Name: Meten van fysiologische reacties Drosophila Sensorische neuronen te Lipid Feromonen met Live Calcium Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Leer calcium imaging van Drosophila smaakneuronen bij lipide feromonen. Deze methode maakt real-time meting van neuronale activiteit in levende vliegen mogelijk voor sensorische neurobiologie onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Singapore National Research Foundation (subsidie NRF-RF2010-06 aan J.Y.Y.).

1. Monstervoorbereiding <ol><li> Steek de Gal4 3,22 bestuurder lijn naar UAS-GCaMP5G 19 vliegt (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Laat het kruis te groeien bij 25 ° C. Let op: Het genereren vliegt met meerdere kopieën van de Gal4 of UAS-GCaMP transgenen kan helpen om de fluorescentie intensiteit van het signaal te verbeteren. Een eerdere versie van de UAS-GCaMP transgen (UAS-GCaMP3) toonde zeer zwakke fluorescentie-intensiteit bij expressie onder de controle van de Gr68a-Gal4 driver. <ol><li> Verzamelen en apart geslacht nieuw Bijlage In volwassen vliegen en te verhogen bij 25 ° C. Let op: het basisniveau van GCaMP5G bloei is optimaal in vliegen tussen 14-28 dagen oud. Isoleren vliegen naar geslacht zich verzet tegen de mogelijkheid van sociale interacties die de neurale reacties kunnen beïnvloeden. </li></ol></li><li> Verdoven een vlieg onder een milde stroom van CO 2. </li><li> Bevestig de fly om een ​​glas dekglaasje door eerst het plaatsen van een kleine daling van nagellak in het centrum van een 0,17 mm dekglaasje. Plaats voorzichtig een vlieg op zijn kant op de daling van duidelijke nagellak en ervoor te zorgen dat de gehele daling wordt gedekt door de vlieg. </li><li> Voer stap 1.5 en 1.6 onder een dissectie stereomicroscoop, gebruikt 8x vergroting. </li><li> Gebruik een natte penseel om een ​​voorpoot van de vlieg uit te breiden. Zet de voorpoot op zijn plaats door het plaatsen van twee dunne reepjes van tape over de eerste en de vijfde tarsal segmenten (Figuur 2A). Dit tarsale segmenten bloot T2-T4 imaging (figuur 2B). </li><li> Om het beeld neuronen op de snuit, plaats een dunne strook van tape over de rostrum van de slurf naar de labellum (figuur 2C, D) bloot te leggen. </li><li> Teken een hydrofobe barrière rond de vlieg met een PAP pen om te voorkomen dat oplossing uit stroomt over het dekglaasje oppervlak. Maak metingen binnen 30 minuten van de montage. </li></ol> 2. Voorbereiding van de StimulusOplossing <ol><li> Verdun lipofiele liganden (zoals CH503, in deze studie) in PBST oplossing: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4, 0,1% Triton X-100 (v / v ); pH 7,4. <ol><li> Maak een 1 mg / ml voorraadoplossing van de ligand via PBST. Bereid alle daaropvolgende verdunningen van de voorraad oplossing met behulp van PBST. Opmerking: Afhankelijk van de oplosbaarheid van het ligand van belang kan verschillende oplosmiddelen nodig zijn om de ligand te lossen. De oplosbaarheid van CH503 in verschillende oplosmiddelen wordt beschreven in tabel 1. In tegenstelling tot andere oplosmiddelen leverde PBST niet tot een toename in fluorescentie. </li></ol></li></ol> 3. Stimuleren van Smaak neuronen en Image Acquisition <ol><li> Met behulp van een 10 ul pipet wordt 10 pl PBST op de tarsale segmenten. Opmerking: Deze stap bevochtigt het been en voorkomt dat de tarsal segmenten afglijden. </li><li> Gebruik een optisch systeem dat een camera van su heeftfficient snelheid en gevoeligheid voor goede fluorescentie-signaal op de hoogste tijd resolutie te bereiken. Opmerking: Voor deze studie gebruikten we een draaiende schijf confocale microscoop en een sCMOS camera (zie Materials List). </li><li> Kies de specifieke tarsal segment en neuronen af ​​te beelden. Acquire drie pre-stimulatie confocale Z-stacks. <ol><li> In het ideale geval gebruik overname instellingen die zijn snel genoeg om maximale tijdsresolutie mogelijk maken, terwijl nog steeds de gehele cel volume vastleggen. Voorbeeld overname instellingen zijn: 200 msec blootstelling, binning 2 x 2 en 6 x 0,5 micrometer 2 optische secties, gevangen om de 2 sec. Opmerking: Geïmmobiliseerde poten succes afgebeeld tot 10 minuten, bij 30 sec intervallen, zonder waarneembare bleking van de GCaMP signaal. Voor een langere opnameduur, ervoor te zorgen dat de poten zeer stevig worden gehouden in plaats op het dekglaasje. </li><li> Optimaliseren laservermogen voor de hoogste signaal-ruisverhouding worden bereikt met minimale fotobleken tijdens de gehele IMAGing regime. Voor de hier beschreven experimenten, gebruik maken van een 491 nm diodelaser (100 mW) bij 30% transmissie voor beeldvorming zowel Gr68a en ppk23 smaak neuronen op de benen en de slurf. Gebruik 2 x 2 binning om voor kortere belichtingstijden, terwijl nog steeds het bereiken van voldoende ruimtelijke resolutie. Opmerking: Het laservermogen instellingen zijn geoptimaliseerd voor de detectie van fluorescerende verandering, variërend van een 1,2- tot 4,5-voudige toename mogelijk. </li></ol></li><li> Pipetteer 10 ul van de oplossing op de stimulus tarsale segmenten. Voor controle-experimenten, voeg nog eens 10 pl PBST. Onmiddellijk verwerven 117 post-stimulatie beelden. Opmerking: Het aantal post-stimulatie beelden die is gebaseerd op de hoeveelheid tijd waarin de maximale verandering in fluorescentie was bereikt (ongeveer 2 minuten). <ol><li> Kritische stap: Terwijl pipetteren oplossing over de voorbereiding, niet om de vliegen te raken met de pipet tip, omdat dit zal leiden tot de voorpoot om uit positie te verplaatsen. Let op: U kunt ook gebruik maken vaneen micromanipulator het nauwkeurig positioneren van een glazen capillair met stimulus dichtbij de tarsale segment af te beelden. Lever gecontroleerde hoeveelheden stimulus via een intracellulaire micro-injectie dispenser volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol></li></ol> 4. Beeldverwerking en Analyse: Kwantificering van de Response <ol><li> Open een reeks van confocale Z-stacks met behulp van Fiji ( <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 of ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) image 24 analyse en verwerking software. </li><li> Wordt sum intensiteit projectie van alle zes segmenten Z voor elk van de 120 tijdstippen. <ol><li> Selecteer de &quot;Stack&quot; optie onder &quot;Beeld&quot;. Verder selecteert u de optie &#39;Z projectie &quot;en voer&quot; 1 &quot;als het begin slice en&quot; 4 &quot;als stop slice. Voor projectie type selecteert R20; som plakken &quot;uit het pull-down menu en kies&quot; All time frames &quot;. </li></ol></li><li> de regio van belang (ROI) te bepalen met behulp van de vrije hand selectie gereedschap om een ​​grens rond een cel lichaam of neuronale projectie tekenen. Klik op de &quot;Analyze&quot; label en selecteer de &quot;ROI manager&quot; optie onder &quot;Tools&quot;. </li><li> Kwantificeren van de fluorescentie van de ROI door het selecteren van de optie &#39;Set metingen &quot;, onder het menu&#39; Analyseren &#39;en het controleren van de dozen voor geïntegreerde dichtheid, gebied, gemiddelde en maximale grijswaarde en label. Selecteer vervolgens de &quot;More&quot; optie onder het ROI manager menu, en verder de optie &quot;Multi maatregel&quot;. Opmerking: Dit zal een popup doos met waarden voor elk van de geselecteerde parameters te genereren. </li><li> Controleer de maximale grijswaarde te zorgen dat geen van de beeldpunten verzadiging bereikt (bijvoorbeeld 65.535 voor een 16-bits camera). LET OP: Voor de experimenten getoond in tzijn, de antwoorden werden gemeten hetzij van neuronale cellichamen en uitsteeksels, afhankelijk van waar de maximale toename van AF / F waargenomen. </li><li> Bereken de maximale relatieve verandering in fluorescentie (AF / F) op tijdstip t is: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> Aftrekken achtergrond fluorescentie van elk F (cel) waarde. Achtergrondfluorescentie te kwantificeren, meten de integrale densiteit van een ROI van gelijkwaardige grootte en vorm van een gebied van de voorpoot (of zuigorganen) zonder detecteerbare neuronen. </li><li> Te kwantificeren de post-stimulatie fluorescentie, F (cel) t, het meten van de geïntegreerde dichtheid van de ROI van de cel lichaam of het proces op tijdstip &quot;t&quot; na stimulatie. </li><li> De pre-stimulatie fluorescentie te kwantificeren, F (cel) t = 0, analyseren pre-stimulus beelden van het cellichaam of werkwijze op dezelfde manier alshet post-stimulatie signaal. Gebruik de gemiddelde geïntegreerde dichtheid van 3 beelden naar F (cel) t = 0 te bepalen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+taste+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Candidate taste receptors in Drosophila.</a> Science. 287, 1830-1834 (2000).</li>
<li>Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+candidate+taste+receptors+in+the+Drosophila+gustatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system.</a> Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).</li>
<li>Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+chemoreceptors+mediate+male-male+repulsion+and+male-female+attraction+during+Drosophila+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship.</a> Cell. 149, 1140-1151 (2012).</li>
<li>Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+female+aphrodisiac+pheromone+activates+ppk23%28%2B%29+sensory+neurons+to+elicit+male+courtship+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior.</a> Cell Rep. 1, 599-607 (2012).</li>
<li>Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+pheromone-sensing+neurons+expressing+the+ppk25+ion+channel+subunit+stimulate+male+courtship+and+female+receptivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity.</a> PLoS Genet. 10, 1004238(2014).</li>
<li>Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppk23-Dependent+chemosensory+functions+contribute+to+courtship+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genet. 8, e1002587(2012).</li>
<li>Koh, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+IR20a+Clade+of+Ionotropic+Receptors+Are+Candidate+Taste+and+Pheromone+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors.</a> Neuron. 83, 850-865 (2014).</li>
<li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taste+of+the+Drosophila+gustatory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">A taste of the Drosophila gustatory receptors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).</li>
<li>Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+organs+of+Drosophila+melanogaster%3A+fine+structure+and+expression+of+the+putative+odorant-binding+protein+PBPRP2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2.</a> Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).</li>
<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).</li>
<li>Rodrigues, V., Siddiqi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gustatory+mutant+of+Drosophila+defective+in+pyranose+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors.</a> Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).</li>
<li>Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+antagonistic+gustatory+receptor+neurons+responding+to+sweet-salty+and+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).</li>
<li>Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+taste+coding+in+the+legs+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila.</a> J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).</li>
<li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J. Vis. Exp. , e51355(2014).</li>
<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+individual+firing+frequencies+of+two+neurons+recorded+with+a+single+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode.</a> Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).</li>
<li>Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+neural+circuits+with+activity-dependent+nuclear+import+of+a+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor.</a> J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+the+GCaMP+calcium+sensor+reveal+the+mechanism+of+fluorescence+signal+change+and+aid+rational+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design.</a> J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).</li>
<li>Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Drosophila+glucose+receptor+using+Ca2%2B+imaging+of+single+chemosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons.</a> PloS One. 8, e56304(2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Shikichi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+synthesis.+Part+250%3A+Determination+of+the+stereostructure+of+CH503+a+sex+pheromone+of+male+Drosophila+melanogaster%2C+as+%283R%2C11Z%2C19Z%29-3-acetoxy-11%2C19-octacosadien-1-ol+by+synthesis+and+chromatographic+analysis+of+its+eight+isomers%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers.</a> Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).</li>
<li>Yew, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+male+sex+pheromone+and+novel+cuticular+cues+for+chemical+communication+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).</li>
<li>Bray, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+Drosophila+pheromone+receptor+expressed+in+male-specific+taste+neurons+is+required+for+efficient+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship.</a> Neuron. 39, 1019-1029 (2003).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+processes+in+insect+olfactory+receptors.+Mechanisms+and+behavioral+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).</li>
<li>Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+function+of+neural+oscillations+in+early+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems.</a> Front Neurosci. 4, 53(2010).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li>
<li>Busch, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+signaling+from+O%282%29+sensors+sets+neural+circuit+activity+and+behavioral+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state.</a> Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen zijn.

We beschrijven hier een werkwijze live calcium beeldvorming van Drosophila perifere neuronen uitvoeren 2 verschillende zintuigen. De Ca 2+ -evoked GCaMP fluorescerende reacties in Gr68a-neuronen geïnduceerd door het feromoon ligand CH503 waren dosis-afhankelijk en kwantitatief. Het was ook mogelijk om verschillende neurale respons patronen zoals fasische en tonische reacties onderscheiden. Neuronen toont fasische respons wordt aangenomen dat een snelle aanpassing laten co...

Dieren vertrouwen op geur en smaak informatie om beslissingen essentieel voor de overleving en voortplanting bemiddelen. Begrijpen hoe chemosensory signalen worden gedetecteerd en verwerkt door het zenuwstelsel vereist identificatie van de sensorische receptor (en) en de overeenkomstige chemische liganden. Drosophila detecteren van een groot aantal vluchtige en niet-vluchtige verbindingen en zijn een uitstekend model waarin de fysiologische bestuderen mechanismen die ten grondslag liggen aan chemosensation. Terwijl de reukorganen waarnemen vluchtige moleculen, worden de smaak organen gespecialiseerd in het lage volatiliteit verbindingen te detecteren. Hier presenteren we een methode om neuronale antwoorden van de smaak organen van Drosophila melanogaster met lage vluchtigheid, lipofiele liganden direct te meten. Smaak organen van de vlieg onder de voorpoten, slurf, en vleugels. Verspreid over het oppervlak van de smaak organen hair-achtige structuren bekend als sensilla die reageren op sugars, bitters, zouten, water en feromonen 8. De sensilla zijn morfologisch ingedeeld in smaak haren en smaak haringen 9. Er zijn ongeveer 31 smaak haren op de lip die zijn ingedeeld in de lange (l-type), korte (s-type) en tussenproduct (i-type) morfologie. De &#39;l&#39; en &#39;s&#39; sensilla huis 4 sensorische neuronen die fysiologisch reageren op suiker (de S cel), zoutarm (de L1 cel), hoge zout en bitter verbindingen (de L2 cel) en water (de W-cel) 10 , 11. De &#39;i&#39; sensilla huis 2 sensorische neuronen, waarvan er één reageert zowel laag zout en suiker, terwijl de andere reageert op een hoog zoutgehalte 12. Er zijn ongeveer 41 smaak sensilla bij mannen en 26 vrouwen in sensilla verdeeld zijn over de van de voorpoten. Voor zowel mannen als vrouwen, zijn er 21 sensilla de midleg, en ongeveer 22 sensilla het achterbeen 13. De smaak neuronen ingesloten door de smaak sensilla op de poten zijn ook classified in L1, L2, W en S vormen. Een standaardwerkwijze voor het meten van elektrische activiteit van enkelvoudige neuronen gebruikt extracellulaire of intracellulaire elektroden ionenstroom nemen. Elektrode metingen laten neuronale functie in niet-model organismen te bestuderen zoals Drosophila species, motten, en de bijen die een uitgebreide genetische instrumenten voor neurale etikettering ontbreken. Echter, terwijl de elektrofysiologische methoden routinematig gebruikt om de activiteit meet van Drosophila smaak sensilla 4,13,14, de toepassing van deze aanpak biedt een aantal technische uitdagingen. Ten eerste, de smaak haren moeten worden geïdentificeerd op basis van de morfologie en de ruimtelijke locatie. Na identificatie, kan elektrofysiologische metingen worden belemmerd door de kleine omvang van de sensilla beperkt toegankelijk door het positie en moeilijkheden bij de toepassing van gecontroleerde hoeveelheden van een chemische stimulus om een ​​smaak haren. Ook kunnen stimuleren sensilla signalen van meerdere genererenneuronale soort 15. Ten tweede kan de detectie van elektrische signalen worden verstoord door achtergrondgeluiden als gevolg van mechanische trillingen en het lawaai van elektronische apparatuur. Ten derde kan het gebruik van een scherp elektrode beschadigen vlieg preparaat, bij abnormaal 14 gebruikt. Tot slot, het samenstellen van een elektrofysiologie rig vereist gespecialiseerde elektronische componenten voor stimulus levering, signaal opname en data-analyse en kan kostbaar zijn. In D. melanogaster, de beschikbaarheid van genetisch gecodeerde instrumenten heeft de ontwikkeling van beeldvormende technieken waarmee de reacties van kleine populaties van neuronen te bestuderen. Eén dergelijke benadering is het gebruik van de CaLexA reporter 16. In deze werkwijze worden gensequenties die coderen voor de LexA-VP16 transcriptiefactor en een calcium- gevoelig eiwit NFAT samengesmolten. Calcium activatie van het proteïne fosfatase calcineurine katalyseert het de fosforylering van NFAT en, op zijn beurt, FacilitaTES de invoer in de kern. In de kern, de LexA domein bindt aan een LexAOp-DNA-bindend motief dat de expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) reporter verbindt, waardoor aanhoudende identificeren functioneel geactiveerde neuronen. De aanpak is met succes gebruikt om de reactie van specifieke olfactorische glomeruli in de antennaal kwab na blootstelling van levende vliegen een geurstof 16 meten. Onlangs, fysiologische reacties van IR52c smaak receptor neuronen werden gemeten tijdens live-vliegen met behulp van CaLexA 7. Voor deze studie was het noodzakelijk leeftijd vliegen tot 6 weken GFP transcriptie verhoogt. Terwijl immunokleuring met een anti-GFP antilichaam kan worden gebruikt om het signaal te versterken CaLexA zou deze methode fixatie van het weefsel vereisen, waardoor elke mogelijkheid van live cell imaging. De genetisch gecodeerde eiwit calciumindicator GCaMP is ook uitgebreid gebruikt om neuronale respons studie in een aantal17 species. Het eiwit GCaMP fluoresceert met een lage intensiteit voorafgaand aan neuronale stimulatie. Toepassing van een stimulus veroorzaakt een actiepotentiaal in het neuron, waardoor de influx van Ca2 +. GCaMP, gebonden aan Ca2 +, ondergaat een conformationele verandering waardoor het fluoresceren met heldere intensiteit (Figuur 1). Een recent ontwikkelde één neuron calcium imaging aanpak werd toegepast om glucose identificeren als de ligand voor de voorpoot specifieke Gr61a smaak neuronen 18. In deze studie werden ontleed voorbenen uit transgene Drosophila expressie GCaMP in Gr61a smaak neuronen bedekt met een laag agarose vóór beeldvorming. Echter, kan het gebruik van ontleed weefsel uiteindelijke overzicht van GCaMP uitdrukking veroorzaken, waardoor het beperken van meettijd en detectie gevoeligheid. Bovendien kan agarose gevoeligheid tengevolge van de hoge achtergrondniveaus van fluorescentie en lichtverstrooiing eigenschappen. To richten sommige van deze nadelen beschrijven we het gebruik van GCaMP gemedieerde calcium imaging fysiologische reacties van voorpoot en slurf smaak neuronen van intacte dieren nemen. We tonen de fysiologische reacties van Gr68a en ppk23 neuronen tot expressie genetisch gecodeerde GCaMP5G 19 een Drosophila lipide feromoon, (3R, 11 Z 19 Z) -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Neuronale responsen worden gemeten door het kwantificeren van de toename in fluorescentie van het signaal gedurende GCaMP5G feromoon stimulatie. In dit protocol wordt neuronen afgebeeld voor een totale duur van 120 seconden, wat voldoende is om patronen van neuronale activatie in individuele cellen differentiëren.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from H. Amrein (Texas A&amp;M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&nbsp; Stock Center</td></tr><tr><td>0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish, "Hard as Nails Clear"&nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush</td><td></td><td></td><td>fine-tipped brush</td></tr><tr><td>Tape&nbsp;</td><td>Scotch brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, lab grade</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC grade</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>Recept beschreven in de protocol sectie</td></tr><tr><td>CH503</td><td></td><td></td><td>Synthese beschreven in Mori et al., 2010</td></tr><tr><td>sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Scan head&nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>open source</td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td></tr></tbody></table>

meten van fysiologische reacties<em&gt; drosophila</em&gt; sensorische neuronen te lipid feromonen met live calcium imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

In tegenstelling tot zoogdieren, insecten zoals Drosophila hebben meerdere smaak organen. De chemosensory neuronen op de benen, slurf, vleugels en ovipositor van Drosophila uiten smaak receptoren 1,2, ionkanalen 3-6 en ionotrope receptoren 7 die betrokken zijn bij het ​​opsporen van vluchtige en niet-vluchtige zintuiglijke signalen. Deze neuronen direct contact tastants zoals voedsel, schadelijke stoffen en feromonen en daardoor ook op vele complexe gedrag, zoals voeding, eieren leggen en paring. Elektrode opnames en calcium imaging zijn op grote schaal gebruikt bij insecten aan de neuronale reacties opgeroepen door deze tastants kwantificeren. Echter, elektrofysiologie vereist gespecialiseerde apparatuur en het uitvoeren van metingen van een enkele smaak sensillum kan technisch uitdagend zijn, afhankelijk van de cel-type, de grootte en positie. Bovendien kan enkel neuron resolutie in Drosophila moeilijk te bereiken, aangezien smaak sensilla house meer dan één type chemosensory neuron. De live calcium imaging hier beschreven methode maakt reacties van enkele smaak neuronen in levende vliegen te meten. Deze methode is vooral geschikt voor het afbeelden van neuronale reacties op lipide feromonen en andere ligand soorten die lage oplosbaarheid in water gebaseerde oplosmiddelen.

De GCaMP calcium indicator werd genetisch uitgedrukt in Gr68a-Gal4 of ppk23-Gal4 chauffeurs. Verschillende populaties van voorpoot neuronen en niet-neurale steuncellen worden gelabeld door elke bestuurder (figuur 3A-C). Ligand-specifieke reacties op de lipofiele feromoon CH503 waargenomen in Gr68a-Gal4 en ppk23-cellen die Gal4 GCaMP (Figuur 3D). De relatieve verandering in fluorescentie-intensiteit van het signaal GCaMP5G (AF / F) en...

De voorpoten en slurf van Drosophila bevatten een rijk repertoire van gustatoire sensorische neuronen. Hier presenteren we een methode met behulp van calciumbeeldvorming om fysiologische reacties van sensorische neuronen in de voorpoot en slurf van levende vliegen te meten na exogeen aanbrengen van een gustatoir feromoon.

Meten van fysiologische reacties<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensorische neuronen te Lipid Feromonen met Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Het algemene doel van deze procedure is om de fysiologische responsen van gustatoire neuronen van Drosophila op lipid-feromonen te meten. Deze techniek kan worden gebruikt om kernvragen in de sensorische neurobiologie te beantwoorden, zoals het identificeren van liganden voor wees-gustatoire receptoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de responsen van individuele gustatoire neuronen kunnen worden bestudeerd in een intact, levend dier.Nadat de vlieg is gebouteerd, wordt deze met een zeer kleine druppel transparante nagellak op een dekglas van 0,17 millimeter bevestigd. Bevestig de zijkant van de vlieg met de gehele druppel aan het objectglas. Rek vervolgens, onder een dissectiemicroscoop, een voorpoot van de vlieg uit met behulp van een nat penseel.Bevestig vervolgens het eerste en vijfde tarsale segment aan het dekglas met twee zeer dunne stroken tape. Indien neuronen op de proboscis moeten worden afgebeeld, plaats dan een andere dunne strook tape over het rostrum van de proboscis om het labellum bloot te leggen. Maak nu met een PAP-pen een kort muurtje rondom de vlieg.Laat de anesthesie een half uur lang uitwerken voordat de metingen worden verricht. Bereid voo

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het...

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

Gelijktijdig opnemen van Calcium Signalen van geïdentificeerde neuronen en eetgedrag van de Drosophila melanogaster</em

Deze video beschrijft in vivo calcium beeldvorming in Drosophila neuronen met behulp van GCaMP. De aanbevolen protocolclip laat zien hoe u veranderingen in GCaMP-fluorescentie van paddestoellichaamneuronen kunt registreren tijdens een olfactorisch conditioneringsexperiment.

Drosophila In Vivo Calcium imaging: een methode voor functionele beeldvorming van neuronale activiteit

This video demonstrates a method for detecting sensory neuron responses in Drosophila using ligand binding and fluorescence imaging. Ligands bind to neuron receptors, causing calcium influx. The calcium binds to indicator complexes, leading to fluorescence emission, which confirms the neuronal response to the ligand.

Detecting Physiological Responses from Sensory Neurons in Drosophila

This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates calcium imaging to study Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

Dit artikel beschrijft een aanpasbare ex vivo protocol voor het visualiseren van Ca 2+ tijdens ei activering in Drosophila.

Beeldvorming Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bij Egg Activering

Dit witboek beschrijft een protocol voor ex vivo calcium beeldvorming van de hersenen van Drosophila . Bij deze methode, kunnen natuurlijke of synthetische verbindingen worden toegepast op de buffer voor het testen van hun vermogen om bepaalde neuronen in de hersenen activeren.

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Een calciumbeeldvormingsbenadering maakt het mogelijk om smaakgeïnduceerde reacties in de hersenen van wakkere vliegen vast te leggen terwijl een oplossing op het labellum wordt aangebracht. Primaire smaakresponsen in Drosophila melanogaster worden als voorbeeld gebruikt, maar dit protocol kan worden aangepast om stroomafwaartse neuronen of andere soorten te bestuderen.

In vivo Calciumbeeldvorming van smaakgeïnduceerde neurale reacties bij volwassen Drosophila

We presenteren calciumbeeldvormingsprotocollen voor een Drosophila-larvale olfactorische neuron, met behulp van een topische weefsellijm voor immobilisatie. Deze methode verbetert de stabiliteit en maakt betrouwbare in- en ex-vivo-experimenten mogelijk. Aangepaste R-scripts analyseren calciumsignalen en bieden een efficiënt platform voor gedetailleerd neurofysiologisch onderzoek.

In-vivo en ex-vivo calciumbeeldvorming van een reukcircuitneuron in de larve van de Drosophila melanogaster met een derde instar

Leer calcium imaging van Drosophila smaakneuronen bij lipide feromonen. Deze methode maakt real-time meting van neuronale activiteit in levende vliegen mogelijk voor sensorische neurobiologie onderzoek.

Meten van fysiologische reacties

Meer video's verkennen