Hoge-resolutie Kwantificering van Geur-begeleide Gedrag in Drosophila melanogaster Met behulp van de Flywalk Paradigm

Het algemene doel van deze gedragsbioassay is om geurgeleide gedragingen bij azijnvliegen te onderzoeken. Fly Walk is een high-throughput systeem dat automatisch het gedrag van meerdere individuele vliegen volgt en analyseert naar olfactorische stimuli. Deze nieuwe techniek kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van insectenolfactie.

Zoals wat de hedonische balans van een geur is, of wat de toevoeging van extra geurstoffen betekent voor deze balans? Het grote voordeel van dit experiment is dat we geurgeleide gedragingen in hoge tijdelijke resolutie kunnen volgen en we gebruiken geurstoffen die vergelijkbaar zijn met die welke insecten in de natuur ervaren of met die we ook gebruiken in elektrofysiologische opnames. Over het algemeen kunnen individuen die deze methode proberen te gebruiken worstelen omdat het echt een luchtdicht systeem nodig heeft, dus je moet weten waar de lucht doorheen gaat en je moet er zeker van zijn dat er helemaal geen lekken zijn waar de lucht het systeem kan verlaten. Voor deze experimenten is het belangrijk om de vliegen te kweken onder een 12 op 12 licht-donker cyclus in lage tot middelmatige culturen die een normaal voedingsmedium bevatten.

Houd de kamertemperatuur tussen 23 en 25 graden Celsius en de relatieve luchtvochtigheid moet ongeveer 70% zijn tijdens de voorbereiding. Gebruik grote kweekbuisjes om 20 tot 30 volwassenen gedurende een week te maken en verzamel groepen van 30 tot 40 nakomelingen van gemengd geslacht om een experimentele cohort te maken. Wanneer een cohort twee tot vier dagen oud is, verplaats het dan naar een nieuw buisje met een vochtige schuimprop of vochtig tissuepapier.

Laat de vliegen in dit buisje 24 uur verhongeren voor de test. Het is essentieel dat de vliegen niet worden verdoofd tijdens deze overdracht. Voor deze opstelling dienen 250 milliliter flessen als vele luchtbevochtigers.

Vul elke fles met 100 milliliter gedistilleerd water. Bereid vervolgens halve milliliter werkstocks van elke geurstof voor als een 1000-verdunning van de pure geuren en minerale olie. Bereid eveneens een PCR-buisje voor met alleen minerale olie om als negatieve controle te dienen.

Bereid nu het geurtoedieningssysteem voor voor elke geurstof. In het experiment. Verbind twee kogelkleppen met elke geurbuis.

Zorg ervoor dat de geurbuisjes in de juiste stroomrichting worden aangesloten. Een verkeerde verbinding zal niet alleen het geplande experiment compromitteren, maar het kan ook het toedieningssysteem besmetten. Controleer vervolgens het systeem op lekken.

Versluit eerst de uitlaat van de mengkamer. Controleer vervolgens of alle luchtstroom voor het stimulerende apparaat tot nul daalt. Als er lekken in het systeem zijn, luister dan ernaar.

Ze kunnen meestal worden opgelost door rubberen afdichtingen bij cruciale verbindingen te vervangen of Teflon-buisjes te vervangen. Voor de eerste stap van deze procedure is het breken van glas een zorg, dus trek beschermende kleding aan. Breng voorzichtig 15 individuele testvliegen over naar de individuele glazen buisjes. Gebruik een aspirator om de glazen buisjes aan beide kanten te sluiten met de bijbehorende adapters, ze moeten heel strak passen.

Verbind vervolgens de geladen glazen buisjes met de fly walk-opstelling. Zodra alle buisjes zijn bevestigd, laat de vliegen zich ten minste 15 minuten aanpassen aan de nieuwe omgeving voordat het experiment begint. Schakel nu de lichtbron in.

Zorg ervoor dat er voldoende licht is voor efficiënt volgen zonder de temperatuur in de glazen buisjes te verhogen. De geurbuisjes moeten op dit punt allemaal zijn verbonden om een gesloten systeem te creëren. De aanpassingsperiode is afhankelijk van een gesloten systeem zonder lekken, dus de luchtstroom door de buisjes is met dezelfde snelheid als tijdens de testperiodes.

Controleer de luchtstroom op de computer, verbind deze met de digitale stroomsnelheidmeters. De totale luchtstromen die het systeem verlaten, moeten gelijk zijn aan de luchtstroom die het systeem binnenkomt. Als dat niet zo is, is er een lek aanwezig.

Het lek zal de luchtstroom in alle buisjes beïnvloeden, maar de problematische buis is meestal degene die de grootste daling in luchtstroom vertoont. Als er een nieuw lek wordt geïdentificeerd, wordt dit meestal veroorzaakt door een glazen buisje dat binnen in de adapter is gebroken, of het wordt veroorzaakt door scherven van glas binnen de adapters uit eerdere experimenten. Zorg er tijdens dit proces voor dat de luchtvochtigheid van de lucht die het systeem verlaat tussen 60 en 80% is. Nadat de vliegen zich hebben aangepast aan hun buisjes, kan het experiment worden uitgevoerd.

In principe kan tot nu toe elke sequentie van geuren worden gepresenteerd. De beste resultaten kunnen worden behaald door de stimuli te randomiseren en ze met minimaal 90 seconden van elkaar te scheiden. In totaal.

Presenteer elke geur 40 keer in pulsen van 500 milliseconden. Stel vervolgens een gebied van belang in door een frame over het te bewaken gebied te slepen. Bevat alle 15 glazen buisjes in het frame, maar sluit de buitenste vijf millimeter van de buisjes uiteinden uit.

De volgende stap is om de trackingsoftware uit te schakelen en wijzigingen aan te brengen in het script. Dat zal de Y-as positie van de 14 parallelle lijnen die de individuele buisjes scheiden, veranderen. Wanneer de trackingsoftware weer is ingeschakeld, mag er maar één vlieg aanwezig zijn tussen twee lijnen.

Zorg er vervolgens voor dat de cameraparameters zijn ingesteld zodat de vliegen betrouwbaar door de glazen buisjes kunnen worden gevolgd. Als de vliegen verloren gaan aan de randen van het gebied van belang, verhoog dan de helderheid of de versterking van de trackingsoftware. Nu het systeem volledig is voorbereid, start u het stimulusprotocol.

Neem de posities van de vliegen op met een snelheid van 20 frames per seconde en log deze coördinaatposities in combinatie met de status van de geurklep in tekstbestanden. Omdat het experiment erg gevoelig is voor geuren, is regelmatige schoonmaak vereist om de glazen buisjes schoon te maken, ze