RNAi-gemedieerde controle van Aflatoxines in Peanut: Methode om Mycotoxine Productie en transgenexpressie Analyseer de Peanut /

Het algemene doel van dit werk is om een betrouwbare, nauwkeurige, goedkope en snelle methode te bieden voor het testen van de werkzaamheid van RNAi-gemedieerde silencing van aflatoxine-synthesegenen van aspergillus in transgene pinda's met behulp van een minimumaantal zaden, meestal zijn honderden gram zaden nodig om aflatoxinen effectief in monsters te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er minder dan vijf zaden worden gebruikt om een specifieke behandeling 10 dagen van tevoren te testen voordat de zaden worden voorbereid, stelt een cultuur van aflatoxine-positieve aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7 in ZAP Pex auger-medium in. Laat deze cultuur groeien bij 25 graden Celsius.

Deze zal worden gebruikt voor zaadinoculatie. Na het voorbereiden van de transgene planten die de RNAI tot expressie brengen, zoals beschreven in het tekstprotocol, gaat u verder met het oogsten van hun zaden. Verwijder eerst het peri carp door middel van slijpwerk van een hogedrukreiniger ingesteld op laag of schraap het peri carp met de hand los.

Zodra het peri carp is verwijderd, identificeert u de kleur van het meso carp door de peulen op een volwassenheidsbord in de juiste groepen te plaatsen. Verwijder nu de gaten en verwerk de gele en bruine zaden afzonderlijk. Bereken het aantal zaden dat voor het experiment nodig is, ten minste drie zaad stukken, wat betekent dat er drie co leadin-helften nodig zijn per pindalijn die wordt bemonsterd.

Bedek de bodem van een steriele beker met een laag zaden en bedek de zaden vervolgens met een gemeten volume van 75%ethanol. Verdubbel vervolgens dat volume. Laat de zaden 30 seconden in de oplossing incuberen en spoel ze daarna af met gesteriliseerde gedistilleerd water.

Behandel vervolgens de zaden met een volume van 2%hypochloriet zoals gedaan met de F ethanol. Laat deze incubatie vijf minuten duren. Gebruik vervolgens drie spoelingen in vijfvoudige volumes gesteriliseerde gedistilleerd water.

Om het hypochloriet te verwijderen, is het van cruciaal belang dat alle hypochlorietoplossing in deze stap wordt weggespoeld. De zaden zijn nu oppervlakte gesteriliseerd. Hydrateer vervolgens de zaden door ze twee uur onder te dompelen in gesteriliseerde gedistilleerd water, voorbereid om de gehydrateerde zaden op een steriele petrischaal te plaatsen.

Alle materialen moeten op dit punt worden gesteriliseerd. Verwijder de zaadmantels met behulp van een pincet, scheid vervolgens de cohain. Verwijder ten slotte de embryo's met een scalpel.

De embryo's kunnen worden weggegooid of worden gebruikt om nieuwe planten te regenereren. Snijd vervolgens het oleïne doormidden met een scalpel en dompel de helften onder in gesterileerd gedistilleerd water tot ze klaar zijn voor inoculatie. Deel vervolgens overtollig water van de helft co leadin op steriele papieren handdoeken en plaats de zaad stukken in afzonderlijke 1,5% auger platen met zaadgrootte uitsparingen en stop de zaden erin met de gesneden zijden omhoog om de co leadin-helften te inoculeren.

Voeg twee microliters van een 10.000 aspergillus sporen per microliter suspensie toe aan de gesneden oppervlakken. Laat de suspensie niet over de zijden van de zaadhelften lopen. Plaats de schalen vervolgens een tot vier dagen in een donkere incubator bij 30 graden Celsius totdat ze worden getest.

Na één dag, na twee dagen en na drie of vier dagen bemonster de zaden door willekeurig geselecteerde geïncubeerde helften zachtjes te verwijderen zoals nodig is. Gebruik een doek om overtollige sporen en auger weg te vegen en plaats het monster in een glazen schroefdopflesje. Breng niet-geïncubeerde monsters over naar twee milliliterbuisjes voor R-T-P-C-R-analyse.

Bevriest monsters in vloeibaar stikstof en bewaar bevroren monsters in een vriezer totdat ze worden verwerkt. Voor de aflatoxine-analyse, neem indien nodig de geïncubeerde helft cot leadin in een vier milliliter glazen schroefdopflesje. Het monster zal vele maanden stabiel zijn bij min 80 graden Celsius.

Wanneer de zaden op kamertemperatuur zijn, extraheert u het monster door vier volumes methanol toe te voegen en de buisjes in de donkere overnacht te laten incuberen bij kamertemperatuur zonder roeren. De volgende dag voert u eerst de UPLC uit, bereidt u een 1,5 milliliter propeen mini-kolom met een bijpassende frit voor. Voeg vervolgens 200 milligram aluminiumoxide toe.

En voeg vervolgens nog een frit toe. Plaats vervolgens de A-U-P-L-C autosampler buis onder en in contact met de mini-kolom om verdamping te minimaliseren. Voeg nu 0,5 milliliter methanol-extract van het monster toe aan een wegwerpbare glazen twee niet plastic.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter aceto nitrile toe aan de buis en meng de oplossingen met een pipet. Breng nu 0,5 milliliter van het mengsel aan op de voorbereide mini-kolom en verzamel de EIT met alleen zwaartekracht. Zodra de EIT is verzameld, bevestigt u snel een septisch dopje op de verzamelbuis voor gebruik op de UPLC.

Plaats de flesjes in A-U-P-L-C die al zijn voorbereid met een mobiele fase van water, methanol en acedoniet trial. Bepaal vervolgens de aflatoxine-inhoud in de EIT's. Zie het tekstprotocol voor meer details samen met UPLC-analyse.

Stel de zaad stukken die voor extractie worden gebruikt op in afzonderlijke glazen flesjes. Lyofiliseer vervolgens de flesjes een nacht en meet het droge gewicht van het weefselmonster in de ochtend, zodat aflatoxineconcentraties kunnen worden uitgedrukt in nanogram per gram monster. Verwijder vervolgens de monsters uit de vriezer en voeg triol toe en vermaal de bevroren weefsels met een parelmolen homogenisator op 3.100 RPM gedurende 40 seconden en ga verder met RNA-extractie. Een RNAI-vector die kleine fragmenten van vijf aflatoxine-synthesegenen van een flavis bevat, werd gebruikt om pindaplanten te transformeren.

De identificatienummers komen overeen met de genome-annotatienummers van het Broad Institute van 99 geregenereerde TRANSFORMANTS, zeven PCR-positieve