Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie

Het algemene doel van deze procedure is om muis spermatides te scheiden in vier verschillende populaties, waardoor de moleculaire studie van spermiogeneze mogelijk wordt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van spiegelreproductie, zoals wat de invloed is van chromatische modellering op genomische integriteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een scheiding van sperma in zuivere celpopulaties biedt zonder kruisbesmetting.

We kregen het idee voor deze methode voor het eerst toen we belangrijke variaties in de DN-kleuringsintensiteit waarnamen tijdens chromatine-remodellering in haplo-parameters op de dag voor het celsorteren. Voeg een tot twee milliliters hitte-geïnactiveerd FBS toe aan vijf milliliter polypropyleen ronde bodem en 15 en 50 milliliter polypropyleen conische buizen. Bekleed vervolgens de buizen langzaam door overnacht inversie bij vier graden Celsius op een rotator de volgende dag.

Decanteer voorzichtig het FBS met behulp van een P 200 pipette om eventueel resterend FBS uit de 15 en 50 milliliter buizen te verwijderen en laat een klein restvolume van 100 tot 200 microliters FBS in de vijf milliliter buizen achter voor het verzamelen van de gezuiverde cellen op de dag van de cel. Sorteer, hak de ingekapselde teststukken in 500 microliters sorteerbuffer. Breng vervolgens de weefselfragmenten over in een 1,5 milliliter buis met behulp van een verkort micropipettip.

Spoel de kiembaancell uit de halfronde buisjes met zacht op en neer pipetten, gevolgd door spoelen met een intacte tip. Gebruik vervolgens een 40 micron celzeef om het puin en de klonten te verwijderen en verzamel het filtraat in een met FBS beklede 50 milliliter conische buis. Was de filter eenmaal met sorteerbuffer tot een totaal volume van drie milliliter en breng het filtraat over in een met FBS beklede 15 milliliter conische buis.

Voeg vervolgens 16 microliters EDTA per milliliter celsuspensie toe aan de cellen en gebruik een 10 milliliter pipette om de cellen langzaam gedurende één minuut te fixeren met drie volumes ijskoud, 100% ethanol terwijl je laagsnelheid vortext, de suspensie zal melkachtig worden na fixatie. Incubeer de cellen op ijs gedurende 15 minuten met incidentele inversie. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie, suspendeer de pallet in twee milliliter sorteerbuffer en kleed de kiembaancell onmiddellijk vóór het sorteren met vier microliters cyto 16 DNAD.

Filter de cellen door een 50 micron filter in een met FBS beklede faxbuis en was de filter uitgebreid met een tot twee milliliter sorteerbuffer. Laad de gefixeerde kiembaancell op een celsorteerder uitgerust met een 488 nanometer laser. Geef vervolgens de totale gebeurtenissen weer met een histogram dat het aantal gebeurtenissen weergeeft tegen de Alexa Floor 4 88 gebied en poort de positief DNA gekleurde cellen.

Geef vervolgens de cellen van deze poort weer in een zijwaartse verstrooiingsgebied tegen een voorwaarts verstrooiingsgebied plot en poort. De cellen zoals aangegeven, geef deze poort cellen weer in een voorwaarts verstrooiingsgebied tegen een Alexa Floor 4 88 gebied, plot en poort. De cellen opnieuw, geef vervolgens deze poorten weer in afzonderlijke Alexa Floor 4 88 breedte tegen Alexa Floor 4 88 gebied plots.

De spermiogenesetappen een tot negen en 10 tot 12. Spermatides kunnen vervolgens worden gepoort voor sorteren om stappen 13 tot 14 en 15 tot 16 te verzamelen. Spermatides geven de cellen van de eerste poort weer in een voorwaarts verstrooiingsgebied tegen een EXOR 4 88 gebied plot en poort.

De celpopulaties zoals aangegeven. Geef vervolgens deze poorten weer in individuele Alexa. Floor 4 88 breedte tegen Alexa Floor 4 88 gebied plots en poort.

De stappen 13 tot 14 en 15 tot 16 sperma voor sortering. Verzamel tenslotte de gezuiverde fracties in 100 tot 200 microliters FBS in individuele met FBS beklede vijf milliliter ronde bodem buizen op ijs. In deze afbeeldingen wordt de dappy-kleuring van de door flow gesorteerd gesmolten populaties getoond.

De spermiogenesetappen een tot negen spermatides vertonen meestal ronde kernen die in spermiogeneze ovaal gevormd lijken. Stap negen spermatides, en die worden waargenomen als langwerpige haken in stappen 10 tot 12. Spermatides spermiogenesetappen 13 tot 14 en 15 tot 16 spermatides vertonen kernen met een vergelijkbare vorm, maar met een iets verschillende DNA-kleuringsintensiteit, wat deze verschillende sperpopulaties toelaat om tijdens hun sortering door flowcytometrie te worden geïdentificeerd.

Volgens het gedemonstreerde protocol kan de zuiverheid van de individuele S-experimentenpopulaties worden verwacht tussen 95 en 100% Deze techniek kan in zes tot acht uur worden voltooid. Als elke stap goed wordt gevolgd. Het is belangrijk om te onthouden om de cellen gedurende de procedure altijd op ijs te houden. Door deze procedure te volgen, kunnen duidelijke populaties van sperma worden verkregen, wat voldoende materiaal biedt voor moleculaire analyse, zoals het karakteriseren van het dramatische remodelleringsproces of om de genetische impact van deze overgang te bestuderen.