Ficoll een nieuwe 50 ml centrifugebuis. Voorzichtig overlay de cel suspension (stap 1,9) bovenop de dichtheidsgradiënt oplossing. Vermijd mengen van de celsuspensie en de dichtheidsgradiënt oplossing. Opmerking: De dichtheidsgradiënt oplossing op te warmen tot kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie in een swing-out rotor bij 700 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Heeft de remfunctie op de centrifuge zo hard remmen kan het verloop verstoren niet activeren. Gebruik ook de laagste versnelling functie beschikbaar is op de centrifuge. Opmerking: Hierna centrifugefase waarnemen MNO als een pluizige witte laag bij het ​​grensvlak, en rode bloedcellen (RBC&#39;s), fibroblasten en celresten als sediment op de bodem van de buis. </li><li> Het verzamelen van de multinationals laag zorgvuldig met behulp van een 10 ml pipet. Plaats de celsuspensie in een nieuwe 50 ml centrifugebuis. </li><li> Voeg 25 ml ijskoud PBS aan de celsuspensie en draai de buis bij 300 g gedurende 5 min in een swing-out rotor bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant met behulp van een 25 ml pipeten herhaal celpellet wasstap twee keer. Tenslotte resuspendeer de celpellet in 15 ml PBS. Opmerking: Na de laatste wasstap, is het mogelijk om de celsuspensie (zie punt 2) cryopreserveren. </li><li> Breng 10 pl celsuspensie in hemocytometer cel telkamer en tel het aantal cellen onder een microscoop. Verdeel de juiste hoeveelheid cellen (bijvoorbeeld 2-3 x 10 7) in een 15 ml centrifugebuis voor daaropvolgende magnetische korrel scheiding. Houd dit monster op ijs tot stap 3.2. </li></ol> 2. cryopreservatie van de keelamandelen Cells <ol><li> Bereid bevriezing medium (90% FBS en 10% DMSO) en houd het op het ijs. Voor de lange termijn opslag houdt de bevriezing media bij -20 ° C. </li><li> Bepaal het totale aantal cellen met een hemocytometer cel telkamer (stap 1.15). Bereken het vereiste hoeveelheid freezing medium volgens de gewenste ingevroren celdichtheid (bijvoorbeeld 10 7 cells / ml bevriezing gemiddeld). </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 min. Schenk het supernatans zonder de celpellet en resuspendeer de celpellet in ijskoude freezing medium (uit stap 2.1). </li><li> Verdeel 1 ml porties van de celsuspensie in steriele flesjes gemaakt voor langdurige opslag in vloeibare stikstof. Bevries de flacons in een isopropanol kamer en bewaar ze bij -80 ° CO / N. Voor de lange termijn bewaring overbrengen van de flesjes in een vloeibare stikstof bevattende opslagtank of -140 ° C cel vriezer. </li><li> Om flesjes met bevroren cellen ontdooien, warm ze snel in een 37 ° C waterbad. Onmiddellijk wanneer ontdooid, verspreiden de celsuspensie in 10 ml voorverwarmde HBSS (met supplementen, stap 1,1) in een 15 ml centrifugebuis. Spin de buis bij 300 xg gedurende 5 minuten, verwijder HBSS en resuspendeer de celpellet bij de gewenste celdichtheid in HBSS (met supplementen, stap 1,1). Opmerking: De levensvatbaarheid van de multinationals after ontdooien van belang, omdat de aanwezigheid van dode cellen de uiteindelijke opbrengst aan gezuiverd B en T-lymfocyten afnemen. Opmerking: Volgens onze ervaring van de levensvatbaarheid van de cellen minder dan 80% zal de celisolatie efficiency verminderen. </li></ol> 3. positieve selectie van T-lymfocyten bevolking van de keelamandelen multinationals Opmerking 1: Dit protocol is gebaseerd op positieve selectie van humane CD3 + T-lymfocyten van keelamandelen MNCs via magnetische partikels gekoppeld aan het CD3-antilichaam. Het is mogelijk om dit onderdeel te starten van verse (deel 1) of de bevroren (hoofdstuk 2) multinationals. Noot 2: Begin met 3 x 10 7 multinationals. Neem niet meer dan dit aantal cellen, omdat de scheiding kolommen kunnen verstoppen en dit zal de isolatie efficiency verminderen. Gebruik groter kolommen als er meer cellen worden behandeld. De in dit protocol volumes experimenteel geoptimaliseerd om het aantal cellen onsed in onze experimentele opstelling. <ol><li> Bereid de scheiding buffer [PBS (pH 7,2), 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA]. Filtreer de scheiding buffer door een 0,45 urn filter en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Draai de MDL suspensie (stap 1,14) bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de verkregen celpellet in 240 ui (80 ul per 10 7 cellen) ijskoude buffer scheiding. Breng de celsuspensie in een steriele 2 ml buis. </li><li> Voeg 20 ul van magnetische CD3 antilichaam aan de celoplossing. Incubeer de buizen gedurende 1 uur bij 4 ° C onder voortdurend zachtjes mengen aan cellen in suspensie te houden. </li><li> Overdracht van al de celsuspensie in een 15 ml buis met 5 ml ijskoude buffer scheiding om de cellen te wassen. </li><li> Centrifugeer de buis bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een swing-out rotor. </li><li> Inmiddels is het opzetten van de magnetische separator en de kolom. Bevestig de magnetische separator de stand en plaats de kolom in de SEPARator. Was de kolom door toepassing van 500 pl ijskoude buffer scheiding. Gooi de stroom door. </li><li> Plaats een nieuwe 15 ml collectie buis onder de kolom. Houd de collectie buis op ijs. </li><li> Verwijder het supernatant (stap 3,5) door pipet en voorzichtig resuspendeer de celpellet in 500 ui buffer scheiden. Breng de celsuspensie bovenop de voorgewassen kolom en laat deze door. Opmerking: Cel klonten kan de kolom verstoppen en dus vermindering van het debiet. Om dit probleem te voorkomen, plaats een 40 urn plastic cel zeef bovenaan de kolom. Het passeren van de cellen door het gaas zal sterk de efficiëntie van deze werkwijze. </li><li> Was de kolom 4 maal met 1,5 ml scheidingsbuffer (500 gl van 10 7-cellen). Wacht tot de kolom reservoir leeg is (geen vloeistof worden waargenomen in de kolom) alvorens de volgende wasstap. Opmerking: Haal de CD3 ongelabelde cellen, beschouwd als B-lymfocyt fractie, aangezien zijuitgewassen in de collectie buis. </li><li> Verwijder de kolom uit de afscheider en plaats in een nieuwe 15 ml collectie buis. Pipetteer 2 ml scheidingsbuffer op de kolom. De aan de kolom toegevoerd plunjer elueren de positief geselecteerde T-lymfocyten, waarbij de T lymfocyt fractie worden beschouwd. </li><li> Bepaal het aantal gezuiverde cellen (stap 1,15) indien nodig. Celsuspensies zijn nu klaar voor downstream experimenten. </li></ol> 4. Flowcytometrie Analyse van geïsoleerde keelamandelen B- en T-lymfocyten LET OP: Paraformaldehyde oplossing is irriterend en verdacht carcinogeen. Draag geschikte beschermende kleding, handschoenen en bescherming voor de ogen / het gezicht. Opmerking 1: Dit protocol beschrijft de werkwijze voor de directe kleuring van de geïsoleerde B- en T-cellen door Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) analyse. Het hoofddoel van deze stap is om de zuiverheid van de geïsoleerde celpopulaties aF beoordelenter CD3 magnetische antilichaam scheiding. Hiertoe vastgestelde B- en T-cel markers, fluorofoor geconjugeerde monoklonale antilichamen CD20-FITC en CD2-APC worden gebruikt. Ook de opname van isotype controle antilichamen wordt sterk aanbevolen om de niet-specifieke &quot;achtergrond&quot; binding van CD2 en CD20-antilichamen (zie stap 4,8) onderscheiden. Noot 2: Het is mogelijk om de gezuiverde celfracties in een 1% paraformaldehyde houden (PFA) oplossing in het donker bij 4 ° C tot de tijd van kleuring (bijvoorbeeld, de volgende dag.). Ook dezelfde procedure van toepassing als er een tijd tussen kleuring en FACS analyse. Bedenk dat in beide gevallen cellen goed moeten worden gewassen met PBSA (PBS met 0,2% BSA) buffer vóór kleuring en FACS analyse. <ol><li> Neem 6 x 10 6 cellen van multinationals uit stap 1,15 (voorafgaand aan het aanbrengen van de kolom), B-lymfocyt fractie uit stap 3.9 en T-lymfocyt fractie uit stap 3.10. </li><li> Spin de celschorsingen bij 300 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C met behulp van een swing-out rotor. </li><li> Verwijder het supernatant met pipet en was de celpellet eenmaal met 1 ml ijskoude PBSA. Draai de celsuspensies bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant met pipet en resuspendeer de cellen in 600 ul ijskoude PBSA buffer. </li><li> Voeg 100 ul van de celsuspensie op de bodem van een FACS buis. </li><li> Voeg 100 ul PBS dat 10% hitte geïnactiveerd humaan serum aan elke buis, mengen en incuberen gedurende ~ 1 min bij kamertemperatuur of 20 minuten op ijs. Opmerking: B-lymfocyten dragen Fc-receptoren. Om het Fc receptoren blokkeren de gezuiverde celfracties worden geïncubeerd met 10% hitte geïnactiveerd humaan serum. Het menselijke serum wordt geïnactiveerd door incubatie bij 56 ° C gedurende 1 uur. Verdeel de warmte geïnactiveerd serum in kleine porties en bewaar bij -20 ° C ingevroren. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C in een swing-out rotor. </li><li> Verwijder het supernatant met pipet en was de celpellet met 1 ml PBSA. Herhaal de centrifugatie (300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C). </li><li> Voeg 100 ul PBSA in elke buis op ijs. Voeg de juiste hoeveelheid fluorofoor geconjugeerd monoklonaal antilichaam, volgens de aanbevelingen van de fabrikant (bijvoorbeeld 20 pl anti-CD20 en / of 5 ul van anti-CD2 antilichamen in 100 pl PBSA). Opmerking: Vergeet niet om voldoende controle buizen te wijzen voor de FACS analyse. In dit protocol dient de volgende controles worden opgenomen: 1) cellen gekleurd met anti-CD2 en anti-CD20 antilichamen afzonderlijk 2) cellen gekleurd met anti-CD2 en anti-CD20 isotype controle antilichamen individueel en 3) cellen zonder toevoeging van antilichamen. </li><li> Kort vortex de buis en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Was 2 maal met PBSA. Voeg 2 ml van 1% PFA oplossing van de monsters. Laat de cellen blijven het PFA oplossing bij 476; C in het donker tot de tijd van FACS analyse. </li><li> Onmiddellijk voor de monsters in de FACS-machine, was de cellen 2 maal met PBSA (300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C). Resuspendeer monsters in 1 ml PBS en bewaren bij 4 ° C (of ijs), beschermd tegen licht, vóór de scheiding op de flowcytometer. </li><li> Doe de FACS sortering volgens het protocol van de flowcytometer fabrikant. </li></ol> 5. PCR Detectie van adenovirus DNA in geïsoleerde keelamandelen B- en T-lymfocyten Opmerking 1: De adenovirus hexon gen primers AdRJC1 (5&#39;-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 &#39;) en AdRJC2 (5&#39;-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3&#39;) 11. Deze primers genereren van een amplicon van 139 bp. De gastheer 18S rRNA-gen kan worden gedetecteerd met tp206 primers (5&#39;-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 &#39;) en tp207 (5&#39;-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3&#39;). De verwachte amplicon grootte is 300 bp. Noot 2: Elke PCRrun omvat een negatieve controle (gedestilleerd H 2 O) en een positieve DNA verkregen uit menselijke B-cellijn (BJAB) controle geïnfecteerd met het humaan adenovirus type 5 12. <ol><li> Extraheer DNA (uit ten minste 1 x 10 6 cellen, stap 3,11) met silicagel membraangebaseerde kolom zuiveringsmethode. Extract RNA met behulp van fenol en guanidine isothiocyanaat oplossing 13. </li><li> Voeg 100 ng DNA van B- en T-lymfocyten van een reactiemengsel dat 1x HF buffer, 0,2 mM deoxynucleotidetrifosfaat mix (dNTP), 0,25 pM van elke primer en 1 U van High-Fidelity DNA polymerase in een totaal volume van 20 pl. </li><li> Voer PCR-amplificatie onder de volgende cyclingcondities: 30 sec denaturatie bij 98 ° C, gevolgd door 30 cycli van 98 ° C gedurende 10 sec, 67 ° C (hexon) of 58 ° C (18S rRNA) gedurende 30 sec en 72 ° C 30 sec. De PCR reactie werd beëindigd met een laatste verlenging stap van 7 minuten bij 72 ° C. </li><li> Scheid de verkregen PCR-versterker;icatie producten op een 1,5% agarosegel in 1x TBE buffer en zichtbaar de verwachte banden door kleuring met nucleïnezuur kleuring. </li></ol>

<ol><li>Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+immunology+of+the+human+palatine+tonsil%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Morphology and immunology of the human palatine tonsil.</a> Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).</li>
<li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+the+tonsils%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+today%22%5BJournal%5D)">Immunology of the tonsils.</a> Immunology today. 19, 414-421 (1998).</li>
<li>Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+quantitation+of+adenovirus+DNA+from+human+tonsil+and+adenoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues.</a> J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).</li>
<li>Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+and+immunopathology+of+tonsils%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Immunology and immunopathology of tonsils.</a> Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).</li>
<li>Imai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-carrying+and+-expressing+T-cell+lines+established+from+severe+chronic+active+EBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection.</a> Blood. 87, 1446-1457 (1996).</li>
<li>Veen, J., Lambriex, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+adenovirus+to+lymphocytes+in+naturally+infected+human+tonsils+and+adenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids.</a> Infect Immun. 7, 604-609 (1973).</li>
<li>Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+systematic+review+of+tonsillectomy+and+adenoidectomy+for+treatment+of+pediatric+obstructive+sleep+apnea%2Fhypopnea+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).</li>
<li>Garnett, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+species+C+adenoviruses+in+human+tonsil+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues.</a> J Virol. 83, 2417-2428 (2009).</li>
<li>Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+quantitation+of+species+C+adenovirus+DNA+in+human+mucosal+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes.</a> J Virol. 76, 10608-10616 (2002).</li>
<li>Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+memory+B+cells+isolated+from+blood+and+tonsils+are+functionally+distinctive%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive.</a> Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).</li>
<li>Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+polymerase+chain+reaction+assay+for+rapid+diagnosis+of+conjunctivitis%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adenovirus+latency+in+human+lymphocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines.</a> J Virol. 84, 8799-8810 (2010).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibody+formation+by+human+tonsil+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes.</a> J Immunol. 113, 608-616 (1974).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een van de belangrijkste factoren die de resultaten van dit protocol is het gebruik van verse tonsillar materiaal als het uitgangsmateriaal. Daarom moet de tonsil monsters wordt binnen 3 uur na de operatie. Amandelen kan worden verkregen van zowel volwassenen als kinderen. De tonsillar materiaal uit de kinderen gewoonlijk kleiner vanwege de gedeeltelijke chirurgische verwijdering van de amandelen (tonsillotomy). Daarom is het aantal MNO verkregen uit tonsillotomy monsters (1 x 10 7 x 10 -1 8) minde...

Tonsillen zijn verzamelingen van onvolledig ingekapselde lymfoïde weefsels die onder en in contact met het epitheel in de bovenste aerodigestieve tractus liggen. Meestal verwijst de term 'tonsillen' naar de palatine tonsillen die zich bevinden aan de laterale wanden van het orale deel van de farynx. De gepaarde palatine tonsillen samen met de nasofaryngeale tonsil (adenoïden), gepaarde tubale tonsillen en linguale tonsillen vormen de zogenaamde 'Waldeyer's ring'. Deze laatste is verantwoordelijk voor de eerste contact tussen ingeademde of ingeslikte pathogenen en de lymfoïde weefsels van de aerodigestieve tractus1,2. Inderdaad, talrijke rapporten hebben aangetoond dat zowel bacteriële als virale antigenen kunnen worden gedetecteerd in palatine tonsilweefselmonsters2-6.
De palatine tonsillen bestaan uit dicht lymfoïde weefsel bedekt door een gelaagd plaveiselepitheel dat niet keratiniseert. De tonsillen hebben talrijke crypten, epitheliale invaginaties, die het parenchym penetreren en het oppervlak vergroten. Histologisch bevatten de palatine tonsillen talrijke lymfoïde follikels met germinatiecentra, die de plaatsen zijn voor B-celmaturatie en differentiatie (B-celgebieden). Evenzo omvatten de palatine tonsillen T-cellen, die zich voornamelijk in de extrafolliculaire regio's bevinden (T-celgebieden). Naast de B- en T-cellen kunnen ook verschillende folliculaire dendritische cellen in palatine tonsillen worden gedetecteerd1,2.
Vanwege hun anatomische locatie zijn de palatine tonsillen gemakkelijk toegankelijk voor chirurgische ingrepen. Bijvoorbeeld, chirurgische verwijdering van tonsillen, bekend als tonsillectomie, wordt routinematig over de hele wereld uitgevoerd7. Bij kinderen met tonsillaire hyperplasie wordt soms een gedeeltelijke chirurgische verwijdering van de tonsillen (tonsillotomie) gebruikt, wat minder postoperatieve pijn voor de patiënten veroorzaakt. Gezien de accumulatie van verschillende pathogenen in tonsillen, bieden chirurgisch verwijderde tonsillen een unieke gelegenheid om de invloed van virale en bacteriële agentia op tonsillaire lymfocytfuncties te bestuderen2,8. Verder is het mogelijk om te bestuderen of sommige pathogenen de voorkeur geven om in specifieke celsubpopulaties te verblijven9. Bovendien, aangezien de tonsillen een rijke bron van B-lymfocyten zijn, kunnen geïsoleerde tonsillaire B-lymfocyten efficiënt worden gebruikt om de activiteit van verschillende B-celsubpopulaties te bestuderen10. Echter, aangezien de palatine tonsillen een mengsel van celtypen bevatten, is een efficiënte methode nodig om de verschillende celsubpopulaties te scheiden.
Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor efficiënte en snelle isolatie van tonsillaire B- en T-celpopulaties uit humane palatine tonsillen door gebruik van een magnetisch-geactiveerde celscheidingstechniek (Figuur 1). De hier beschreven methode is nuttig voor wetenschappers die de rol van verschillende infectieuze agentia in humane lymfoïde organen zoals palatine tonsillen willen beoordelen.

<table><tbody><tr><td>Hanks balanced salt solution (HBSS)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>Bevat 5% foetaal bovien serum (FBS), 10 mM Glutamine,&nbsp; &nbsp;0,05 mg/ml Gentamicin en 1% Antibiotic-Antimycotic mix</td></tr><tr><td>Freezing medium</td><td></td><td></td><td>90% FBS en 10% DMSO</td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td></td><td></td><td>PBS (pH 7,2), 0,5% BSA en 2mM EDTA</td></tr><tr><td>PBSA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS met 0,2% BSA</td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td>PBS met 1% paraformaldehyde (PFA). Maak vers. PFA wordt verdacht van kankerverwekkendheid. Draag handschoenen en een veiligheidsbril.</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic mix</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petrischaal</td><td>Nunc</td><td>150326</td><td></td></tr><tr><td>Dissectietang</td><td>Fisher Scientific</td><td>1381241</td><td></td></tr><tr><td>Rechte iris schaar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12912055</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp scalpels</td><td>Swann-Morton</td><td>REF 0501</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m plastic cel zeef</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m plastic cel zeefen&nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>2 ml plastic spuit</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conische centrifugebuizen</td><td>SARSTEDT</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische centrifugebuizen</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td></td></tr><tr><td>Laagsnelheidscentrifuge met vaste hoek of slingerende-emmer rotor</td><td>Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&ndash;Hypaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415-50ML</td><td>Ficoll oplossing</td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Biological industries</td><td>040071A</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfaat (DMSO)</td><td>SIGMA</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS kolommen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS menselijke CD3 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-881</td><td></td></tr><tr><td>MACS separator (Octo MACS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>Rund Serum Albumine (BSA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1120180100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AnalaR NORMAPUR</td><td>20302.293</td><td></td></tr><tr><td>CD2 geconjugeerd met allophycocyanine (CD2-APC)&nbsp;</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>560642</td><td></td></tr><tr><td>CD20 geconjugeerd met fluoresceïne isothiocyanate (CD20-FITC)&nbsp;</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>556632</td><td></td></tr><tr><td>Menselijk serum&nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D119-0100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>FACS buizen</td><td>BD Falcon</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube</td><td>SARSTEDT</td><td>72379</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRII flowcytometer</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 4.1 software</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Blood&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740951.50</td><td>DNA isolatie kit</td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp; reagent</td><td>Life technologies</td><td>15596</td><td>RNA isolatie reagent</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>The Paul Marienfeld GmbH &amp; Co. KG</td><td>0610030</td><td>celteller apparaat</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Nucleic zuur gel kleurstof&nbsp;</td></tr></tbody></table>

efficiënte isolatie protocol voor b- en t-lymfocyten van human palatine amandelen

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsillen vormen een deel van het immuunsysteem en vormen de eerste verdedigingslinie tegen ingeademde ziekteverwekkers. Meestal verwijst de term “tonsillen” naar de palatinale amandelen die zich aan de laterale wanden van het orale deel van de keelholte bevinden. Chirurgisch verwijderde palatinale amandelen bieden een gemakkelijke toegankelijke bron van B- en T-lymfocyten om de wisselwerking tussen vreemde ziekteverwekkers en het immuunsysteem van de gastheer te bestuderen. Dit videoprotocol beschrijft de dissectie en verwerking van chirurgisch verwijderde menselijke palatinale amandelen, gevolgd door de isolatie van de individuele B- en T-celpopulaties uit dezelfde weefselmonster. We presenteren een methode die efficiënt tonsillaire B- en T-lymfocyten scheidt met behulp van een antilichaafafhankelijk affiniteitsprotocol. Verder gebruiken we de methode om aan te tonen dat humaan adenovirus specifiek de tonsillaire T-celfractie infecteert. Het vastgestelde protocol is over het algemeen toepasbaar om efficiënt en snel tonsillaire B- en T-celpopulaties te isoleren om de rol van verschillende soorten ziekteverwekkers in tonsillaire immuunresponsen te bestuderen.

Een efficiënte scheiding van tonsillar MNO resulteert in sterk gezuiverde subpopulaties van B- en T-lymfocyten. Dit werd bevestigd door FACS analyse met anti-CD20 en anti-CD2 antilichamen voor B en T-lymfocyt populaties, respectievelijk (figuur 3A) te detecteren. Daarentegen, een inefficiënte scheiding van MNO leidt celfracties die een mengsel van cellen van zowel B- en T-lymfocyt subpopulaties (Figuur 3B). De geïsoleerde tonsillaire B- en T-lymfocyten <stro...

Palatinale amandelen zijn een rijke bron van B- en T-lymfocyten. Hier bieden we een eenvoudig, efficiënt en snel protocol om B- en T-lymfocyten te isoleren uit menselijke palatinale amandelen. De beschreven methode is specifiek aangepast voor studies naar de virale etiologie van amandelontsteking, bekend als tonsillitis.

Efficiënte isolatie protocol voor B- en T-lymfocyten van Human Palatine Amandelen

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van BNT-lymfocytenfracties uit menselijke amandelmonsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van virologie, zoals wat de rollen zijn van BT-lymfocytenfracties bij de pathogenese van virale ziekten. Binnen drie uur na de chirurgische verwijdering moet het amandelweefsel naar het laboratorium worden getransporteerd in een centrifugebuis van 50 milliliter, gevuld met ijskoud, steriel HBSS met supplementen.Pas vervolgens de passende biosafety-procedures toe die worden aanbevolen voor het hanteren van menselijk weefsel. Bevochtig het weefsel met vers supplement dat HBSS bevat en breng de amandelen over naar een plastic kweekplaat van 60 millimeter op ijs. Verwijder met een pincet alle zichtbare bloedstolsels of vet- en bindweefsel, en breng de amandelen vervolgens over naar een nieuwe plaat van 60 millimeter met vijf milliliter HBSS met supplementen.Snijd vervolgens het klontje tonsilweefsel in fragmenten van 3 tot 10 millimeter. Breng deze fragmenten daarna voorzichtig met de zuiger van een plastic injectiespuit over naar een plastic cell strainer van 100 micrometer in een nieuwe 60 millimete

efficient-isolation-protocol-for-b-t-lymphocytes-from-human-palatine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Isolatie van lymfocyten met behulp van de Miltenyi MAC-kit is een betrouwbare manier om cellen van hele lymfeweefsel homogenaten te zuiveren. Cellen gezuiverd met behulp van de Miltenyi systeem zijn meestal ≥ 96% zuiver. Hier tonen we de stappen die zijn genomen om CD4 + T-cellen, een van de vele kits worden aangeboden door Miltenyi isoleren.

Isolatie van CD4 + T-cellen van de muis lymfeknopen Met behulp van Miltenyi MACS Zuivering

In dit rapport beschrijven we een protocol voor het isoleren van zeer zuivere populaties van leucocyten dat tumoren te infiltreren. Dit protocol is een bewerking van de Miltenyi Biotech-protocol om opbrengst en zuiverheid voor het isoleren van cellen van complexe tumorweefsel te verbeteren.

Isolatie van immuuncellen van primaire tumoren

In this video, we demonstrate the isolation of B cells from human peripheral blood using biotinylated antibodies specific for non-B cells and streptavidin-conjugated magnetic microbeads.

Isolation and Purification of B Cells from Human Peripheral Blood

Met effector functies te onderscheiden van andere T-cel subsets, zijn Th17 cellen centraal zijn betrokken bij inflammatoire auto-immuniteit. Deze in vitro Th17 differentiatie protocol verschaft een middel om te bepalen of naïeve CD4 + T-lymfocyten kunnen differentiëren in Th17 cellen en hun rol bij auto-immuniteit en gastheerrespons verder te onderzoeken.

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

Hier bieden we een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en klonen van de schaarse T-cel entiteit van perifere Vδ1+CD4+ T-cellen die, zoals we onlangs hebben laten zien, een extrathymische αβ T-cel voorloper is. Deze techniek maakt het mogelijk om deze cellen kwantitatief te isoleren, klonen en efficiënt uit te breiden in ex vivo cultuur.

Isolatie en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur van Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-cellen, een Extrathymic αβT-cel Progenitor

Menselijk perifeer bloed wordt vaak gebruikt voor de beoordeling van de humorale immuunrespons. Hier worden de methoden beschreven voor het isoleren van menselijke B-cellen uit perifeer bloed, het differentiëren van menselijke B-cellen in antilichaam (Ab)-secreterende B-cellen (ASC's) in cultuur en het tellen van het totale aantal IgM- en IgG-ASC's via een ELISpot-assay.

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

In deze studie presenteren we een roman en effectieve protocol voor de isolatie van lymfocyten van Peyer van Patches (PPs), die vervolgens kunnen worden gebruikt voor in vivo en in vitro Functionele assays evenals stroom cytometrische studies van folliculaire T helper en germinal center B cellen.

Ontrafeling van de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit: geavanceerde en geoptimaliseerd lymfocyt isolatie Protocol van RattenUitrustingen Peyer van Patches

In het huidige protocol leggen we uit hoe je gemakkelijk tonsillar mononucleaire cellen van gezonde mensen verwerken en kweken die gedeeltelijke chirurgische tonsillectomie ondergaan om aangeboren immuunreacties bij activering te bestuderen, waarbij virale infectie in mucosale weefsels nabootst.

Isolatie van tonsillaire mononucleaire cellen om ex vivo ingeboren immuunreacties te bestuderen in een menselijk mucosale lymfoïde weefsel

Leer een snel protocol voor het isoleren van B- en T-lymfocyten uit humane palatine amandelen. Deze methode ondersteunt virologisch onderzoek naar de rol van lymfocyten bij virale infecties.

Efficiënte isolatie protocol voor B- en T-lymfocyten van Human Palatine Amandelen

Meer video's verkennen