Biomimetische materialen Bacteria-gastheer interacties karakteriseren

Het algemene doel van deze procedure is om biomimetische materialen te produceren die bestaan uit pure recombinante adhesies, gekoppeld aan polystyreenkralen, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de biochemische en functionele interacties tussen individuele bacteriële adhesies en gasthercelrreceptoren te ontleden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van gastheer-pathogeeninteracties, zoals het meten van de effecten op gastheercelsignalering en remming van door pathogenen gemedieerde cytotoxiciteit. Het grote voordeel van deze techniek is dat gezuiverde adhesies, a AEA's, directioneel en covalent gekoppeld worden aan polymeerdeeltjes die qua grootte vergelijkbaar zijn met bacteriën en zodoende de bacteriële oppervlaktedisplay nabootsen.

De procedure zal worden gedemonstreerd door TU A-C-E-D-A PhD-student uit ons laboratorium. Thal amine directionele koppeling zal hier worden gedemonstreerd. Dit protocol is geschikt voor het koppelen van cystine-bevattende eiwitten aan amine-gefunctionaliseerde polymeerkralen met behulp van SUL succinyl voor p meli fenylbutyraat, of SMPB Als kruislinkmiddel, bereid alle benodigde reagentia net voor gebruik, zoals beschreven in de protocoltekst om de procedure voor kraalactivering te starten.

Meng een kraal suspensie voorzichtig door om te keren en breng vervolgens de vereiste hoeveelheid kraal suspensie over in een steriele 1,5 milliliter buis. Bevat één milliliter steriele PBS pH 7,0, zuigt voorzichtig op en neer om de kralen te wassen en pellet door centrifugatie in een microcentrifuge. Verwijder voorzichtig de snat met een pipet en een scar.

Reese schort het kraal pellet in één milliliter vers steriele PBS en herhaal de wasstap. Resuspendeer het kraal pellet. In 0,8 milliliter PBS voeg 200 microliter vers bereide 10 millimolair SFO SMPB toe.

Voor een uiteindelijke concentratie van twee millimolair, incubeer de kraal suspensie gedurende één uur bij 25 graden Celsius op een draaiende wiel terwijl de kralen incuberen. Bereid het eiwit voor voor de volgende koppelingsstap, zodat het onmiddellijk aan de geactiveerde kralen kan worden toegevoegd. Controleer de eiwitconcentratie en pas deze aan op de uiteindelijke concentratie die vereist is voor de koppelingsreactie.Zes.

Micromolair van eiwit en PBS en een volume van één milliliter worden meestal gebruikt voor eiwitreductie. Voeg een TEP-staplossing toe voor een uiteindelijke concentratie van vijf millimolair. Incubeer de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, bewaar enkele microliters van de eiwit oplossing om de initiële eiwitconcentratie te bepalen en een berekening van koppelingsefficiëntie.

Start de eiwitkoppelingsprocedure door de geactiveerde kralen te pellen en de pellet te wassen. Eens in één milliliter vers, steriele PBS, resuspendeer de pellet in de bereide eiwit oplossing om de gewenste eiwitconcentratie te geven. Incubeer de eiwitkraal suspensie gedurende twee uur bij 25 graden Celsius op een draaiende wiel. Na twee uur deactiveer de resterende geactiveerde groepen op de kralen door een Sistine-staplossing toe te voegen tot een uiteindelijke concentratie van 50 millimolair en incubatie van de suspensie gedurende 30 minuten bij 25 graden Celsius op een draaiende wiel.

Houd de kralen door centrifugatie. Bewaar de snat voor het bepalen van de eiwitconcentratie en berekening van koppelingsefficiëntie. Was de kraal pellet twee keer met één milliliter PBS en resuspendeer één milliliter vers PBS om het uiteindelijke product te geven een dag voor de competitie-assay. Zaai elk putje van een 24-putjes plaat met één milliliter hela-cellen bij een concentratie van 150.000 cellen per milliliter.

Dit zal de cellen toestaan om ongeveer 80% co fluentie te bereiken voordat het experiment begint. Inoculeer een vijf milliliter mariene LB-cultuur met een verse kolonie van V para hemolytic en kweek overnacht bij 30 graden Celsius met schudden. Bereid voldoende kraal gekoppelde multivalente adhesiemoleculen voor zoals eerder is gedemonstreerd.

Sta toe voor 100 microliters van 10 x kraal stam per putje of een uiteindelijke concentratie van 500 nanomolair eiwit op de dag van de competitie-assay. Meet de OD 600 van de bacteriecultuur. Bereid infectiemedia voor door bacterieculturen te verdunnen in kleurloze DMM zonder additieven.

Voorverwarm tot 37 graden Celsius met 10%volume tot volume kraal suspensie. Om een MOI van 10 te geven, bereid één milliliter per putje en 10 tot 20% overtollig volume per monster. Verwijder het oude medium uit de putjes en was de gekweekte.

Genees de cellen door aan elk putje één milliliter steriele PBS toe te voegen, voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Verwijder de PBS en voeg één milliliter infectiemedium per putje toe. Voeg oplossingen met controlekralen en bacteriën toe als positieve controles en adhesiekralen en geen bacteriën als negatieve.Controles.

Voeg DMM toe met 0,1%TRITTON X 100 als lysiscontroles. Stel elke experimentele conditie op, inclusief de controles in drievoudig. Incubeer de plaat in een weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius gedurende de gewenste tijdsduur.

Cytotoxiciteit wordt beoordeeld. Vier uur na infectie. Verwijder 200 microliters uit elk putje dat in de 24-putjes plaat is gebruikt en breng over naar een nieuwe 96-putjes plaat.

Slinger de 96-putjes plaat bij 1.500 G gedurende vijf minuten en breng 100 microliters van elk putje over naar een nieuwe 96-putjes plaat. Voeg 100 microliters van de media toe die tijdens de infectie-experimenten is gebruikt aan drie verse putjes van de 96-putjes plaat om als blanco's te worden gebruikt. Voer de lactate dehydrogenase release assay uit met behulp van een LDH Cytotoxiciteit detectiekit en volg de instructies van de fabrikant.

Bereken eerst de hoeveelheid reagens dat nodig is in stappen van 25. Bijvoorbeeld, voor 100 monsters. Meng 11,25 milliliter reagens A met 250 microliter reagens B, kantelen om schuim te voorkomen, niet voortdraaien.

Plaats vervolgens