Name: Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Leer hoe u muisspermatiden sorteert in vier zuivere populaties met flowcytometrie. Deze methode minimaliseert kruisbesmetting en ondersteunt moleculair onderzoek naar spermiogenese en chromatinehermodellering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dr Leonid Volkov en Éric Bouchard bedanken voor hun technisch advies over epifluorescentiemicroscopie. Financiële steun Gefinancierd door de Canadian Institutes of Health Research (subsidie ​​# MOP-93781) naar GB

Animal Care in overeenstemming was met de Université de Sherbrooke dier zorg en gebruik Comite. 1. Tube Voorbereiding <ol><li> De dag voor celsortering, voeg 1-2 ml warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) tot 5 ml polypropyleen buis met ronde bodem en met 15 ml en 50 ml polypropyleen conische buizen. Kritische stap: Zorg ervoor dat elke buis gebruikt in het protocol is gecoat. Opmerking: FBS coating voorkomt kiemcellen van het vasthouden aan de buis muren. </li><li> Langzaam mix O / N geroteerde bij 4 ° C te bekleden de buizen gelijkmatig met een rotator. </li><li> De volgende dag, verwijder FBS uit gecoate buizen door decanteren. <ol><li> * Kritische stap: Zorg ervoor dat de 5 ml polypropyleen ronde bodem buizen en de 15 en 50 ml buizen gebruikt voor celpreparaat (protocol stappen 2,1-2,11) volledig ontdaan van FBS te waaieren (dwz, onnauwkeurig afwijking van de kant stromen) te voorkomen. Gebruik een P200 pipet aan de FBS te verwijderen. <br/&gt; Opmerking: Overblijvende FBS in buizen voorafgaand aan het sorteren kan leiden tot een verlies aan cellen of verontreiniging van andere buizen tijdens celsortering </li><li> Laat een klein resterend volume van FBS (ongeveer 100-200 pi) in de polypropyleen 5 ml ronde bodem buizen gebruikt voor het verzamelen van gezuiverde cellen. </li></ol></li></ol> 2. Celbereiding <ol><li> Offeren een mannetje muis onder verdoving met behulp van O 2 / isofluraan (inductie bij 5% dan gehandhaafd op 2%), gevolgd door CO 2 stikken. </li><li> Accijnzen en decapsulate beide testes en gehakt met een klein schaartje in 500 ul van het sorteren van buffer in een 1,5 ml buis. </li><li> Flush kiemcellen van testes door zachtjes op en neer pipetteren in de 1,5 ml buis, eerst met een afgeknotte 100-1000 ul tip, en daarna met een intacte 100-1000 ul tip. </li><li> Verwijder puin en bosjes door een filtratie stap met behulp van een 40 um cel zeef en verzamel filtraat in de 50 ml conische buis previously bekleed met FBS in stap 1. </li><li> Was het filter eenmaal met sortering buffer tot een totaal volume van 3 ml en overdracht filtraat in de 15 ml conische buis vooraf bekleed in stap 1. </li><li> Voeg 16 ul van 50 mM EDTA pH 8 per milliliter celsuspensie (48 pi 3 ml) teneinde een uiteindelijke concentratie van 0,8 mM EDTA verkrijgen. </li><li> Om kiemcellen lossen, voeg langzaam 3 volumes ijskoude 100% ethanol met behulp van een 10 ml pipet zacht schudden (vortex bij lage snelheid), waarbij een melkachtige suspensie te produceren. Kritische stappen: langzaam toevoegen van ethanol essentieel en belangrijk voor de integriteit van het celpreparaat behouden. We merkten dat de snelle toevoeging van ethanol veroorzaakt cellysis resulteert in een belangrijke vermindering van sorteerefficiëntie. Voor een 3 ml celsuspensie moet 9 ml ethanol toegevoegd in ongeveer 1 minuut. </li><li> Incubeer cellen op ijs gedurende 15 minuten met af en toe mengen door inversie. </li><li> Centrifugeer celsuspensie op 800 g gedurende 5 minuten en verwijder de duidelijkesupernatant. </li><li> Voorzichtig resuspendeer de vaste kiemcellen in 2 ml buffer sorteren. </li><li> Voeg 4 pi SYTO16 DNA kleurstof (1 mM oplossing in DMSO) en incubeer gedurende ten minste 30 min (beschermd tegen licht). Opmerking: De beste resultaten worden verkregen sortering gebruikt SYTO16 omdat het een permeabele DNA kleurstof die gemakkelijk wordt opgenomen in de sterk verdichte kernen van spermatiden. </li></ol> 3. Cell Sorter Set Up Opmerking: Hier, een 4-laser (405 nm - violet, 488 nm - blauw, 561 nm - geel-groen, 633 nm - red) 20-parameter BDFACSAria III celsorteerder wordt gebruikt. De BD FACSDiva 6.1.3 software wordt gebruikt voor het visualiseren en analyseren van de data. De instellingen kunnen variëren afhankelijk van het type sorteerder gebruikt. <ol><li> Steriliseer de FACS sorter door het uitvoeren 70% ethanol als mantelvloeistof tijdens het fluidics afsluitprocedure (menu &quot;Cytometer&quot; in de software) voorafgaand aan sortering. Selecteer &quot;Cytometer&quot; in de werkbalk van de software en kies &quot;Fluidic shutdown &quot;. Volg de door de processen genoemde stappen. </li><li> Bereiden en filter 1x PBS met een 0,22 urn filter om eventuele kristallen en verontreinigingen elimineren. Vul het omhulsel tank naar de bovenste lasnaad aan de binnenzijde van de tank. </li><li> Start de software en loggen. Start de FACS sorter opwarmen van de lasers ten minste 30 min voor het sorteren. Lopen twee fluïde startup processen voor het spoelen van de ethanol uit de fluïdica. Selecteer &quot;Cytometer&quot; in de werkbalk van de software en kies &quot;Fluidic opstarten&quot;. Volg de met de werkwijzen genoemde stappen. Opmerking: Dit herstelt fluïdica normale mantelvloeistof (1x PBS). </li><li> Reinig de sortering blok en de afbuigplaten met gedestilleerd water en droog ze goed af. Sonificeer een 100 urn spuitmond geplaatst in een buis gedestilleerd water gedurende 2 min in een bad ultrasoonapparaat. Veeg het mondstuk grondig. </li><li> Plaats de 100 micrometer mondstuk in de stroom cel en draai de nozzle-vergrendeling met de klok mee naar de 12hr positie. Stel de huls druk tot 20 psi. </li><li> Schakel de stroom en de amplitude aan te passen aan streefwaarden verkrijgen van de frequentie (ongeveer 30), Drop 1 (ongeveer 150) en Gap (ongeveer 12) en een stabiele druppel breakoff patroon (enkele satelliet druppels) vast. Schakel demping. </li><li> Zorg ervoor dat de stroom is recht en raakt het midden van het afval aspirator door het veranderen van de hoek van het soort blok. Opmerking: Een 130 micrometer mondstuk bij 10 psi werd ook getest en geen duidelijke verschil werd gevonden. </li><li> Stel laser vertraging op 0 voor de blauwe, -77,39 voor de rode, 37,33 voor de violette en -39,85 voor de geel-groene lasers. </li><li> Set gebieden schalen om 1.14 voor de blauwe, 1.0 voor de rode, 0,75 voor de violette en 0.96 voor de geel-groene lasers. </li><li> Met behulp van een Test sorteren (in het venster &quot;zijstroom&quot; van de software), ervoor zorgen dat zij stromen worden niet waaieren. In het venster &quot;Side Stream&quot;, stel de spanning schuifregelaars van elke zijde stroom, zodat ze op de middle test collectie buis. Als het centrum stroom is niet strak, pas de 2 e, 3 e en 4 e daling instellingen naar het centrum stroom beperken. </li><li> Start de Cytometer Setup en Tracking (CS &amp; T) toepassing in de software (menu &quot;Cytometer&quot;). </li><li> Gebruik de cytometer opstelling en het bijhouden van kralen aan 1 druppel per 350 pi tot de karakterisering en het volgen van de cytometer prestaties met instructies van de fabrikant te automatiseren. </li><li> Stoppen met de toepassing CS &amp; T. Solliciteer CS &amp; T instelling, zorg ervoor dat de parameters stroom nog steeds mogelijk een stabiel druppel breakoff patroon, en zet de Sweet Spot knop zoals beschreven in de instructies van de fabrikant (in de &quot;breakoff venster&quot;). </li><li> Optimaliseren van de Drop Delay waarde met fluorescerende kralen (zie tabel van Materialen). <ol><li> Installeer de collectie buizen in de houder. Open het soort blok deur. In het venster &quot;Side Stream&quot;, schakel de spanning vervolgens selecteer &quot;Test soort &quot;en klik op de aanzuiger lade knop om de lade te openen en hebben toegang tot de collectie buizen. </li><li> Optimaliseer de kant stromen, zodat zij in het midden van de buis. Waarden en sliders aanpassen als dat nodig is. </li><li> Sluit het soort blok deur en zorg ervoor dat de meetklokje aan te passen aan de helderste kraal plek in het centrum te krijgen. Unselect afval lade, testen sorteren en spanning. Verwijder de verzamelbuizen. </li><li> Optimaliseren van de drop delay volgens de instructies van de fabrikant. <ol><li> In het kort, schud krachtig kralen flesje en verdun 1 druppel kralen in 0,5 ml PBS. </li><li> Met behulp van instructies van de fabrikant, zet de daling vertraging met de Drop Delay experiment sjabloon beschikbaar zijn in de software. U kunt ook de functie Auto Drop Vertraging de daling vertraging instellen. </li><li> Laad de buis van fluorescerende kralen en stel het debiet tot de drempel bedraagt ​​~ 3000 tot 4000 events / seconde. Stel het soort precisie &quot;Initial&quot; en de uiteindelijkely naar &quot;Fijnafstemming&quot; in het venster &quot;Sort layout&quot;. Selecteer het optische filter en sorteren kralen. Pas de Drop Vertraging tot ~ 100% zijn gesorteerd naar links. Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de cellen van belang soort in een zijstroom. De korrels en het optische filter worden gebruikt nabij een 100% druppeltje afwijking te bereiken. </li></ol></li></ol></li><li> Plaats een FSC 1.5 ND (neutrale dichtheid) filter aan de linkerkant van het FSC-detector blok. Stel het venster uitbreiding tot 2,00 microseconden en de FSC Area scaling tot 1,00 (in het tabblad &quot;Laser&quot; in het venster &quot;Cytometer&quot;). </li><li> Voordat u steekproef buis, plaats een steekproef filter lijn van 50 pm aan het einde van het monster lijn om klonteren te voorkomen. Om dit te doen, selecteer &quot;Wijzig Sample Filter&quot; in het menu &quot;Cytometer&quot;. </li><li> Test de samenstelling van het fluïdummonster om een ​​goede scheiding te bereiken zonder fanning tussen zijstroom en te voorkomen dat de cellen te plakken aan de Polypropylene buizen. <ol><li> Laad de steekproef buis, zet de afbuigplaten en selecteer &quot;Test soort&quot; met de lade gesloten. Kijk naar kant stromen als scheiding gebeurt zonder al te veel waaien. Opmerking: Fanning is waarschijnlijk te wijten aan een hoge eiwitconcentratie in het monster buffer. </li></ol></li><li> Laad het monster buis in de FACS instrument. Selecteer een monster roeren van 300 opm en een monstertemperatuur van 4 ° C. Selecteer &quot;Data Acquire&quot; in de &quot;Acquisitie Dashboard&quot;. </li><li> Eventueel Verdun het monster met een geschikte incidentie maximaal 5000 events / sec bereikt (met een maximale stroomsnelheid van 3,0). Strikt aan deze grenzen teneinde de zuiverheid van de gesorteerde cellen te behouden. </li><li> Te analyseren en sorteren van de cellen, het optimaliseren van de FSC drempelwaarde om vuil te verwijderen zonder zich te bemoeien met de bevolking van belang. In logaritmische schaal, stel de spanning van de foto-multiplier tube (PMT) detector met de 530/30-filter om ervoor teervoor dat het fluorescentiesignaal van de totale bevolking past binnen de schaal en de poort van de positieve populatie (Figuur 1, poort 1). </li><li> Maak een Forward Scatter-gebied (FSC-A) / Side Scatter-gebied (SSC-A) plot van de SYTO16 positieve populatie en pas het FSC-A tot ongeveer 110 V in lineaire schaal, en het SSC-A tot ongeveer 150 V in logaritmische schaal te visualiseren alle gebeurtenissen onder uitsluiting zeer grote cellen en celaggregaten. </li><li> In de &quot;Sort Layout&quot; venster, zet de &quot;Sort Precision Mode&quot; tot &quot;4-way zuiverheid &#39;(Opbrengst masker: 0, zuiverheid Masker: 32, Phase Mask: 0). Selecteer &quot;Continuous&quot; in het menu &quot;Doel Events&quot; voor continue sorteren. </li><li> Naar populaties sorteren in het veld die overeenkomt met de buizen (de &quot;sorteren Layout&quot; venster). Plaats populaties met hogere frequenties in het midden en met lagere frequenties aan de uiteinden. Stel de spanning platen tot 2.500 V. Tijdens het sorteren, houden het monster collectie tUbes op ijs. </li></ol> 4. Cell Sorting <ol><li> Onmiddellijk voor het sorteren, filter cellen met behulp van een 50 urn filter in een eerder beklede 5 ml polypropyleen buis met ronde bodem. </li><li> Was het filter uitgebreid met 1-2 ml van het sorteren buffer. </li><li> Sorteer vaste kiemcellen met behulp van een 488 nm-laser uitgerust celsorteerder na de gating schema beschreven in figuur 1. Verzamel gezuiverde fracties in 5 ml polypropyleen ronde bodem buizen eerder bekleed in paragraaf 1 op ijs. <ol><li> Zorg ervoor dat 100-200 gl FBS gehouden in de verzamelbuizen om kleven van de gesorteerde cellen naar de buiswand te voorkomen. </li><li> Zorg ervoor dat de concentratie van SYTO16 is verzadigen met fluorescentie schommelingen tijdens het sorteren periode te voorkomen. SYTO16 wordt verzadigen wanneer er geen verdere variatie van cel kleuring intensiteit bij de Alexa Fluor 488 parameter (DNA-kleuring) in het sorteercentrum graphics. Indien nodig, voeg 1 plSYTO16 naar de sorteerruimte buis verzadiging te bereiken. </li><li> Geef het totale events een grafische weergave van de volgende parameters: aantal gebeurtenissen vs Alexa Fluor 488-A. </li><li> Selecteer de positieve DNA kleuring cellen met Gate 1, zie figuur 1. <ol><li> Weergave cellen van poort 1 op een afbeelding met behulp van SSC-A vs FSC-A als parameters <ol><li> Selecteer de cellen met poort 2, zoals getoond in figuur 1. </li><li> Weergave cellen van Gate 2 op een grafische met FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als parameters. </li><li> Selecteer cellen met Gate 5 en Gate 6 op Gate 2 grafisch, zoals aangetoond in figuur 1. </li><li> Weergeven afzonderlijk Gate 5 en Gate 6 op graphics met Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als parameters. </li><li> Selecteer spermiogenese stappen 1-9 spermatiden op de Poort 5 grafische en spermiogenese stappen 10-12 spermatiden op de Poort 6 graphics, zoals getoond in figuur 1. </li></ol></li><li> Beeldschermcellen van poort 1 een grafische behulp FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als parameters <ol><li> Selecteer cellen met Gate 3 en Gate 4, zoals getoond in figuur 1. </li><li> Weergeven afzonderlijk Gate 3 en Gate 4 op de graphics met Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als parameters. </li><li> Selecteer spermiogenese stappen 13-14 spermatiden op de Gate 3 grafische en spermiogenese stappen 15-16 spermatiden op de Poort 4 grafisch, zoals getoond in figuur 1. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+fertile+sperm+from+murine+spermatogonial+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines.</a> Nat. Commun. 2, 472(2011).</li>
<li>Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+actin+and+myosin+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">The role of actin and myosin during spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+junction+dynamics+in+the+testis%3A+Sertoli-germ+cell+interactions+and+male+contraceptive+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development.</a> Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).</li>
<li>Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+the+murine+testis+during+the+first+wave+of+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+during+chromatin+remodeling+in+elongating+spermatids+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice.</a> Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).</li>
<li>Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+transition+nuclear+proteins+in+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis.</a> Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).</li>
<li>Grégoire, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-driven+de+novo+mutations+in+haploid+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Male-driven de novo mutations in haploid germ cells.</a> Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).</li>
<li>Simard, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+trinucleotidic+repeats+during+chromatin+remodeling+in+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids.</a> Hum. Mutat. , (2014).</li>
<li>Wykes, S. M., Krawetz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+spermatogenic+cells+from+adult+transgenic+mouse+testes+using+unit-gravity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation.</a> Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).</li>
<li>Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+throughout+the+first+wave+of+spermatogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat.</a> Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+specific+stages+of+spermatids+from+vitamin+A-synchronized+rat+testes+for+assessment+of+nucleoprotein+changes+during+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis.</a> Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).</li>
<li>van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+the+seminiferous+epithelium+after+vitamin+A+replacement+in+vitamin+A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice.</a> Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Kovtun, I. V., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+expansion+in+haploid+germ+cells+by+gap+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair.</a> Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).</li>
<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li>
<li>Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+method+to+isolate+round+spermatids+from+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis.</a> Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Spermatogenese cellen altijd uitdagend om te studeren gezien de complexiteit van de seminiferus epitheel, en het beperkte succes van in vitro kweek. In de loop der jaren vele benaderingen zuiveren kiemcellen van verschillende species ontwikkeld. Sedimentatie technieken met behulp van de zwaartekracht zuiveren met Percoll of runderserumalbumine hellingen bieden meestal een goede opbrengst van intacte kiemcellen, maar gebrek aan een goede definitie tussen sommige celtypen, zoals de meiose tetraploïde cellen en sp...

Haploïde ronde spermatiden differentiëren in spermatozoa door een proces dat spermiogenese wordt genoemd. Dit omvat veel verschillende stappen, waaronder het verkrijgen van een flagellum, remodellering van chromatine en cytoskelet, verdichting van de kern, evenals het verlies van het grootste deel van het cytoplasma. Deze unieke cellulaire gebeurtenissen moeten nauwkeurig worden gereguleerd om een volwaardige functionele gameet te produceren met een intact genoom dat geschikt is voor bevruchting. Spermiogenese kan nauwelijks in vitro worden bestudeerd, omdat geen enkel betrouwbaar celkweeksysteem tot nu toe in staat is geweest om de voortgang door de verschillende stappen van het proces te ondersteunen. Bovendien leiden actuele in vitro technieken tot een slecht rendement1,2. In vivo zijn goede overgangen door de verschillende stappen van spermiogenese cruciaal voor de natuurlijke functionele integriteit van de mannelijke gameet. Succesvolle zuivering van spermatiden volgens hun differentiatiestappen is nog nooit bereikt met een niveau van verrijking dat moleculaire karakterisering van spermiogenese mogelijk maakt. Bijvoorbeeld, zuivering van sleutelstappen van de spermatidale differentiatie zou bijzonder nuttig zijn om het zich ontwikkelende acrosoom, vorming van het middenstuk3, celverbindingsdynamiek4, RNA-dynamiek5, chromatineremodelleringsproces6,7 of genomische stabiliteit8 te bestuderen. Zuivering van spermatiden is bemoeilijkt door hun progressieve morfologische transformatie, het ontbreken van bekende fase-specifieke externe biomarkers, en hun eigenaardige vorm en grootte. 
Hoewel de meeste mannelijke kiembaancellende een directe relatie vertonen tussen DNA-kleuring en ploïdie (DNA-inhoud), bemerkten we dat een dergelijke positieve correlatie niet langer van toepassing is op spermatiden. Dit komt voort uit onze vroege waarneming dat secties van de zaadleestjes een variabele intensiteit van DNA-kleuring vertonen gedurende de verschillende stappen van spermiogenese. Hoewel DNA-kleuring consistent is met hun haploïde set chromosomen van spermiogenese stappen 1 tot 7 (ronde spermatiden), observeerden we een scherpe toename in fluorescentie-intensiteit met DAPI of SYTO 16 rond het begin van nucleaire reorganisatie en chromatineremodellering (spermiogenetische stap 8) die een piek bereikt bij het begin van nucleaire verdichting (spermiogenetische stappen 11-12). Na verdichting van de kern neemt de DNA-kleuringsintensiteit af tot spermiëring (spermiogenetische stap 16). We veronderstelden dat dit waarschijnlijk verband hield met de vorming van hun eigenaardige chromatinestructuurtransitie waarbij histonen worden vervangen door protaminen. Daarom ontwikkelden we een betrouwbare flowcytometrie-methode die de scheiding van spermatiden mogelijk maakt door gebruik te maken van de variatie in DNA-intensiteit van spermatiden als een belangrijk selectieparameter.
Een eenvoudige flowcytometrie-aanpak wordt beschreven om muis-spermatiden met hoge zuiverheid (95-100%) te scheiden op basis van hun schijnbare DNA-inhoud (SYTO16-kleuring), grootte en granulositeit. Spermatiden worden gescheiden in vier populaties; spermiogenese stappen 1-9, 10-12, 13-14 en 15-16. Gezuiverde spermatiden zijn geschikt voor genetische/genoomanalyse, evenals voor proteomische toepassingen zoals beschreven in een recente publicatie van onze groep9.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>Voor muisanesthesie vóór euthanasie</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>Voor buiscoating</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>Voor bereiding sorteerbuffer</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>Voor bereiding sorteerbuffer</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>Voor celfixatie</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>DNA-kleuring</td></tr><tr><td>5 ml polypropyleen rondbodembuizen</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Verzamelen gesorteerd cellen</td></tr><tr><td>15 ml polypropyleen kegelbodembuizen</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropyleen kegelbodembuizen</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>TEC4 anesthesie verdamper</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>Voor muiseuthanasie</td></tr><tr><td>CO2 gastank</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>Voor muiseuthanasie</td></tr><tr><td>O2 gastank</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>Voor muiseuthanasie</td></tr><tr><td>Zelfgemaakte muis gaskamer</td><td></td><td></td><td>Voor muiseuthanasie</td></tr><tr><td>40 &micro;m Falcon celzeef</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu;m monsterlijnfilters</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>Voor celfixatie</td></tr><tr><td>Dynac centrifuge</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 &micro;m filters</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser-uitgeruste celsorteerder</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop Fluorescerende Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>Sorteerbuffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS is verhit ingeactiveerd. Maak verse oplossing, 0,22 &mu;m gefilterd en bewaar bij 4&deg;C.</td></tr></tbody></table>

stap-specifieke sorteren van muis spermatiden door flowcytometrie

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

De differentiatie van muis spermatiden is een kritisch proces voor de productie van een functionele mannelijke gameet een intact genoom aan de volgende generatie over te dragen. Tot nu toe zijn moleculaire studies van deze morfologische overgang belemmerd door het ontbreken van een methode waarmee een goede scheiding van deze belangrijke stappen spermatide differentiatie voor latere analyses. Eerdere pogingen tot goede gating van deze cellen via flowcytometrie kan moeilijk zijn omdat een bijzondere toename DNA fluorescentie in spermatiden ondergaan chromatine hermodellering. Op basis van deze waarneming, geven we gegevens van een eenvoudige flowcytometrie regeling, waardoor reproduceerbare zuivering van vier populaties van muis met ethanol vaste spermatiden, die elk een andere toestand in het vernieuwingsproces kern. Bevolking verrijking wordt bevestigd met behulp van stap-specifieke merkers en morfologische criteria. Het gezuiverde spermatiden kan worden gebruikt voor genomische en proteomic analyses.

Gating strategie gebruikt met flowcytometrie Figuur 1 geeft de gating strategie gebruikt flowcytometrie vier zeer zuiver spermatide populaties sorteren. In het kort, cellen met positieve DNA kleuring (Alexa Fluor 488-A) worden eerst geselecteerd met Gate 1. Spermatiden van spermiogenese stappen 1-12 worden geselecteerd (Gate 2) op een dot plot die de granulosity (SSC-A) versus grootte (FSC -A) vanaf Gate 1. Ve...

We beschrijven een sorteerstrategie voor muis spermatiden met behulp van flowcytometrie. Spermatiden worden ingedeeld in vier zeer zuivere populaties, waaronder ronde (spermiogenetische stappen 1-9), vroege verlengende (spermiogenetische stappen 10-12), late verlengende (spermiogenetische stappen 13-14) en langwerpige spermatiden (spermiogenetische stappen 15-16). DNA-kleuring, grootte en korreligheid worden gebruikt als selectieparameters.

Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Het algemene doel van deze procedure is om muisspermatiden te scheiden in vier afzonderlijke populaties, waardoor moleculaire studie van de spermiogenese mogelijk wordt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van reproductie, zoals wat de impact is van chromatine-modellering op de genomische integriteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het scheiding van sperma in zuivere celpopulaties mogelijk maakt zonder kruiscontaminatie.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we belangrijke variaties in de intensiteit van de DNA-kleuring observeerden tijdens chromatineremodellering in haplo-parameters op de dag vóór de cel sortering. Voeg één tot twee milliliter hitte-inactiverd FBS toe aan vijf milliliter polypropyleen ronde bodembuisjes, en 15 en 50 milliliter polypropyleen conische buizen. Coat vervolgens de buizen langzaam door ze de volgende dag gedurende de nacht op een rotator bij vier graden Celsius om te keren.Giet het FBS voorzichtig af met een P 200 pipet om elk residu van FBS uit de 15 en 50 milliliter buisjes te verwijderen, waarbij een klein residuvolume van 100 tot 200 microliters FBS in de vijf milliliter buisjes wordt achtergelaten voor het opvangen van de gezuiverde cellen op de dag van de cel-sortering; snipper de ingekapselde teststukken in 500 microliters sorteerbuffer. Draag de weefselfragmenten vervolgens over naar een 1,5 milliliter buisje met behulp van een afgeknotte micropipetpunt.Spoel de kiemcellen uit de zaadbuisjes door voorzichtig op en neer te pipetteren, gevolgd door uitspoelen met een intacte tip. Gebruik vervolgens een cellenzeef van 40 micron om debris en klontjes te verwijderen, waarbij het filtraat wordt opgevangen in een met FBS gecoate conische buis van 50 milliliter. Was het filter één keer met sorteerbuffer tot een totaalvolume van drie milliliter en breng het filtraat over in een met FBS gecoate conische buis van 15 milliliter.Voeg vervolgens 16 µL EDTA per milliliter cel-suspensie toe aan de cellen en gebruik een pipet van 10 mL om de cellen gedurende één minuut langzaam te fixeren met drie volumes ijskoude, 100% ethanol onder langzaam vortexen; de suspensie wordt na fixatie melkachtig. Incubeer de cellen 15 minuten op ijs met af en toe omkeren. Centrifugeer vervolgens de cel-suspensie, resuspendeer de pellet in twee milliliter sorteerbuffer en kleur de kiemcellen direct voor het sorteren met vier µL cyto 16 DNAD.Filter de cellen door een 50 micron filter in een met FBS gecoate fax-buis en was het filter uitgebreid met één tot twee milliliters sorteerbuffer. Laad de gefixeerde kiemcellen op een cel sorter die is uitgerust met een 488 nanometer laser. Toon vervolgens de totale gebeurtenissen met een histogram dat het aantal gebeurtenissen afzet tegen het Alexa fluor 488-oppervlak en gate de cellen met een positieve DNA-kleuring.Toon vervolgens de cellen van deze gate in een plot van side scatter area tegenover forward scatter area en gate deze. Toon de geselecteerde cellen vervolgens in een plot van forward scatter area tegenover Alexa Fluor 488 area en gate deze. Toon deze gates vervolgens opnieuw in aparte plots van Alexa Fluor 488 width tegenover Alexa Fluor 488 area.De stappen 1 tot en met 9 en 10 tot en met 12 van de spermiogenese. Spermatiden kunnen vervolgens worden gegated voor sortering om de stappen 13 tot en met 14 en 15 tot en met 16 te verzamelen. Spermatiden tonen de cellen uit de eerste gate in een forward scatter-gebied tegenover een EXOR 4 88-oppervlakteplot en gate.De celpopulaties zoals aangegeven. Toon vervolgens deze gates in individuele plots van Alexa Fluor 488 breedte tegenover Alexa Fluor 488 oppervlakte en gate.De stappen 13 tot en met 14 en 15 tot en met 16 worden herhaald voor het sorteren van de spermacellen. Verzamel tenslotte de gezuiverde fracties in 100 tot 200 µL FBS in individuele met FBS gecoate buisjes van vijf milliliter met een ronde bodem op ijs. In deze afbeeldingen wordt de DAPI-kleuring van de via flowcytometrie gesorteerde populaties getoond.De spermatiden in de spermiogenesestappen één tot en met negen vertonen doorgaans ronde kernen die tijdens de spermiogenese ovaalvormig worden. Spermatiden in stap negen en die in stappen 10 tot en met 12 worden waargenomen, vertonen verlengde haken. Spermatiden in de spermiogenesestappen 13 tot en met 14 en 15 tot en met 16 vertonen kernen met een vergelijkbare vorm, maar met een enigszins verschillende DNA-kleuringsintensiteit, waardoor deze verschillende spermapopulaties kunnen worden geïdentificeerd tijdens hun sortering via flowcytometrie.Volgens het gedemonstreerde protocol kan de zuiverheid van de individuele onderzochte S-populaties worden verwacht tussen de 95 en 100%. Deze techniek kan in zes tot acht uur worden voltooid, mits elke stap correct wordt gevolgd. Men dient eraan te denken de cellen gedurende de gehele procedure altijd op ijs te houden; door deze procedure te volgen kunnen aparte populaties spermacellen worden verkregen, wat een voldoende hoeveelheid materiaal oplevert voor moleculaire analyse, zoals het karakteriseren van het dramatische remodelleringsproces of het bestuderen van de genetische impact van deze transitie.

step-specific-sorting-of-mouse-spermatids-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een efficiënte methode om in hoge mate gezuiverd levensvatbare meiotische fracties te verkrijgen van de muis testis wordt beschreven, die een combinatie van een verfijnde cel dissociatie protocol met TL-geactiveerde cel sortering (FACS). Deze methode maakt gebruik van verschillen in het DNA-gehalte en de nucleaire dichtheid van discrete meiotische fracties.

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

Een nieuw protocol voor de mechanische voorbehandeling van testiculaire celsuspensies van knaagdieren materiaal vermijden enzymen en wasmiddelen wordt beschreven. De methode is eenvoudig, snel, reproduceerbaar en maakt goede kwaliteit celsuspensies, die geschikt zijn voor flow sorteren en RNA-extractie zijn.

Eenvoudige en doeltreffende techniek voor de bereiding van testikels Cell Schorsingen

De STA-PUT methode zorgt voor de scheiding van verschillende populaties van spermatogenese cellen op basis van grootte en dichtheid.

Scheiding van spermatogene Cell typen met behulp van STA-PUT Velocity Sedimentatie

Meiose is het ontwikkelings proces waaraan gameten worden gevormd door een ronde van DNA-replicatie en twee opeenvolgende ronden van chromosoom segregatie. Zoogdieren meiose kan worden onderzocht met behulp van een techniek ter voorbereiding Meiotische chromosoom spreads. Hier tonen we een methode voor te bereiden oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten.

Voorbereiding van Meiotische chromosoom verspreidt van muis spermatocyten

Dit werk beschrijft de standaardisatie van een methode om zuivere kiemcelpopulaties te verkrijgen uit testicularweefsel van verschillende zoogdieren. Het is een eenvoudig protocol dat mechanische testis dissociatie combineert, vlekken met Hoechst-33342 en propidiumjodide, en FACS-sortering, met brede toepassingen in vergelijkende studies van mannelijke voortplantingsbiologie.

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Het doel van deze zaadvormende squash techniek is te snel beoordelen cytologische kenmerken van ontwikkeling van muis spermatocyten cellulaire integriteit aan te tasten. Deze methode zorgt voor de studie van alle stadia van de spermatogenese, en kan gemakkelijk worden toegepast naast andere biochemische en moleculaire biologische benaderingen voor de studie van muis meiose.

Een Seminiferous zaadvormende Squash techniek voor de cytologische analyse van de spermatogenese met behulp van het muismodel

Gepresenteerd hier is een protocol voor het verrijken van pachytene spermatocyten, ronde spermatiden, en rek spermatiden uit volwassen muis testes met behulp van een discontinu bovine serumalbumine dichtheidsgradiënt met standaard laboratoriumapparatuur.

Verrijking van Pachyteen spermatocyten en spermatiden van muis testes met behulp van Standaard laboratoriumapparatuur

Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode om levende meiotische en post-meiotische kiemcellen te isoleren van volwassen muispesten. Met behulp van een lage cytotoxiciteit, violet-opgewonden DNA bindende kleurstof en fluorescentie-geactiveerde celsorde, kan men zeer verrijkte spermatogene celpopulaties isoleren voor vele downstream toepassingen.

Isolatie van Murine Spermatogenic Cellen met behulp van een Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Dit artikel meldt een in vivo remming van CENP-E door middel van abdominale chirurgie en testiculaire injectie van GSK923295, een waardevol model voor mannelijke meiotische deling. Met behulp van de immunofluorescentie, flowcytometrie en transmissie-elektronenmicroscopietests tonen we aan dat CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking en genoominstabiliteit in spermatocyten van muizen.

Functionele beoordeling van kinesine-7 CENP-E in spermatocyten met behulp van in vivo remming, immunofluorescentie en flowcytometrie

Hier introduceren we een methode voor het uitvoeren van ronde spermatide-injectie (ROSI) bij muizen, een techniek met veelbelovende klinische toepassingen en bruikbaarheid voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de embryonale ontwikkeling.

Muis Ronde Spermatide Injectie

Leer hoe u muisspermatiden sorteert in vier zuivere populaties met flowcytometrie. Deze methode minimaliseert kruisbesmetting en ondersteunt moleculair onderzoek naar spermiogenese en chromatinehermodellering.

Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie

Meer video's verkennen