Name: Synthese van Keratine-gebaseerde Nanovezel voor Biomedische Technologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Leer de elektrospinningtechniek voor de synthese van keratine-gebaseerde nanovezels met toepassingen in weefselengineering en wondgenezing. Deze methode ondersteunt celgroei en is schaalbaar voor biomedisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Auteurs willen graag bedanken National Science Foundation door middel van Engineering Research Center for radicale Metallic Biomaterialen (ERC-0812348) en Nanotechnologie Undergraduate Education (EEG 1.242.139) voor de financiering van steun.

Alle protocol volgt de richtlijnen van de North Carolina A &amp; T State University Bureau voor Onderzoek Compliance and Ethics. 1. Chemische Voorbereiding voor Keratine Extraction 4 <ol><li> Ter voorbereiding 1000 ml 2% gew / vol oplossing van perazijnzuur (PAS), onder een afzuigkap voeg 20 ml perazijnzuur aan 980 ml gedeïoniseerd (DI) water. </li><li> Tot 1000 ml van 100 mM Tris-base-oplossing (TBS) te bereiden, voeg 12,2 g Tris Base tot 1000 ml DI water en roer tot volledig opgelost. </li><li> Bereid verdunde zoutzuuroplossing (DHAS) in een zuurkast door gieten 4 ml geconcentreerd zoutzuur in 30 ml DI water. </li><li> Procure ongeveer 20 g menselijk haar knipsels die niet chemisch zijn behandeld of gewijzigd. Haar kan elke lengte zijn. </li><li> Was het haar grondig, met de hand, met warm water en zeep. Gebruik gedeïoniseerd (DI) water voor de laatste spoeling. </li><li> Zet het haar in twee 600 ml bekers en plaats in een 80 ºC oven voor 1 uur. </li><li> Giet de vloeistof uit de bodem van het bekerglas en zet terug in de oven tot het haar volledig droog. </li><li> Verdeel droog haar gelijkmatig tussen de 600 ml bekers, het plaatsen van 10 g van haar in elke beker. Heeft het haar om meer dan 500 ml vullen niet toestaan. </li><li> Giet 500 ml PAS in elk bekerglas zorg ervoor dat alle haren te bedekken. Bedek de bekers met parafilm en op te slaan voor 12 uur. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Keratine Extract Solution <ol><li> Scheid het haar van PAS met een 500 urn zeef. Verzamel het afval PAS in een aparte container. Spoel het haar grondig met DI water om eventuele overgebleven PAS verwijderen. </li><li> Plaats de gespoeld haar in een 500 ml kolf. Schenk 400 ml TBS in de kolf, om ervoor te zorgen dat het haar bedekt is. Cuvette in een schudbad ingesteld op 38 * C, 65 rpm gedurende 1 uur. </li><li> Na 1 uur, te verwijderen uit het schudden bad en giet de vloeistof, ongeveer 400 ml van keratine extractie-oplossing (KES), into een 1000 ml beker. </li><li> Giet 400 ml DI water in de kolf die het haar verzekeren dat het haar is bedekt en terugplaatsen in de schudbad gedurende 1 uur. Neem de kolf uit het bad te schudden en giet de resterende 400 ml van de KES in de 1000 ml beker met de eerder verzamelde KES. Het haar is niet meer nodig en kan uit de fles worden gedumpt en weggegooid in de dichtstbijzijnde prullenbak bakje. </li></ol> 3. Concentratie van Keratine Extract Solution <ol><li> Vul rotodistiller bad naar de bovenste regel met gedestilleerd water en ingesteld op 90 ºC. Stel rotatiesnelheid 200 rpm. Zet het koelmiddel chiller-pomp en ingesteld op -10 ºC. </li><li> Een pH-meter om de pH van de KES bewaken Gebruik een pipet 1 mM DHAS langzaam toevoegen KES, totdat de pH 7,0. Roer langzaam de oplossing wordt toegevoegd. </li><li> Giet het geneutraliseerde KES in de 500 ml rondbodemkolf tot ongeveer kwart gevuld. Voer de distilleerder volgens de fabrikantprotocol voor 1,25 uur. <ol><li> Herhaal stap 3,3 tot alle KES is gedistilleerd. Zorg ervoor dat de kolf stevig is aangesloten. </li></ol></li></ol> 4. Dialyse van Keratine Extract Solution <ol><li> Giet KES oplossing even in 12 afzonderlijke 14 ml conische buizen. Centrifugeer de buizen bij 1050 xg gedurende 10 min. </li><li> Giet de gecentrifugeerd KES in een schone beker, en zorg ervoor om weg te gieten van de verzamelde puin. Herhaal dit tot alle van de KES werd gecentrifugeerd. </li><li> Vul een 2000 ml maatcilinder met DI-water. </li><li> Snijd dialyseslang cellulose membraan 24 inch, en clip een uiteinde van de buis te houden sluiten. </li><li> Dompel de lengte van de buis in de cilinder DI water om het flexibeler en gemakkelijker te openen. </li><li> Open de niet-geknipt uiteinde van de dialysebuis cellulose membraan en giet langzaam 60 ml gecentrifugeerd KES oplossing in de slang. Met andere clip bij het uiteinde van de slang te sluiten. </li><li> Zet de dialysis buis in de 2.000 ml cilinder van DI water en laat het zitten voor 24 uur. Wijzig de DI water in de cilinder om de 3 tot 4 uur. </li><li> Na de 24 uur periode leeg de KES gedialyseerde oplossing in potten afgedekt, waarbij u ruimte bovenaan plaats laat in de vriezer bij -20 ° C gedurende 24 uur. </li></ol> 5. Vriesdrogen van Keratine Extract Solution <ol><li> Stel de vriesdroger tot -86 ºC. </li><li> Verwijder de potten met bevroren KES uit de vriezer, neem de doppen off van de potten, en plaats ze in de vriesdroger ampullen. Plaats de zegels op de ampullen en draai de knop om een ​​vacuüm druk van 0,133 mbar te creëren. Lyofiliseren de monsters gedurende ongeveer 48 uur, totdat al het vocht is verdwenen. </li></ol> 6. Voorbereiding van Electrospinning Solutions (10 gew% Keratine Solution) <ol><li> Verwijder de keratine poeder uit de vriesdroger en wegen. </li><li> Voeg gedeïoniseerd water aan de Keratine poeder tot een 10% gew / gew creërenKeratine oplossing. </li></ol> 7. Bereiding van 10% gew PCL Solution <ol><li> Verkrijgen PCL (ε-caprolacton polymeer, Mn 70-90 kDa) en trifluorethanol (TFE). Bereid een 10% gew PCL in TFE door roeren O / N en een homogeen mengsel te verkrijgen. </li></ol> 8. Bereiding van Keratine / PCL Solution <ol><li> Verkrijgen de 10 gew% PCL oplossing die vooraf was bereid en 10 gew% keratine oplossing. keratine toevoegen aan de PCL oplossing druppelsgewijs om 10 ml PCL / keratine oplossingen van 90:10, 80:20, 70:30 en 60:40 ratio creëren. </li><li> Gebruik een vortexer om een ​​homogeen mengsel van PCL / Keratine oplossing te verkrijgen voordat elektrospinning. </li></ol> 9. Productie van electrospun PCL / keratinevezel <ol><li> Leg ongeveer 8 ml van de PCL / keratine oplossing in een 10 ml wegwerpspuit voorzien van een 0,5-mm kunststof buis. Plaats de spuit in een spuitpomp waarin de stroomsnelheid is ingesteld op 2,5 ml / uur. </li><li&gt; Spanning aan de punt van de naald is verbonden met de buis (~ 23 cm geplaatst van de vezel oproltrommel en ~ 30 graden met de horizontaal). Breng een 19-22 kV spanning aan de buis en draai de collector trommel rond de 200 rpm. <ol><li> Wikkel de collector trommel met aluminiumfolie voordat u het monster. Zorg ervoor dat de aluminiumfolie stabiel is door toepassing van de etikettering tape aan beide zijden. Opmerking: De vezels worden op de aluminiumfolie vormen (zie figuur 2), slaan de vezel bedekte folie bij kamertemperatuur. </li></ol></li></ol> 10. Mechanische Analyse van de PCL / Keratine Nanovezels <ol><li> Snijd het monster in 60 mm bij 8 mm. Zorg ervoor dat de dikte opnemen door het gebruik van digitale micrometer. Voor elke samenstelling bereid, gebruikt vijf monsters. </li><li> Bevestig de 60 x 8 mm monster in de treksterkte tester. Gebruik een speciaal ontworpen preparaathouder om het monster te bevestigen. Sandwich van het monster tussen preparaathouders die is gemaakt van een index-kaart met behulp van dubbel-dubbelzijdige tape. Breng de 10 N belastingscel met een verplaatsingssnelheid van 10 mm / min. Noot: De monsterhouder werd ontworpen om 62 mm bij 40 mm met een inwendige raam van 50 mm bij 38 mm. </li><li> Record uitbreiding en load waarden door middel van software op basis van software-protocol. </li><li> Bereken stress door het verdelen van het geweld door deel van het onderzochte monster. Bereken vervolgens stam door de lengteverandering van aanvankelijke lengte snijdt. </li><li> Genereren van de spanning-rek kromme door het uitzetten van stress in y-as voor overeenkomstige spanningswaarde in de x-as. </li><li> Bereken de Young&#39;s modulus van het lineaire gebied waar de helling gelijk aan elasticiteitsmodulus. Bepaal treksterkte van de stress spanning plot door het nemen van 0,2% te compenseren in stam en het tekenen van een parallelle lijn aan de lineaire regio curve. </li><li> Voer de statistische analyse van de mechanische gegevens die zijn verkregen in drievoud eerder met behulp van one-way variantie-analyse met behulp van analysesoftware 8. P-waarden &lt;0,05 weopnieuw als statistisch significant. </li></ol> 11. Surface morfologie en structurele karakterisatie <ol><li> Met scanning elektronenmicroscoop (SEM) met parameters van versnellingsspanning van 15 kV en stroom van 5 uA tot de morfologie van de vezels electrospun observeren. <ol><li> Voorafgaand aan de beeldvorming met SEM, snijd een 2 cm 2 sectie van de vezel en bevestig deze aan een SEM stadium gebruik van koper tape. Plaats het podium in de sputter coater en jas met goud op 15 mA gedurende 1 minuut en 30 seconden naar een goudlaag ongeveer 11 nm dik te maken. Laad het monster in de kamer van de SEM. Let op de vezel monsters. </li></ol></li><li> Gebruik Fourier transformatie infraroodspectroscopie (FTIR) om de chemische binding tussen de PCL- en keratine karakteriseren. Plaats de 2 cm 2 sectie van het electrospun nanovezel membraan in een magnetische houder en het zuiveren van het systeem met droge lucht voor het testen. Verkrijgen spectra 200 scans en analyseren van de spectra met behulp standard software volgens softwareprotocol. </li><li> Uitvoeren spectrum analyse met behulp van standaard software gebruiken drievoud van elke verhouding nanovezels volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol> 12. Onderzoek Cell-vezel Interactie <ol><li> Snijd vezels tot 16 mm 2 monsters. Gebruik van een biocompatibele, siliconen gebaseerde lijm aan elk monster dekglaasjes vast met een diameter van 12 mm. </li><li> Lijm ene uiteinde van de vezel monster op de achterkant van het dekglas, wikkel het monster rond dekglaasje, lijm dan het vrije uiteinde van het monster aan de achterkant van het dekglas ook, waardoor de bovenkant van de slip bedekt met alleen de fiber monster. </li><li> Plaats de vezel monsters in een 24-wells plaat. Steriliseer de monsters door onderdompeling in 80% ethanol gedurende 1 uur. </li><li> Spoel de ethanol uit de monsters met behulp van DI-water. Vervolgens pipet 2 ml basaal medium op de monsters, en zorg ervoor dat het gehele monster te dekken. Verwijder het medium na 5 min. </li><li> Gebruik fibroblast 3T3 cellen aan de vezel monsters zaad. Suspendeer de cellen in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met antibiotica en 10% foetaal runderserum (FBS), zodat er ongeveer 62.000 cellen / cm2 per 1 ml DMEM. </li><li> Drop 1 ml van de 3T3-cellen bevattende DMEM oplossing in elke well plaat zodat elk monster vezel bedekt is met ongeveer 62.000 cellen / cm2. Incubeer de platen goed voor 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Opmerking: Gebruik 5% CO 2 omdat dit niveau meestal handhaven van de pH van het celmedium in fysiologische bereik dagen. </li></ol> 13. Afbraak van Nanovezel Matrix <ol><li> Cut gedroogde PCL / keratine nanovezel membranen in vierkante ongeveer 30 mm x 30 mm. </li><li> Steriliseer de 900 mm 2 monsters met 80% alcohol voor een 10 minuten incubatieperiode en grondig wassen met DI water. Incubeer de monsters in 15 ml PBS, pH 7,5, bij 37 ° C. Vervang de buffer om de 3 dagen. </li><li> Neem de membranen uit de oplossing op bepaalde tijdstippen, 1 week en 7 weken en spoelen met DI water. </li><li> Plaats het membraan monsters in vriesdroger ampullen. Plaats de zegels op de ampullen en draai de knop om een ​​vacuüm te creëren. Lyofiliseren gedurende 24 uur, tot het volledig droog. </li><li> Bevestig de gedroogde monster naar een SEM stadium gebruik van koper tape. Plaats het podium in de sputter coater en jas met goud op 15 mA gedurende 1 min en 30 sec. </li><li> Laad het monster in de kamer van de SEM. Let op de vezel monsters bij een versnellend voltage van 1,5 kV en 5 uA stroom. </li></ol>

<ol><li>Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+polymer+nanofibers+by+electrospinning+and+their+applications+in+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Compos+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.</a> Compos Sci Technol. 63, (2003).</li>
<li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+structure%3A+a+novel+scaffold+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res. 60, 613-621 (2002).</li>
<li>Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibers+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibers for regenerative medicine.</a> Adv Healthc Mater. 1, 10-25 (2012).</li>
<li>Edwards, A., Jarvis, D., Hopkins, T., Pixley, S., Bhattarai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28-caprolactone%29%2Fkeratin-based+composite+nanofibers+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B%22%5BJournal%5D)">Poly(-caprolactone)/keratin-based composite nanofibers for biomedical applications.</a> J Biomed Mater Res B. 103, 21-30 (2015).</li>
<li>Dowling, L. M., Crewther, W. G., Parry, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+structure+of+component+8c-1+of+alpha-keratin.+An+analysis+of+the+amino+acid+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Secondary structure of component 8c-1 of alpha-keratin. An analysis of the amino acid sequence.</a> Biochem J. 236, 705-712 (1986).</li>
<li>Yamauchi, K., Maniwa, M., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+fibroblast+cells+on+keratin-coated+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomat+Sci-Polymer%22%5BJournal%5D)">Cultivation of fibroblast cells on keratin-coated substrata.</a> J Biomat Sci-Polymer. 9, 259-270 (1998).</li>
<li>Shea, L. D., Wang, D., Franceschi, R. T., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Bone+Development+from+a+Pre-Osteoblast+Cell+Line+on+Three-Dimensional+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+E%22%5BJournal%5D)">Engineered Bone Development from a Pre-Osteoblast Cell Line on Three-Dimensional Scaffolds.</a> Tissue E. 6, 605-617 (2000).</li>
<li>Fortin, M. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Biological+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biol%22%5BJournal%5D)">New Biological Software.</a> Q Rev Biol. 71, 169-170 (1996).</li>
<li>Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+chitosan-based+nanofibers+and+their+cellular+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility.</a> Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).</li>
<li>Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.+Part+I.+Traditional+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+E%22%5BJournal%5D)">The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors.</a> Tissue E. 7, 679-689 (2001).</li>
<li>Bhattarai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural-Synthetic+Polyblend+Nanofibers+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Natural-Synthetic Polyblend Nanofibers for Biomedical Applications.</a> Adv Mater. 21, 2792-2797 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Extractie van keratine van mensenhaar werd met succes bereikt. De perazijnzuur fungeerde als oxidatiemiddel op het menselijk haar, waardoor de keratine te extraheren door de Tris Base. De productie van keratine poeder werd kleinschalig door het feit dat het alleen gedaan voor onderzoeksdoeleinden. Deze procedure is reeds vastgesteld in de industrie voor grootschalige productie. Te onttrekken kleinschalige keratine was verontreiniging, batch variabiliteit en kosteneffectiviteit regelen. Kerat...

Electrospinning wordt erkend als een gangbare methode voor het bereiken polymeer nanovezels. De vezels kunnen worden geproduceerd op nanoschaal en de vezel eigenschappen kunnen worden aangepast 1. Deze ontwikkelingen en de kenmerken van electrospun nanovezels zijn vooral interessant voor hun toepassingen in biomedische engineering geweest vooral in tissue engineering. De electrospun nanovezels bezitten overeenkomsten met de extracellulaire matrix en aldus bevorderen celhechting, migratie en proliferatie 2. Vanwege de gelijkenis van de extracellulaire matrix (ECM), kunnen electrospun vezels worden gebruikt als materialen om te helpen bij wondverbanden, geneesmiddelafgifte en voor engineering weefsels zoals lever, bot, hart, spier en 3. Een grote verscheidenheid aan polymeren van synthetische en natuurlijke oorsprong zijn gebruikt om electrospun vezels voor verschillende biomedische toepassingen 4 maken. Onlangs er is gegroeid inlangstelling in de ontwikkeling van composiet nanovezels door het mengen van synthetische en natuurlijke polymeren 4. In deze preparaten met name de eindproducten erven de mechanische sterkte in verband met het synthetisch polymeer, terwijl ook de vaststelling van biologische signalen en de eigenschappen van de natuurlijke polymeer. In dit experiment, PCL en keratine worden als synthetische en natuurlijke polymeren worden toegepast voor de synthese van een samengestelde nanovezel. Keratine is een natuurlijk polymeer dat wordt gevonden in het haar, wol en nagels. Het bevat vele aminozuurresten; opmerkelijke belangstelling is cysteïne 4,5. Idealiter een natuurlijk voorkomend polymeer zou biorenewable, biocompatibel en biologisch afbreekbaar zijn. Keratine bezit deze drie kenmerken tegelijkertijd verbeteren van celproliferatie en celhechting aan de biomaterialen het is in 6 opgenomen. Polycaprolacton (PCL) is een resorbeerbaar synthetisch polymeer dat significanttissue engineering 4. Dit polymeer is eerder geprezen voor de structurele en mechanische stabiliteit, maar het mist cel affiniteit en vertoont een lang afbraaksnelheid. De hydrofobe aard van PCL is waarschijnlijk verantwoordelijk voor het gebrek aan affiniteit 7 cel. Echter, PCL maakt voor de beperkingen door zich zeer mengbaar met andere polymeren. Een PCL / keratine composiet moet de mechanische eigenschappen van PCL te tonen en op te nemen van de biologische eigenschappen van keratine, waardoor het een ideale keuze voor verschillende biomedische toepassingen.

<table><tbody><tr><td>Human Hair&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Verkregen bij lokale kapper in Greensboro</td></tr><tr><td>Peracetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCL (e-caprolactone polymeer)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>502-44-3</td><td>Mn 70-90 kDa</td></tr><tr><td>Trifluoroethanol (TFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75-89-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (TrizmaTM Base Powder)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>>99,9% kristallijn</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212 Lot 093601</td><td>Waltham, MA</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Sarasota, FL</td></tr><tr><td>Cellulose membrane</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>12 - 14 kDa moleculaire afsnijding</td></tr><tr><td>optische microscoop</td><td>Olympus BX51M</td><td>BX51M</td><td>Japan</td></tr><tr><td>scanning elektronenmicroscoop</td><td>Hitachi SU8000</td><td>SU8000</td><td>Japan</td></tr><tr><td>Table-Top Shimadzu-machine</td><td>North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X-serie</td><td>AGS-X-serie&nbsp;</td><td>Columbia, MD</td></tr><tr><td>Fourier-transformatie infraroodspectroscopie</td><td>Bruker Tensor 2-instrument&nbsp;</td><td></td><td>Billerica, MA</td></tr><tr><td>Microcal Origin-software</td><td></td><td></td><td>Northampton, MA</td></tr><tr><td>Röntgendiffractie (XRD)</td><td>Bruker AXS D8 Advance röntgendiffractometer</td><td></td><td>Madison, WI</td></tr><tr><td>Fibroblast 3T3&nbsp; cel</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td></td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Spectra max Gemini XPS microplaatlezer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Student- Newman-Keuls post hoc-test</td><td>SigmaPlot 12-software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synthese van keratine-gebaseerde nanovezel voor biomedische technologie

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, vanwege zijn veelzijdigheid en mogelijke toepassingen op diverse gebieden, wordt vaak gebruikt om nanovezels te fabriceren. De productie van deze poreuze nanovezels is van groot belang vanwege hun unieke fysisch-chemische eigenschappen. Hier werken wij de fabricage van keratine bevattende poly (ε-caprolacton) (PCL) nanovezels (dwz PCL / keratine composietvezel). Water oplosbare keratine werd eerst geëxtraheerd uit menselijk haar en gemengd met PCL in verschillende verhoudingen. De gemengde oplossing van PCL / keratine werd getransformeerd in nanofibrous membranen met behulp van een laboratorium ontworpen elektrospinproces opgezet. Vezelmorfologie en mechanische eigenschappen van de verkregen nanovezel waargenomen en gemeten met behulp van scanning elektronenmicroscopie en trekbank. Verder afbreekbaarheid en chemische eigenschappen van de nanovezel bestudeerd met FTIR. SEM beelden vertoonden uniform oppervlak morfologie PCL / keratinevezels van verschillende samenstellingen. De PCL / keratin vezels toonden ook uitstekende mechanische eigenschappen zoals modulus en faalpunt. Fibroblast cellen in staat waren om te bevestigen en te laten groeien en het blijkt een goede levensvatbaarheid van de cellen. Op basis van de kenmerken hierboven besproken, kunnen we stellen dat de sterk gemengde nanovezels van natuurlijke en synthetische polymeren een uitstekende ontwikkeling van composietmaterialen die kunnen gebruikt worden voor verschillende biomedische toepassingen kan vertegenwoordigen.

vezel morfologie SEM beelden van de vezels werden verkregen voor de vezelsamenstelling. Zie figuur 3. Image Fiber bevestigt dat de vezels willekeurig zijn georiënteerd. mechanische testen Mechanisch sterke vezels zijn meestal nodig voor verscheidene toepassingen weefselmanipulatie. Deze vezels moeten voldoende sterkte en flexibiliteit onder bepaalde stre...

Electrospun nanovezels hebben een hoge oppervlak tot gewichtsverhouding, uitstekende mechanische integriteit gewicht en ondersteunen celgroei en proliferatie. Deze nanovezels hebben een breed scala van biomedische toepassingen. Hier fabriceren we keratine / PCL nanovezels, met behulp van de electrospinning techniek en karakteriseren van de vezels voor mogelijke toepassingen in de tissue engineering.

Synthese van Keratine-gebaseerde Nanovezel voor Biomedische Technologie

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Het algemene doel van dit experiment is het synthetiseren en karakteriseren van keratinenanovezels voor biomedische toepassingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de biomedische techniek, zoals wondgenezing, geneesmiddelentoediening en weefselengineering van bijvoorbeeld lever, bot en spieren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze goedkoop en efficiënt is en kan worden opgeschaald naar grootschalige productie.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de behandeling van wonden en de toediening van geneesmiddelen voor weefselregeneratie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de voordelen van het gebruik van elektrogesponnen nanovezels, kan zij ook worden toegepast op andere systemen, zoals weefselregeneratie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het lastig is om een polymeersubstantie te maken die nanovezels kan genereren.Verkrijg ongeveer 20 gram menselijke haarknippels die niet chemisch zijn behandeld of gewijzigd. Het haar mag elke lengte hebben. Was het haar grondig met de hand met warm water en zeep.Gebruik gedeïoniseerd water voor de laatste spoeling. Doe het haar in twee bekerglazen van 600 milliliter en plaats deze gedurende één uur in een oven van 80 °C. Verdeel het droge haar, zodra het droog is, gelijkmatig over de bekerglazen van 600 milliliter, waarbij 10 gram haar in elk bekerglas wordt geplaatst.Zorg ervoor dat het haar niet meer dan 500 milliliters inneemt. Giet vervolgens 500 milliliters perazijnzuuroplossing, of PAS, in elk bekerglas, waarbij u erop let dat al het haar bedekt is. Dek de bekerglazen af met Parafilm en bewaar deze gedurende 12 hours.Scheid het haar van de PAS met behulp van een zeef van 500 micron en verzamel de afval-PAS in een aparte houder. Spoel het haar grondig met gedeïoniseerd water om alle resterende PAS te verwijderen. Plaats het gespoelde haar in een kolf van 500 milliliter en giet 400 milliliter 100 millimolair Tris-bufferoplossing, of TBS, in de kolf, waarbij u erop let dat het haar volledig bedekt is.Plaats de kolf vervolgens in een schudbad ingesteld op 38 °C, 65 RPM, gedurende één uur. Verwijder de kolf na één uur uit het schudbad. Giet de vloeistof, bestaande uit ongeveer 400 milliliter keratine-extractie-oplossing, of KES, in een bekerglas van 1000 milliliter.Giet 400 milliliter gedeïoniseerd water in de kolf met het haar, waarbij u ervoor zorgt dat het haar bedekt is, voordat u de kolf terugplaatst in het schudbad voor één uur. Haal de kolf uit het schudbad en giet de resterende 400 milliliter KES in het bekerglas van 1000 milliliter met de eerder verzamelde KES. Het haar is niet langer nodig en kan worden weggegooid in de dichtstbijzijnde afvalbak.Nadat de verzamelde KES is geneutraliseerd zoals beschreven in het tekstprotocol, giet u de oplossing in de ronde kolf van 500 milliliter tot deze ongeveer een kwart vol is. Laat de destilleerder 1,25 uur draaien volgens het protocol van de fabrikant, waarbij u ervoor zorgt dat de kolf stevig is aangesloten. Herhaal dit proces totdat alle KES is gedestilleerd.Giet de gedestilleerde KES-oplossing gelijkmatig over 12 afzonderlijke conische buizen van 14 milliliter. Centrifugeer de buizen bij 1,050 ×g gedurende 10 minuten. Giet de gecentrifugeerde KES in een schoon bekerglas, waarbij u er op let dat u niet in het verzamelde bezinksel giet.Herhaal dit proces totdat alle KES is gecentrifugeerd. Knip vervolgens een stuk cellulosemembraan van de dialyseslang van 24 inch af en klem één uiteinde van de slang dicht. Open het niet-afgeknelde uiteinde van het cellulosemembraan van de dialyseslang en giet langzaam 60 milliliters van de gecentrifugeerde KES-oplossing in de slang.Gebruik een andere klem om dit uiteinde van de slang af te sluiten. Plaats de dialysebuis in een cilinder van 2.000 milliliter gedeïoniseerd water en laat deze 24 uur staan, waarbij het gedeïoniseerde water in de cilinder elke drie tot vier uur wordt ververst. Giet vervolgens de gedialyseerde KES-oplossing in afgesloten potten en zorg ervoor dat er aan de bovenkant ruimte overblijft.Plaats de afgesloten potten gedurende 24 uur in een vriezer op -20 °C. Neem na de vriesperiode van 24 uur de doppen van de potten en plaats de inhoud in ampullen voor de vriesdroger. Plaats de afdichtingen op de ampullen en draai aan de knop om een vacuümdruk van 0,133 millibar te creëren.Lyofiliseer de monsters gedurende ongeveer 48 uur totdat al het vocht is verdwenen. Bereid een PCL-keratine-oplossing door een keratine-oplossing van 10 gewichtsprocent druppelsgewijs toe te voegen aan een PCL-oplossing van 10 gewichtsprocent, om oplossingen van 10 milliliter te maken met PCL-keratine-verhoudingen van 90:10, 80:20, 70:30 en 60:40. Breng ongeveer acht milliliter van de gevortexte PCL/keratine-oplossing over in een wegwerpspuit van 10 milliliter, voorzien van een plastic buisje met een diameter van 0,5 millimeter.Plaats de spuit in een spuitpomp waarbij de stroomsnelheid wordt ingesteld op 2,5 milliliters per uur. Breng een spanning aan op de punt van de naald die aan de slang is verbonden. Breng een spanning van 19 tot 22 kilovolt aan op de slang en roteer de opvangtrommel met ongeveer 200 RPM.Snijd de vezels in monsters van 16 vierkante millimeter. Gebruik een biocompatibele lijm op siliconenbasis om elk monster te bevestigen aan dekglasplaatjes met een diameter van 12 millimeter. Lijm één uiteinde van het vezelmonster aan de achterzijde van het dekglasplaatje en wikkel het monster om het dekglasplaatje heen.Lijm vervolgens ook het vrije uiteinde van het monster aan de achterkant van het dekglas, zodat alleen de bovenkant van het glas bedekt is met het vezelmonster. Plaats de vezelmonsters in een plaat met 24 putjes. Steriliseer de monsters door ze gedurende één uur onder te dompelen in 80% ethanol.Spoel de ethanol van de monsters af met gedeïoniseerd water. Pipetteer vervolgens 2 milliliters basaal medium op de monsters en zorg ervoor dat het gehele monster gedurende vijf minuten bedekt is. Gebruik fibroblast 3T3-cellen om de vezelmonsters te zaaien.Suspendeer de cellen in DMEM, aangevuld met antibiotica en 10% foetaal runderserum, zodanig dat er ongeveer 62.000 cellen per vierkante centimeter per één milliliter DMEM aanwezig zijn. Druppel één milliliter van de DMEM-oplossing met 3T3-cellen in elke wellplaat, waarbij wordt gewaarborgd dat elk vezelmonster is bedekt met ongeveer 62.000 cellen per vierkante centimeter. Incubeer de wellplaten gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% koolstofdioxide.Steriliseer de gedroogde PCL/keratine nanofiber-membranen van 900 vierkante millimeter na het uitknippen door deze gedurende 10 minuten te laten incuberen in 80% alcohol. Was de membranen vervolgens grondig met gedeïoniseerd water. Incubeer de monsters daarna in 15 milliliters PBS, pH 7,5, bij 37 graden Celsius, waarbij de buffer elke drie dagen wordt vervangen.Haal de membranen op de aangegeven intervallen van één week en zeven weken uit de oplossing. Spoel ze af met gedeïoniseerd water. Plaats de membraanmonsters in ampullen voor de vriesdroger.Plaats de verzegelingen op de ampullen en creëer een vacuüm om de monsters 24 uur lang te lyofiliseren tot ze volledig droog zijn. Bevestig vervolgens het gedroogde monster met koperen tape aan de houder van een scanning elektronenmicroscoop, of SEM. Plaats de houder in de sputtercoater en coat deze met goud bij 15 milliamps gedurende één minuut en 30 seconden.Laad het monster in de kamer van de SEM. Observeer de vezelmonsters bij een versnellingsspanning van 1.5 kilovolts en een stroomsterkte van vijf microamps. Hier worden representatieve afbeeldingen getoond van PCL/keratine-gebaseerde nanovezels die succesvol zijn geëlektrogesponnen uit oplossingen met PCL/keratine-verhoudingen van 70 op 30, 80 op 20 en 90 op 10.Er werd vastgesteld dat de elektrogesponnen vezels Young-moduli hadden die dicht bij die van het natuurlijke weefsel lagen. De Young-moduli namen af bij een toenemende keratineverhouding. De figuur toont een grafische trend van de variatie van de Young-modulus ten opzichte van de PCL/keratine-verhouding.De hier weergegeven spectra van Fourier-transform infraroodspectroscopie bevestigen de binding van PCL aan keratine. De belangrijkste piek, gemeten bij 1.722 inverse centimeters, komt overeen met de standaard basismetingen van de PCL-absorptieband en is in alle spectra zichtbaar. Celadhesie en proliferatie op de PCL-keratinevezels bevestigen dat de vezels niet toxisch zijn en ondersteuning bieden voor celgroei.De groei van filopodia langs de nanovezels duidt op een gunstige interactie tussen de fibroblasten en de PCL/keratine-vezels. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze synthese van nanovezels in 24 uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van de electrospinning-procedure is het belangrijk om rekening te houden met de viscositeit van de polymeeroplossing, de stroomsnelheid van de oplossing, de aangelegde spanning, de snelheid van de roterende trommel en de stappen voor de kweek van fibroblastcellen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u PCL/keratine-gebaseerde nanovezels synthetiseert en van het belang hiervan in het veld van de biomedische technologie. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, zoals celviabiliteit en in vivo degradatietests, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de toxiciteitsrespons van weefsel, weefselgroei en de degradatie van de vezels. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de regeneratieve technologie om gebieden te verkennen zoals huidregeneratie, wondgenezing en geneesmiddelentoediening.Vergeet niet dat het werken met organische oplosmiddelen, zoals TFE, en hoge voltages extreem gevaarlijk kan zijn; neem daarom altijd voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van een veiligheidsbril, een laboratoriumjas en handschoenen, en zorg voor de juiste afvoer van oplosmiddelen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

synthesis-of-keratin-based-nanofiber-for-biomedical-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een efficiënte aanpak voor het bereiden nanovezels ingericht met functionele groepen die specifiek interactie met eiwitten beschreven. De benadering vereist eerst de bereiding van een gefunctionaliseerd polymeer met geschikte functionele groep. De functionele polymeer wordt gefabriceerd in nanovezels door electrospinning. De effectiviteit van de binding van de nanovezels met een eiwitgehalte wordt onderzocht door confocale microscopie.

Procedure voor het vervaardigen van biofunctionele nanovezels

Electrospun steigers kunnen worden verwerkt post-productie voor tissue engineering toepassingen. Hier beschrijven we methoden voor het spinnen complexe steigers (door opeenvolgende spinnen), voor het maken van dikkere steigers (door meerdere lagen met behulp van warmte of damp gloeien), voor het bereiken van steriliteit (aseptische productie of sterilisatie post-productie) en zorgt voor een juiste biomechanische eigenschappen.

Postproduction Verwerking van electrospun Vezels voor Tissue Engineering

Werkwijze voor nanovezels en complexe nanostructuren verkrijgen uit een of meerdere extracellulaire matrixeiwitten beschreven. Deze methode maakt gebruik van proteïne-oppervlak interacties vrijstaande eiwit gebaseerde materialen maken met instelbare samenstelling en architectuur voor gebruik in een verscheidenheid van tissue engineering en biotechnologische toepassingen.

ECM Eiwit nanovezels en nanostructuren Engineered behulp-Surface geïnitieerde Vergadering

Synthese en de fabricage van electrospun lange vezels verspreid over een grotere storting gebied via een nieuw ontworpen verzamelaar uit een roman biologisch afbreekbaar polymeer genoemd poly (glycerol-dodecanoaat) (PGD) werd gemeld. De vezels waren in staat de groei van cellen afkomstig van muizen pluripotente stamcellen ondersteunen.

Electrospun Stapel Stellingen van Poly (glycerol-dodecanedioate) voor Engineering zenuwweefsel Van muis embryonale stamcellen

Hier presenteren we een protocol om elektrogesponnen nanovezel steigers met gradated organisatie van vezels fabriceren en hun toepassingen verkennen in het reguleren van de cel morfologie / oriëntatie. Verlopen met betrekking tot fysische en chemische eigenschappen van de nanovezel scaffolds biedt een grote verscheidenheid aan toepassingen op biomedisch gebied.

Electrospun Nanovezel Steigers met gradaties in Fiber Organisatie

Twee- en driedimensionale superhydrofobe polymere materialen worden bereid door middel van elektrospinnen of elektrosprayen van biologisch afbreekbare polymeren vermengd met een polymeer met een lagere oppervlakte-energie van vergelijkbare samenstelling.

Fabriceren superhydrophobic polymere materialen voor biomedische toepassingen

Dit manuscript wordt de procedure beschreven om te fabriceren en karakteriseren van Griffithsin gemodificeerde poly (melkzuur-co-glycolic zuur) electrospun vezels waaruit krachtige lijm en antivirale activiteit tegen humaan immunodeficiëntie virus type 1 infectie in vitro. Methoden die worden gebruikt voor het synthetiseren, oppervlakte-wijzigen, en de resulterende morfologie, conjugatie, karakteriseren en desorptie van Griffithsin van oppervlak gemodificeerde vezels worden beschreven.

Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties

Het doel van dit protocol is om de assemblage van een biomimetische nanomatrix (NM) met Janus basis nanobuisjes (JBNT's) en fibronectine (FN) te tonen. Wanneer ze worden gekweekt met menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs), vertonen de NMs uitstekende bioactiviteit bij het aanmoedigen van hMSCs-adhesie.

Vervaardiging van een biomimetische nanomatrix met Janus Base Nanotubes en Fibronectin voor stamcelhechting

Weefselkweekinserts met plastic membranen zijn de gouden standaard in celkweeklaboratoria als permeabele dragers om cellagen en modellen van barrièreweefsels te vestigen. Hierin presenteren we een eenvoudige methode om het plastic membraan te vervangen door een biologisch relevanter membraan gemaakt van een recombinant gefunctionaliseerd spinnenzijde-eiwit.

Nanofibrillaire basale membraan nabootsen gemaakt van recombinant gefunctionaliseerd spinnenzijde in op maat gemaakte weefselkweekinzetstukken

Het volgende protocol presenteert een op afschuiving gebaseerde extrusiemethode voor de fabricage van collageenhydrogels met fibrillen met nanoschaalpatronen, die kan worden toegepast op een breed scala aan weefselengineeringtoepassingen.

Productie van collageen met nanofibrillaire patronen voor weefselmanipulatie

Leer de elektrospinningtechniek voor de synthese van keratine-gebaseerde nanovezels met toepassingen in weefselengineering en wondgenezing. Deze methode ondersteunt celgroei en is schaalbaar voor biomedisch onderzoek.

Synthese van Keratine-gebaseerde Nanovezel voor Biomedische Technologie

Meer video's verkennen