Een nieuwe aanpak die Elimineert Handling voor het bestuderen van agressie en de "verliezer" Effect in
30 december 2015
Tijdens fruitvlieg gevechten, de gedragspatronen waargenomen, vechten dynamiek, en de bijbehorende leren en geheugen worden beïnvloed door de experimentele omstandigheden. De hier gepresenteerde protocol beschrijft een nieuwe werkwijze die volledig elimineert hantering vliegen bij experimenten. Dit verbetert gevecht dynamiek en maakt de vorming van een sterke "verliezer" effecten.
Het algemene doel van deze methode is om het ontstaan van 'loser' en 'winner' effecten bij drosophila, melanin, gaster te introduceren door het hanteren van de vliegen uit de gedragsprocedure te elimineren. De meeste gedragsstudies bij dieren die in een laboratoriumomgeving worden uitgevoerd, houden het hanteren van de dieren in. Het hanteren van de dieren induceert op zijn beurt meestal stress bij de dieren, en stress kan de gedragsstudies die u probeert uit te voeren beïnvloeden; daarom wordt getracht het stressvolle hanteren van dieren te elimineren.
We hebben een nieuwe kamer ontwikkeld voor onze agressiestudies bij fruitvliegen die de hantering van de dieren vóór, tijdens of na de experimenten volledig elimineert. Met deze nieuwe kamers zijn alle gedragsparameters die we hebben gemeten verbeterd. Met deze methode minimaliseren we de gedragsvariabiliteit tussen individuen.
We verkorten de tijd die nodig is om duidelijke dominantierelaties te genereren, en we waren in staat om sterke verliezers- en winnaarsmentaliteiten op te wekken. Deze kamers zijn eenvoudig in gebruik en kunnen multifunctioneel worden ingezet om verschillende gedragingen van fruitvliegen te bestuderen. Om het experiment te starten, worden vliegenstammen gekweekt en onderhouden in een incubator met een licht-donkercyclus van 12 uur bij 25 °C en 50% relatieve vochtigheid.
Bereid vervolgens isolatiebuisjes voor door vers vliegvoedsel te verhitten tot het is gesmolten. Breng met een pasteurpipet ongeveer 1,5 milliliters gesmolten vliegvoedsel over in enkele lege glazen reageerbuisjes en laat het voedsel stollen met behulp van een fijn penseel. Verwijder voorzichtig een mannelijke pop in een laat stadium uit het stokvial en plaats deze aan de zijkant van een reageerbuisje met vers bereid voedsel.
Sluit de isolatiebuisjes af met watten en bewaar de isolatiebuisjes in de incubator. Na de isolatie zijn de vliegen klaar om gemarkeerd te worden. Anestheseer de vlieg met koolstofdioxide en gebruik vervolgens een fijne tandenstoker.
Breng een kleine stip acrylverf aan op het thorax en vermijd het schilderen van de kop, vleugels, het abdomen of de poten. Laat de verf ongeveer 10 seconden drogen en breng de vliegen voorzichtig terug naar hun oorspronkelijke isolatiebuisjes. Plaats de isolatiebuisjes terug in de incubator.
Ga verder met de voorbereiding van de apparatuur door vers vliegvoedsel te verhitten tot het gesmolten is. Gebruik een posterior pipette om 0,8 milliliters voedsel over te brengen naar de dop van het schroefdopbuisje en laat het voedsel afkoelen. Zodra het voedsel is afgekoeld.
Breng een kleine druppel verse gistpasta aan in het midden van het oppervlak van het voederbakje. Was de apparatus en de individuele gevechtskamers met water voor elk gebruik en droog ze af met een papieren handdoek. Breng vervolgens een druppel plamuur aan op het voederbakje en plaats dit in het midden van elke gevechtskamer.
Dek de gevechtskamers af met het deksel van de apparatus. Plaats het afgedekte apparatus onder een lichtbron en installeer een videocamera boven de constructie. Begin de gedragsexperimenten door plastic scheidingswanden in elke gevechtskamer te plaatsen.
Verwijder de wattenprop uit de isolatiebuis en plaats de buis onder een open gat aan de zijkant van het apparaat. Laat de vlieg de gevechtskamer binnengaan via de negatieve geo-as. Sluit vervolgens de schuifwand. Nadat de vlieg de kamer is binnengegaan, herhaalt u de procedure om de tweede vlieg aan de andere kant van het apparaat in de gevechtskamer te introduceren.
Plaats de apparatuur vervolgens terug in de verlichte positie voor de videopopname. Start de video-opname en verwijder de plastic scheidingswand zodat de vliegen kunnen interageren voor de experimenten naar het 'loser effect'. Neem de eerste gevechten gedurende 20 minuten op om de vorming van sterke dominantierelaties te waarborgen.
Vervang na 20 minuten voorzichtig de plastic scheidingswand in de vechtkamers om de vliegen te scheiden en stop de video-opname. Om een sterke verliezersmentaliteit op te wekken, moet u ervoor zorgen dat de vliegen tijdens het eerste gevecht een dominantierelatie tot stand brengen en behouden, en vervolgens de verstoring van de dieren minimaliseren bij het inbrengen van de scheidingswanden om de vliegen te scheiden. Begin na een rustperiode van 10 minuten met de opname en verwijder voorzichtig de plastic scheidingswand.
Laat de vliegen nog 20 minuten met elkaar interageren. Stop de opname na 20 minuten om het experiment te beëindigen. Verwijder de vliegen uit de gedragskamers via de negatieve geo-as door de procedure om te keren die werd beschreven voordat de nieuwe methode werd gebruikt om de eerste gevechten te observeren.
Gemiddeld wordt de eerste ontmoeting na twee minuten waargenomen. De eerste uitval vindt plaats na vier minuten, en vliegen vestigen een dominantierelatie na acht minuten. Gedurende de resterende 12 minuten wordt de dominantierelatie versterkt.
Terwijl winnaars steeds actiever aanvallen en verliezers zich steeds meer terugtrekken. De nieuwe benadering werd gebruikt om het verliezerseffect te kwantificeren: het percentage verliezers dat ook de tweede gevechten verliest tijdens deze tweede gevechten. Een significant effect werd waargenomen wanneer eerdere verliezers voor hun tweede gevechten werden gekoppeld aan bekende winnaars of aan onbekende winnaars.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de agressie-assay wordt uitgevoerd met mannelijke vliegen van zes tot zeven dagen oud die in sociale isolatie zijn opgegroeid. Eenmaal beheerst, maken deze kamers een eenvoudige introductie, monitoring, interactie en scheiding van de vliegen mogelijk zonder enige fysieke hantering, wat een sterk "loser-effect" induceert. Het gebruik van scheidingswanden om de vliegen na het eerste gevecht te scheiden, maakt variatie in het experimentele protocol mogelijk.
We kunnen de winnaars behouden en hen in het tweede gevecht koppelen aan een andere tegenstander om een winnaarseffect op te wekken. Met kleine aanpassingen kunnen dezelfde kamers worden gebruikt om het hofmakingsgedrag, de voortbeweging en andere sociale gedragingen van de fruitvlieg te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van agressie-assays en in het opwekken van een verliezerseffect zonder manipulatie van de vliegen vóór en tijdens de experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie introduceert een nieuwe methode voor het bestuderen van agressie bij fruitvliegen door het elimineren van hantering, wat stress vermindert en de gedragsresultaten verbetert. Het nieuwe kamerontwerp verhoogt de betrouwbaarheid van het meten van winnaar- en verliezer-effecten bij Drosophila melanogaster.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Diergedrag
Achtergrond
- Het hanteren van dieren kan stress veroorzaken, wat invloed heeft op gedragsstudies.
- Traditionele methoden houden vaak hantering in, wat leidt tot variabiliteit in de resultaten.
- Inzicht in agressie bij Drosophila kan inzicht bieden in gedragsdynamiek.
- Het elimineren van hantering kan leiden tot nauwkeurigere gedragsbeoordelingen.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen die stress bij fruitvliegen tijdens agressiestudies minimaliseert.
- Om de effecten van hantering op gedragsuitkomsten te onderzoeken.
- Om de betrouwbaarheid van het meten van agressiegerelateerd gedrag te verhogen.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een nieuwe kamer voor agressiestudies.
- Eliminatie van hantering vóór, tijdens en na experimenten.
- Meting van diverse gedragsparameters bij Drosophila.
- Vergelijking van resultaten met traditionele hanteringsmethoden.
Belangrijkste resultaten
- Gedragsparameters vertoonden een verbetering met de nieuwe methode.
- Er werd een verminderde variabiliteit tussen individuen waargenomen.
- Sterkere verliezer-effecten werden opgemerkt bij afwezigheid van hantering.
- De algemene vechtdynamiek was verbeterd.
Conclusies
- Het nieuwe kamerontwerp vermindert effectief stress bij fruitvliegen.
- Het elimineren van manipulatie leidt tot betrouwbaardere gedragsgegevens.
- Deze methode kan worden toegepast in verdere studies naar diergedrag.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze methode pakt een cruciale uitdaging in de gedragsneurowetenschap aan: het minimaliseren van experimentele storende variabelen die worden geïntroduceerd door het hanteren van dieren. Door handmatige interventie te elimineren, verbetert deze aanpak de betrouwbaarheid van gegevens voor het bestuderen van ervaringsafhankelijke gedragsveranderingen, zoals winnaar- en verliezereffecten. Dit ondersteunt een nauwkeurigere validatie van targets in neurobehaviorale discovery-pipelines, waarbij gedragsmatige uitkomsten ten grondslag liggen aan mechanistische hypothesen.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar genetische en omgevingsinvloeden op agressie-gerelateerde pathways mogelijk zonder storende factoren door stress als gevolg van hantering.
- Operationele waarde: Vermindert de gedragsvariabiliteit tussen individuen, wat de gevoeligheid van de assay voor het detecteren van subtiele fenotypische veranderingen verbetert.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het beperken van risico's bij targets die betrokken zijn bij leren, geheugen en sociaal gedrag door nauwkeurigere gedragsmatige read-outs te bieden.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar platform voor het kwantificeren van agressiedynamiek en de vorming van sociale hiërarchieën.
- Operationele waarde: Faciliteert workflows die compatibel zijn met high-throughput door geautomatiseerde toegang van vliegen via geotaxis en scheiding van kamers met behulp van schuifjes.
- Klaarheid voor assay: Genereert kwantitatieve resultaten zoals gevechtlatentie, uitvalfrequentie en de timing van dominantierelaties voor toepassingen bij het screenen van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele relevantie: Maakt onderzoek mogelijk naar ervaringsgerelateerde gedragsveranderingen die aspecten modelleren van psychiatrische stoornissen die gekoppeld zijn aan sociale nederlaag en stressreactiviteit.
- Mechanische risicoreductie: Maakt het mogelijk om specifieke neurale circuits of moleculaire pathways te isoleren die bijdragen aan de vorming van het 'loser effect', zonder ruis door hantering.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt longitudinale gedragsmonitoring over meerdere vechtbeurten om adaptieve of maladaptieve gedragsplasticiteit te beoordelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege ontdekkingsworkflows waarbij gedragsfenotypen worden gebruikt om targets te valideren die de functie van neurale circuits en de gedragsregulatie beïnvloeden. Het maakt consistente fenotypering mogelijk voordat er wordt overgegaan tot mechanistische studies of therapeutische interventiestudies.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing rondom genen of geneesmiddelen die agressie, sociaal geheugen en stressrespons-paden beïnvloeden.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve gedragsmatrieken die essentieel zijn voor het vergelijken van genetische of farmacologische condities.
- Analytiek: Maakt meting van temporele gedragsparameters mogelijk (bijv. begin van gevecht, frequentie van uitvallen, vaststelling van dominantie) om dosis-respons- of genotype-fenotype-correlaties te informeren.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische modellen door ethologisch relevante sociale gedragingen vast te leggen die geconserveerde mechanismen van stress en leren reflecteren.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Het ontwerp van de kamer is aanpasbaar voor andere sociale gedragingen van Drosophila, waardoor de bruikbaarheid in meerdere ontdekkingsprogramma's toeneemt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in gedragstests door handelingen als storende variabele te elimineren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gestandaardiseerde workflows zonder handelingen.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming bij targetvalidatie door het aantal fout-positieven als gevolg van stress-geïnduceerde gedragsruis te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt een nauwkeurigere prioritering van targets mogelijk op basis van betrouwbare gedragstypische fenotypes in ziekterelevante systemen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de houderij van Drosophila, gedragsobservatie en videogebaseerde fenotypering.
- Is afhankelijk van toegang tot gedragstrackingsystemen en omgevingscontroles (licht/donker-cycli, temperatuur, vochtigheid).
- Vereist standaardisatie tussen laboratoria voor de opstelling van de kamer, de isolatie van vliegen en de timing van gedragsepochen.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan wijziging van de op geotaxis gebaseerde toetredingsmechanismen vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten beperkingen in de kamergrootte en afhankelijkheid van de mobiliteit van de vlieg voor zelfbelading in de arena's.
