Name: Meten phagosome pH door Ratiometrische fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Leer ratiometrische fluorescentiemicroscopie om phagosomale pH in levende fagocyten te meten. Deze methode maakt real-time monitoring van pH-veranderingen mogelijk voor inzicht in fagosoomrijping en pathogeeninteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs worden financieel ondersteund door de Swiss National Science Foundation via een operationele subsidie N° 31003A-149566 (voor N.D.), en The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust via een Young Investigator Subsidie (voor P.N.).

Ethiek Verklaring: Alle dierlijke manipulaties werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Research Committee van de Universiteit van Genève. 1. Voorbereiding van Fagocytische Doelen <ol><li> Voeg 20 mg gedroogd zymosan tot 10 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Vortex en warmte in een kokend waterbad gedurende 10 min. Koel en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 5 min. </li><li> Verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml PBS en ultrasone trillingen gedurende 10 min in een waterbad ultrasoonapparaat. Breng 500 pi van twee 1,5 ml buizen. Centrifugeer bij 11.000 g gedurende 5 min. </li><li> Herhaal het wassen met 500 pi PBS. De gekookte zymosan worden in porties verdeeld, ingevroren en bewaard bij -20 ° C. </li><li> Was zymosan tweemaal in 500 pl vers bereide 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 zoals hierboven (stap 1,2). </li><li> Resuspendeer in 490 ul na de laatste wasbeurt. Voeg 10 ul van 10 mg / ml FITC opgelost in dimethyl sulfoxide (DMSO), vortex, dek af met folie en incubeer onder schudden gedurende 4 uur bij KT. </li><li> Ongebonden kleurstof te verwijderen, zoals hierboven beschreven wassen (stap 1,2), eerst met 0,5 ml DMSO + 150 pl PBS, vervolgens 0,5 ml DMSO + 300 pl PBS, vervolgens 0,5 ml DMSO + 450 pl PBS, vervolgens PBS alleen. </li><li> Telling zymosan behulp van een hemocytometer. Voeg 1 pl zymosan tot 500 gl PBS, vortex, voeg 10 ul aan de rand van de hemocytometer kamer, waar het de dekglaasje geplaatst over het centrale rooster. Monteer de hemocytometer op een helder-veld microscoop uitgerust met een 20x doelstelling. </li><li> Focus op de linker bovenhoek met 16 pleinen en tellen alle zymosan deeltjes in dit gebied met behulp van een hand telapparaat. Herhaal dit met de rechter bovenhoek. Bereken de zymosan concentratie met behulp van de volgende vergelijking: Zymosan concentratie = count / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml. Gelabelde zymosan worden in porties verdeeld, ingevroren en bewaard bij -20 ° C. </li><li> Opsoniseren de gelabelde zymosan with een konijn anti-zymosan antilichaam bij 1: 100 verdunning. Vortex en incubeer 1 uur in een 37 ° C waterbad. Wassen met 500 pi PBS zoals hierboven (stap 1,2). Opmerking: Sonicatie wordt sterk aanbevolen, vooral na opsonisatie, zoals zymosan neiging klonten die later nog moeilijker kan vormen. Opsonisatie met 65% v / v rat of humaan serum kan worden gebruikt als alternatief. </li><li> Count zymosan met behulp van een hemocytometer, zoals beschreven in de stappen 1,7-1,8, en verdun tot 100 x 10 6 deeltjes / ml. Opsonisatie met andere fagocytische stimulatoren, zoals complement of geen opsonisatie, kunnen als alternatief worden uitgevoerd. </li></ol> 2. Live Video Microscopie <ol><li> Isoleer primaire muis neutrofielen zoals in detail beschreven elders 38. <ol><li> U kunt ook gebruik maken van elke fagocytische celtype. Blijf neutrofielen op ijs in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 5% foetaal kalfserum (v / v), 200 U penicilline / streptomycin, bij een concentratie van 10 x 10 6 cellen / ml tot aan gebruik. Andere celtypen kunnen 1-4 dagen voor worden gezaaid. </li></ol></li><li> Voeg 2 x 10 5 (20 pl) van neutrofielen naar het midden van een 35 mm glazen bodem schaal verspreid de druppel door toevoeging van 50 pl medium en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten om de cellen te hechten. </li><li> Voeg 1 ml Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) verwarmd tot 37 ° C met de specifieke MPO remmer 4-aminobenzoëzuur hydrazide (ABH-4, 10 uM). Niet-specifieke MPO remmers, zoals natriumazide (5 mM), kunnen eveneens worden gebruikt, maar zijn onlangs voorgesteld om bijkomende niet-specifieke effecten op pH 39 uitoefenen. </li><li> Monteer de schotel op een groothoek fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 37 ° C verwarmingssysteem en een 40x olie doelstelling. Incubeer cellen zonder beeldvormende gedurende 10 minuten om de cellen en apparatuur in evenwicht. </li><li> Pas de microscoop instellingen om een ​​helder-veld transmissie verwerven [PHAse of differentiële interferentie contrast (DIC) indien beschikbaar] bij 440 nm of 490 nm excitatie en 535 nm emissie elke 30 sec. </li><li> Pas belichtingstijd en verkrijging frequentie volgens microscoopsysteem teveel fotobleken en fototoxiciteit en afhankelijk van de experimentele vragen die gesteld voorkomen. Begin beeldacquisitie. </li><li> Na 2 min, voeg 10 x 10 6 (50 ui) FITC-geopsoniseerd zymosan naar het midden van de schaal. Pas target: cel verhoudingen, afhankelijk van het type fagocyt en doel gebruikt. </li><li> Verder beeldvorming voor 30 min. Na 30 minuten stoppen met de time-lapse acquisitie en start een timer. Verplaats het podium en vastleggen 10 of meer foto&#39;s in verschillende gebieden van het oog op het andere fagosomen, allemaal binnen 5 min. </li></ol> 3. kalibratie en controle-experimenten <ol><li> Bereid de pH ijkoplossingen (recepten worden beschreven in tabel 1) voorafgaand aan de dag van het experiment en vries in 10 ml aliquots.Ontdooi de ijkoplossingen en warm tot 37 ° C in een waterbad. Controleer de pH met een pH-meter en noteer de werkelijke pH van oplossingen. </li><li> Monteer een peristaltische pomp aan de glazen bodem schaal voorafgaand aan het verwerven en uitvoeren van live video-microscopie, zoals hierboven (punt 2) beschreven. </li><li> Aan het eind van de 30 min verwervingsperiode zet de pomp om de oplossing binnen de schaal te verwijderen, voeg 1 ml van de eerste ijkoplossing en stop de pomp. </li><li> Wacht tot het signaal stabiliseert, meestal 5 min. Herhaal dit met elke kalibratie oplossing. <ol><li> Voer tenminste één kalibratie experimentele per dag en kalibreren beginnen met de hoogste pH en werken sequentieel de laagst, en vanaf de laagste pH en na elkaar werken naar de hoogste. </li></ol></li><li> Als controle, voeg 100 ul van 100 uM NADPH oxidase inhibitor difenyl propionium jodide (DPI) verdund in HBSS met cellen in 900 pi HBSS in het glas onderste schaal, enincubeer 10 min. </li><li> Start acquisitie en voeg zymosan zoals hierboven (stap 2.7). Na 15 min van fagocytose, voeg 10 ul van 10 uM V-ATPase inhibitor concanamycin A (ConcA) verdund in HBSS en verder imaging gedurende nog 15 min. </li></ol> 4. Analyse <ol><li> Analyse van de time-lapse filmpjes en phagosome snapshots. Opmerking: de volgende instructies zijn specifiek voor ImageJ. Stap-voor-stap instructies sterk kunnen variëren, afhankelijk van de software gebruikt, maar in dit hoofdstuk beschreven functies zijn beschikbaar in de meest professionele software voor beeldanalyse. <ol><li> Open de beelden met professionele software voor beeldanalyse. Aftrekken van de achtergrond in de 490-kanaal door het tekenen van een klein plein ROI met het kwadraat polygoon selectietool in een gebied waar er geen cellen, en te klikken op Plugins&gt; BG aftrekken van ROI. Upload dan dezelfde ROI op de 440 kanaal door te klikken op Bewerken&gt; Selectie&gt; Herstel Selectie en herhaal. </li><li>Maak een 32-bits-verhouding beeld van de 490 kanaal gedeeld door de 440-kanaal door te klikken Process&gt; Afbeelding Calculator ..., de juiste beelden te selecteren in het Image1 en Image2 drop-down menu&#39;s, dan kiezen voor &#39;Divide&#39; in de Operation drop-down menu , en het controleren van het resultaat check-box 32-bit (float). </li><li> Verander de kleurcodering look-up tafel met een verhouding-compatibele kleurcodering door te klikken op Afbeelding&gt; Lookup Tables&gt; Rainbow RGB. Image de verhouding drempel tot 0 en oneindigheid pixels te elimineren door te klikken op Afbeelding&gt; Aanpassen&gt; Drempel .... Stel de schuifbalken zodat zymosan verschijnt in rood en klik op Toepassen, zorg ervoor dat de set achtergrond pixels om NaN is ingeschakeld. </li><li> Combineer deze verhouding stapel met de heldere-veld kanaal in een multi-channel samengestelde door te klikken op Afbeelding&gt; Kleur&gt; Kanalen samenvoegen, en de heldere-veld afbeelding in de grijze kanaal dropdown menu en de verhouding afbeelding in het groene kanaal dropdown menu te selecteren, en selecteren van deHoud bronafbeeldingen check-box. Scan de time-lapse filmpjes of foto&#39;s om te bepalen welke phagosomes worden geanalyseerd. De helder-veld channel nuttig voor. </li><li> Trekken regio&#39;s van belang (ROI) met de ovale polygoon selectietool rond fagosomen, en voeg ze toe aan de ROI manager door te klikken op Analyseren&gt; Extra&gt; ROI Manager&gt; toevoegen. Meet hun zymosan intensiteitsverhouding door te klikken op Meer&gt; Multi-Measure en de-selecteren van de één rij per slice check-box. </li><li> Voor time-lapse filmpjes, spoor phagosomes een voor een door het tekenen van een ROI, het typen van Ctrl + M op elk tijdstip te meten, en het verplaatsen van de ROI wanneer dat nodig is om de intensiteit waarden in de tijd te volgen. Kopieer de metingen uit het raam resultaten in een spreadsheet-software. Opmerking: Analyse van 15 (5 tijdsverloop per experiment x 3) onafhankelijke experimenten is ideaal, maar min of meer nodig zijn, afhankelijk van de waargenomen variabiliteit. Opslaan van de ROI wordt altijd aanbevolen. Sommige software pakketten kunt image registratie en dynamische updates van ROI, het vergemakkelijken van dit deel van de analyse. </li></ol></li><li> Conversie van fluorescentie pH-waarden <ol><li> Meet de 490/440 ratio voor phagosomes in de kalibratie time-lapse filmpjes zoals beschreven in paragraaf 4.1. </li><li> In een spreadsheet, trek de ratiowaarden tijd, en bereken de gemiddelde verhouding van alle waarden phagosomes binnen het gezichtsveld (gewoonlijk 5-20) van 5 tijdstippen in het midden van de periode die overeenkomt met elke pH kalibratie oplossing. (Zie ook de rode vakjes in figuur 5A). </li><li> Plot deze gemiddeld 490/440 verhouding waarden tegen de werkelijk gemeten pH. Combineer tenminste 3 onafhankelijke kalibraties in één grafiek. Gebruik statistische of numerieke software een lineaire regressie (best passende curve) uitvoeren, meestal een sigmoïdale vergelijking. Opmerking: Bijvoorbeeld, in figuur 5B de gebruikte vergelijking is een Boltzmann sigmoïdale [Y = bodem + ((boven-beneden)/ (1 + EXP ((V50-X) / Helling))], waarbij Y waarden zijn de 490/440 ratio&#39;s, X zijn de pH-waarden en de Boven, Onder, zijn V50 en de helling parameters berekend door de software. </li><li> Met de verkregen vergelijking om verhoudingswaarden transformeren naar pH. Opmerking: Bijvoorbeeld, in figuur 5B de vergelijking verkregen voor de ijkcurve in aanwezigheid van natriumazide is 490/440 Ratio = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 ​​+ EXP ((6,993 pH) /0.9291)] . Oplossen voor pH geeft de volgende vergelijking: pH = 6,993-,9291 * [LN ((1,178 / (Verhouding-1,103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yeung, T., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+signaling+and+the+modulation+of+surface+charge+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis.</a> Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Fairn, G. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+nascent+phagosomes+mature+to+become+phagolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes.</a> Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).</li>
<li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+and+associated+ion+fluxes+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis.</a> Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).</li>
<li>Binder, B., Holzhutter, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothetical+model+of+cargo-selective+rab+recruitment+during+organelle+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation.</a> Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).</li>
<li>Hurtado-Lorenzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V-ATPase+interacts+with+ARNO+and+Arf6+in+early+endosomes+and+regulates+the+protein+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway.</a> Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).</li>
<li>Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidification+and+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Acidification and protein traffic.</a> Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vacuolar+pH+and+its+modulation+by+some+microbial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).</li>
<li>De Vito, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sodium%2Fhydrogen+exchanger%3A+a+possible+mediator+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity.</a> Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).</li>
<li>Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+channels%2C+including+ClC-3%2C+are+required+for+normal+neutrophil+oxidative+function%2C+phagocytosis%2C+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+reactions+and+microbial+killing+in+the+neutrophil+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).</li>
<li>Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-Gated+Proton+Channels+as+Novel+Drug+Targets%3A+From+NADPH+Oxidase+Regulation+to+Sperm+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology.</a> Antioxid Redox Signal. , (2014).</li>
<li>Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+production+in+the+phagosome%3A+impact+on+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).</li>
<li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-+and+macrophage-targeted+NADPH+oxidase+mediates+antifungal+host+defense+and+regulation+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice.</a> J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).</li>
<li>Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+voltage-gated+proton-selective+channel+lacking+the+pore+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain.</a> Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).</li>
<li>El Chemaly, A., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+Hv1+proton+channels+regulate+the+ionic+and+redox+homeostasis+of+phagosomes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes?</a> Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).</li>
<li>El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+differentially+regulate+the+pH+of+neutrophil+and+macrophage+phagosomes+by+sustaining+the+production+of+phagosomal+ROS+that+inhibit+the+delivery+of+vacuolar+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases.</a> J Leukoc Biol. , (2014).</li>
<li>Decoursey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+proton+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated proton channels.</a> Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).</li>
<li>Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hv1+proton+channels+are+required+for+high-level+NADPH+oxidase-dependent+superoxide+production+during+the+phagocyte+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).</li>
<li>Sturgill-Koszycki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+acidification+in+Mycobacterium+phagosomes+produced+by+exclusion+of+the+vesicular+proton-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase.</a> Science. 263 (5147), 678-681 (1994).</li>
<li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+and+avirulent+strains+of+Francisella+tularensis+prevent+acidification+and+maturation+of+their+phagosomes+and+escape+into+the+cytoplasm+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages.</a> Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).</li>
<li>Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+activates+virulence+gene+transcription+within+acidified+macrophage+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).</li>
<li>Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+macrophages.+In+situ+assessment+of+vacuolar+H%28%2B%29-ATPase+activity%2C+counterion+conductance%2C+and+H%2B+%27leak%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).</li>
<li>Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+candidacidal+activity+in+macrophages+activated+by+recombinant+gamma+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon.</a> Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).</li>
<li>Ip, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+phagosome+acidification+are+required+for+pathogen+processing+and+MyD88-dependent+responses+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).</li>
<li>Clarke, M., Maddera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocyte+meets+prey%3A+uptake%2C+internalization%2C+and+killing+of+bacteria+by+Dictyostelium+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae.</a> Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).</li>
<li>Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of the phagosomal pH in neutrophils.</a> J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).</li>
<li>Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+burst+of+phagocytic+cells+is+associated+with+a+rise+in+vacuolar+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH.</a> Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126 (1), 205-218 (2006).</li>
<li>Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomal+proteolysis+in+dendritic+cells+is+modulated+by+NADPH+oxidase+in+a+pH-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner.</a> EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).</li>
<li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).</li>
<li>Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+%28GILT%29+maintains+phagosomal+proteolysis+in+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages.</a> J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).</li>
<li>Sanjurjo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scavenger+protein+apoptosis+inhibitor+of+macrophages+%28AIM%29+potentiates+the+antimicrobial+response+against+Mycobacterium+tuberculosis+by+enhancing+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy.</a> PLoS One. 8 (11), e79670(2013).</li>
<li>Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utility+of+Chloroquine+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Res+Opin%22%5BJournal%5D)">The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy.</a> Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).</li>
<li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li>
<li>El Chemaly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSOP%2FHv1+proton+channels+sustain+calcium+entry%2C+neutrophil+migration%2C+and+superoxide+production+by+limiting+cell+depolarization+and+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification.</a> J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).</li>
<li>Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HVCN1+channel+conducts+protons+into+the+phagocytic+vacuole+of+neutrophils+to+produce+a+physiologically+alkaline+pH%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH.</a> bioRxiv. , (2014).</li>
<li>Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+regulation+of+the+cellular+responses+to+cold+shock%3A+the+responses+in+yeast+and+mammalian+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems.</a> Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).</li>
<li>Yui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basolateral+targeting+and+microtubule-dependent+transcytosis+of+the+aquaporin-2+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).</li>
<li>Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+phagosome+individuality+and+membrane+signalling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">On phagosome individuality and membrane signalling networks.</a> Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).</li>
<li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel er meer tijd dan andere methoden, zoals spectroscopie en FACS, dat een soortgelijke strategie voor het gebruik van een pH-gevoelige kleurstof gekoppelde doelwitten in dienst maar meet de gemiddelde pH van een populatie phagosomes, microscopie biedt verschillende voordelen. Eerste is dat de interne en externe gebonden, maar niet geïnternaliseerd, kunnen deeltjes gemakkelijk te onderscheiden zijn, zonder dat aan andere chemicaliën, zoals trypaanblauw of antilichamen toe te voegen, respectievelijk blussen of het eti...

Fagocytose, het proces waarbij aangeboren immuuncellen grote deeltjes inslikken, is geëvolueerd uit het eetmechanisme van eencellige organismen en omvat binding aan een doelwit, het omhulsel met een membraan en het afknijpen van het membraan om een vacuole in het cytosol te vormen, een fagosoom genaamd. Terwijl het fagosomale membraan afkomstig is van het plasmamembraan, transformeren actieve eiwit- en lipide-sortering, evenals fusie met endomembranen tijdens fagosoombevorming, het fagosoom in een uniek orgaan binnen de cel met degradatieve eigenschappen die het doden, neutraliseren en afbreken van het ingeslikte materiaal mogelijk maken1-3. Dit proces, fagosomale rijping genaamd, is afhankelijk van de levering van een groot aantal proteolytische en microbicidaal actieve enzymen, waaronder de nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH) oxidase die elektronen overbrengt naar fagosomen en daarbij de sterke oxidant O2- en zijn afgeleide reactieve zuurstofsoorten (ROS) produceert 2,4.
De luminale pH van fagosomen heeft een diepgaande invloed op verschillende gebeurtenissen die noodzakelijk zijn voor fagosoombewerking. Ten eerste beïnvloedt de pH het verkeer van endomembranen in het algemeen, aangezien pH-afhankelijke conformationele veranderingen van transmembraan verkeersregulatoren de rekrutering van verkeersdeterminanten zoals Arfs, Rabs en vesiculaire coat-eiwitten veranderen, die op hun beurt bepalen welke vesicles met fagosomen kunnen fuseren 5-8. Ten tweede wordt de ionische samenstelling van het fagosomaal lumen ook getransformeerd naarmate fagosomen rijpen, en sommige ionentransporters, zoals de Na+/H+ uitwisselingskanaal of ClC-familie Cl-/H+ antiporters, die de fagocytische functie bevorderen, zijn afhankelijk van H+ translocatie 9,10. Evenzo is ROS-productie nauw verbonden met de fagosomale pH. ROS en zijn toxische oxidatieve bijproducten worden al lang erkend als cruciaal voor fagosomale killing in neutrofielen 4,11,12 en zijn aangetoond een kritische rol te spelen in andere fagocyten, inclusief macrofagen, dendritische cellen (DC's) en amoebe 13-16. De NADPH oxidase is een elektrogisch enzym dat H+ in het cytosol vrijgeeft terwijl NADPH wordt geconsumeerd, en dat de gelijktijdige overdracht van H+ vereist door begeleidende HVCN1-kanalen naast de getransporteerde elektronen in het fagosomaal lumen, om de enorme depolarisatie te verlichten die anders zou leiden tot zelfinhibitie van het enzym 17-21. Ten slotte hebben verschillende proteolytische enzymen een optimale activiteit bij verschillende pH, zodat tijdsafhankelijke fagosomale pH-veranderingen van invloed kunnen zijn op welke enzymen actief zijn en wanneer. De belangrijkheid van de fagosomale pH wordt benadrukt door organismen zoals Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis en Salmonella typherium die de fagocytische killing ten minste gedeeltelijk onderbreken door de fagosomale pH te veranderen 22-24.
Bij zoogdieren zijn de belangrijkste fagocyten neutrofielen, macrofagen en dendritische cellen, en afhankelijk van het celtype kunnen tijdsafhankelijke fagosomale pH-veranderingen sterk variëren en verschillende rollen lijken te spelen. In macrofagen is een sterke en snelle acidificatie, gemedieerd door de ATP-afhankelijke protonenpomp vacuolaire ATPase (V-ATPase), een van de belangrijkste factoren die killing mediëren 25-27, vergelijkbaar met de mechanismen die aanwezig zijn in amoebe die fagocytose als eetmechanisme gebruiken 28. In deze cellen wordt gedacht dat activering van zure proteasen een sleutelrol speelt. In tegenstelling daarmee vertrouwen neutrofielen meer op ROS en HOCl geproduceerd door myeloperoxidase (MPO)11, en blijft de pH neutraal of alkalisch gedurende de eerste 30 minuten, alleen later zuur wordend 29,30. Het is gesuggereerd dat een neutrale pH de activiteit van oxidatieve proteasen zoals bepaalde cathepsinen bevordert. Bij DC's is de fagosomale pH controversieel, waarbij sommigen acidificatie rapporteren en anderen neutrale of alkalische pH 31,32, maar ROS en pH kunnen de mogelijkheid van deze cellen om antigenen aan T-cellen te presenteren, een van hun hoofdfuncties, diepgaand beïnvloeden 33.
Belangrijk is dat hormonen, chemokinen en cytokinen signaalgebeurtenissen kunnen veroorzaken die rijping en veranderingen in fagocytgedrag induceren en op hun beurt de fagosomale pH beïnvloeden 34,35. Evenzo kunnen geneesmiddelen, bijvoorbeeld het antimalariamiddel chloroquine, dat ook wordt overwogen voor antikankertherapieën 36, de fagosomale pH en daarmee immuunresultaten beïnvloeden. Daarom kunnen een verscheidenheid aan celbiologen, immunologen, microbiologen en geneesmiddelontwikkelaars geïnteresseerd zijn in het meten van fagosomale pH bij het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de effecten van een specifieke genetische verstoring, bioactief verbinding of micro-organisme op aangeboren en adaptieve immuunresponsen.
Hier beschrijven we een methode voor het meten van fagosomale pH in neutrofielen die ons in staat stelde de belangrijkheid van het HVCN1-kanaal in het reguleren van de fagosomale pH van neutrofielen te tonen 19. De methode is gebaseerd op de ratiometrische eigenschap van fluoresceïne isothiocyanaatje (FITC) waarvan de fluorescentie-emissie bij 535 nm pH-gevoelig is wanneer geëxciteerd bij 490 nm maar niet bij 440 nm 37. Wanneer deze kleurstof chemisch gekoppeld is aan een doelwit, in dit geval zymosan, kan deze worden gevolgd met behulp van brede veldfluorescentiemicroscopie, waarbij cellen worden afgebeeld terwijl ze fagocyteren, en fagosomale pH-veranderingen worden gemeten in realtime terwijl het

<table><tbody><tr><td>Zymosan A powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4250</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Fluoresceïne isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Anti-zymosan antilichaam (Zymosan A Bioparticles opsoniserend reagens)</td><td>Life Technologies</td><td>Z2850</td><td>Sigma-Aldrich O6637 is een gelijkwaardig product. Als alternatief kan 25% serum worden gebruikt als een opsoniserend reagens.</td></tr><tr><td>4-Aminobenzoëzuurhydrazide (4-ABH)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-204107</td><td>Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Difenyleenjodiumchloride (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Concanamycin A (ConcA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27689</td><td>Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Nigericine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-026-G001</td><td>Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14200-075</td><td>Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Hank's balans zoutoplossing</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Ringer's gebalanceerde zoutoplossing of andere heldere fysiologische buffers kunnen worden vervangen.</td></tr><tr><td>Natriumcarbonaat (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethansulfonzuur (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethansulfonzuur (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3777</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&nbsp;</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Absoluut ethanol (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Er bestaan verschillende leveranciers</td></tr><tr><td>Glazen bodem 35 mm petrischaal (Fluorodish)</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Ibidi &micro;-clear schalen of dekglasjes met geschikte beeldvormingskamers kunnen worden vervangen</td></tr><tr><td>Soniërende waterbad</td><td>O. Kleiner AG</td><td></td><td>Een sonicator kan worden gebruikt in plaats daarvan, er bestaan verschillende instrumentleveranciers</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Marienfeld GmbH</td><td></td><td>Er bestaan verschillende instrumentleveranciers</td></tr><tr><td>Widefield live imaging microscoop</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Er bestaan verschillende instrumentleveranciers, maar de microscoop moet in staat zijn om 440/535 en 490/535 respectievelijk op te nemen/emissie. Spinning disk confocale set-ups met brightfield mogelijkheden kunnen worden vervangen, maar zymosan heeft de neiging vaker uit focus te gaan.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp (Dynamax RP-1)</td><td>Rainin</td><td></td><td>Er bestaan verschillende instrumentleveranciers</td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Schott Gerate GmbH</td><td></td><td>Er bestaan verschillende instrumentleveranciers</td></tr><tr><td>Handmatige teller</td><td>Milian SA</td><td></td><td>Er bestaan verschillende instrumentleveranciers</td></tr></tbody></table>

meten phagosome ph door ratiometrische fluorescentie microscopie

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Fagocytose is een fundamenteel proces waarmee aangeboren immuuncellen overspoelen bacteriën, apoptotische cellen of andere vreemde deeltjes om te doden of neutraliseren ingeslikt materiaal, of het te presenteren als antigenen en start adaptieve immuunreacties. De pH van phagosomes is een kritische parameter reguleren splitsing of fusie met endomembranes en activering van proteolytische enzymen, gebeurtenissen die het mogelijk maken de fagocytische vacuole om te rijpen in een afbrekende organel. Bovendien wordt translocatie van H + nodig voor de productie van hoge niveaus van reactieve zuurstof species (ROS), die essentieel zijn voor efficiënt doden en signalering naar andere gastheer weefsels. Vele intracellulaire pathogenen ondermijnen fagocytische doden door het beperken van phagosomal verzuring, met de nadruk op het belang van de pH in phagosome biologie. Hier beschrijven we een ratiometrische methode voor het meten phagosomal pH in neutrofielen via fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) -gelabeld zymosan als fagocytische targets, en live-cell imaging. De assay is gebaseerd op het fluorescentie-eigenschappen van FITC dat wordt afgeschrikt door zure pH wanneer geëxciteerd bij 490 nm maar niet wanneer geëxciteerd bij 440 nm, waardoor kwantificatie van een pH-afhankelijke verhouding, in plaats van absolute fluorescentie van een kleurstof. Een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van in situ calibratie kleurstof en omschakeling van verhouding echte pH-waarden is ook voorzien. Single-dye ratiometrische werkwijzen worden in het algemeen beschouwd als superieur voor één golflengte of dual-dye pseudo-ratiometrische protocol, omdat zij minder gevoelig voor storingen zoals bleken, focus verandert, laser variaties en onregelmatige labeling, waarbij het gemeten signaal verstoren. Deze werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan pH in andere fagocytische celsoorten meten en zymosan kan worden vervangen door een andere amine-bevattende deeltjes uit inerte kralen levende micro-organismen. Tenslotte kan deze werkwijze worden aangepast voor toepassing van andere fluorescerende probes die gevoelig zijn voor verschillende pH-bereiken of andere phagosom makenal activiteiten, waardoor het een algemene protocol voor functionele beeldvorming van phagosomes.

De volgende resultaten zijn representatief voor een experiment waarbij de phagosomal pH van primaire muis neutrofielen geïsoleerd uit het beenmerg van wildtype of Hvcn1 - / - muizen werden vergeleken. Voor een succesvolle experiment is het belangrijk om voldoende phagosomes binnen het gezichtsveld te verkrijgen gedurende de gehele duur van de time-lapse film, terwijl het vermijden teveel fagosomen, wat later moeilijker segment in de beeldanalyse wordt. Figuur 1 toont voorb...

Phagosomale pH beïnvloedt fagosoombeschikking, oxidatiemiddelproductie, fagosomale doding en ook antigeenpresentatie. Hier beschrijven we een ratiometrische methode voor het meten van tijdsverloop en eindpunt-pH-veranderingen in individuele fagosomen in levende fagocyten met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Meten phagosome pH door Ratiometrische fluorescentie microscopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Het algemene doel van deze reeks experimenten is om de pH van het fagosoom in levende cellen te meten met behulp van ratiometrische fluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van fagocytbiologie, zoals het identificeren van sleutelmoleculen bij interacties met pathogenen of het effect van genetische disruptie of geneesmiddelen op fagocytose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat, in tegenstelling tot populatiegebaseerde methoden zoals FACS of spectroscopie, effecten zoals veranderingen in de binding en migratie van deeltjes, of de heterogeniteit van individuele fagosomen, kunnen worden gedetecteerd.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot onze therapieën tegen pathogene chemische organismen, omdat veel van deze micro-organismen de pH van het fagosoom kunnen wijzigen om destructie binnen fagosomen te vermijden. Om deze procedure te starten, voeg 20 mg gedroogd Xan toe aan 10 mL steriele PBS, vortex en verhit in een kokend waterbad gedurende 10 minuten. Koel vervolgens af en centrifugeer bij 2000 Gs gedurende vijf minuten.Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer de Xan in één milliliter PBS. Sonicate dit gedurende 10 minuten in een waterbad. Sonicate vervolgens 500 microliters van de geresuspendeerde Xan over twee 1,5 milliliter buisjes en centrifugeer deze bij 11.000 Gs gedurende vijf minuten.Herhaal de wasstap met 500 µL PBS. Was de Xan vervolgens twee keer in 500 µL vers bereide 0,1 M natriumcarbonaatoplossing bij pH 9,3 en RESUSPENDEER na de laatste wasstap in 490 µL natriumcarbonaatoplossing. Voeg vervolgens 10 µL FZ, opgelost in DMSO in een concentratie van 10 mg/mL, toe aan de Xan en meng dit met een vortex.Dek af met folie en incubeer vier uur bij kamertemperatuur onder agitatie. Om het ongebonden oog te verwijderen, wordt eerst gewassen met 0,5 milliliters DMSO plus 150 microliters PBS, inclusief sonicatie tussen de wasstappen. Was vervolgens met 0,5 milliliters DMSO plus 300 microliters PBS, daarna met 0,5 milliliters DMSO plus 450 microliters PBS, gevolgd door PBS alleen. Voeg daarna één microliter Xan toe aan 500 microliters PBS en vortex.Voeg vervolgens 10 µL verdund xma-zand toe aan de rand van de kamer van de hemocytometer waar deze aansluit op het dekglas. Plaats de hemocytometer op een brightfield-microscoop die is uitgerust met een 20x objectief. Stel scherp op de linkerbovenhoek met 16 vierkantjes en tel alle xma-zanddeeltjes in dit gebied. Herhaal de procedure in de rechteronderhoek met behulp van een handmatige telraam.Bereken vervolgens de Xan-concentratie met behulp van deze vergelijking. Opsoniseer daarna de gelabelde Xan met het rabide anti-Xan-antilichaam in een verdunning van 1:100, vortex en incubeer het monster gedurende één uur in een waterbad van 37 °C. Tel vervolgens de xmas-zanddeeltjes met een hemocytometer en verdun deze tot 100 × 10⁶ deeltjes per milliliter.Nadat de primaire muisneutrofielen zijn geïsoleerd, voegt u twee keer 10⁵ neutrofielen toe aan het midden van een glazen bodemschaaltje van 35 millimeter. Verspreid vervolgens de druppel door 50 µL medium toe te voegen en incubeer dit gedurende vijf minuten bij 37 °C om de cellen te laten hechten. Voeg daarna 1 mL HBSS toe, voorverwarmd tot 37 °C en bevatten met een myeloperoxidase-remmer.Plaats de schaal op een breedveld fluorescentiemicroscoop, uitgerust met een verwarmingssysteem van 37 °C en een 40 x olie-objectief. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten zonder beeldvorming om de cellen en de apparatuur te laten equilibreren. Pas vervolgens de instellingen van de microscoop aan om elke 30 seconden een brightfield transmissiebeeld op te nemen met 440 nanometer of 490 nanometer excitatie en 535 nanometer emissie.Voeg na twee minuten 10 keer 10 toe aan de zes ized fitzy zy sand in het midden van de schaal en ga 30 minuten door met het maken van beelden. Stop na 30 minuten de time-lapse acquisitie en start een timer. Verplaats de tafel en maak binnen vijf minuten 10 of meer snapshots in verschillende gezichtsvelden om andere vaga-zones te beelden.Ontdooi bij deze procedure de kalibratie-oplossingen en verwarm deze tot 37 °C in een waterbad. Controleer de pH met een pH-meter en noteer deze. Monteer vervolgens een peristaltische pomp op de schaaltje met glazen bodem voorafgaand aan de beeldacquisitie.Voer vervolgens live videomicroscopie uit aan het einde van de acquisitieperiode van 30 minuten. Zet de pomp aan om de oplossing in het schaaltje te verwijderen. Voeg daarna één milliliter van de eerste kalibratieoplossing toe en stop de pomp.Wacht vijf minuten tot het signaal is gestabiliseerd. Herhaal de procedure met elke kalibratieoplossing. Om de time-lapsefilms en fagosoomsnapshots te analyseren, open je de afbeeldingen met ImageJ. Trek een kleine vierkante ROI in een gebied zonder cellen om de achtergrond in het 490-kanaal af te trekken.Gebruik de vierkante polygoonselectietool en klik op plugins. Voer vervolgens een BG-subtractie uit. Upload dezelfde ROI op het 440-kanaal door op bewerken te klikken.Voer vervolgens een selectie uit, gevolgd door het herstellen van de selectie, en herhaal de procedure voor achtergrondsubtractie. Maak een 32-bit ratio-afbeelding van het 490-kanaal gedeeld door het 440-kanaal door eerst op 'process' te klikken en daarna op 'image calculator'.Select daarna de juiste afbeeldingen in de vervolgkeuzemenu's voor afbeelding één en afbeelding twee. Selecteer 'divide' in het vervolgkeuzemenu voor de bewerking en vink het vakje '32 bit result' aan. Wijzig vervolgens de kleurcodering-opzoektabel naar een ratio-compatibele kleurcodering door te klikken op 'image' en daarna op 'lookup tables'.Kies vervolgens regenboog RGB. Stel een drempelwaarde in voor de ratio-afbeelding om nul- en oneindigheids-pixels te elimineren door op image te klikken. Pas dit vervolgens aan via threshold.Pas de schuifregelaars aan zodat de Xan rood verschijnt en klik op toepassen; zorg ervoor dat het selectievakje 'set background pixels to nan' is aangevinkt. Als de waarden van de achtergrond en het Xan-signaal zeer vergelijkbare ratio-waarden opleveren, wat resulteert in een ruisige ratio-afbeelding, voeg dan een kleine hoeveelheid achtergrond toe aan het 440-kanaal door op 'process' te klikken. Kies vervolgens 'math'.Voeg dit vervolgens toe en maak de ratio-afbeelding opnieuw om een schoner resultaat te verkrijgen. Als alternatief kan de achtergrondsubtractie van het 440-kanaal worden weggelaten. Combineer deze ratio-stack vervolgens met een brightfield-kanaal tot een multi-channel compositie door op 'image color' te klikken.Voeg vervolgens de kanalen samen. Selecteer de brightfield-afbeelding in het vervolgkeuzemenu van het grijze kanaal en de ratio-afbeelding in het vervolgkeuzemenu van het groene kanaal. Selecteer daarna het selectievakje voor het behouden van de bronafbeeldingen.Scan vervolgens de time-lapsefilms of snapshots en vergelijk de brightfield- en ratio-kanalen om te bepalen welke fagosomen geanalyseerd moeten worden. Teken met de ovale polygoonselectietool een ROI rondom de fagosomen en voeg deze toe aan de ROI-manager door op analyse-instrumenten te klikken. Selecteer daarna de ROI-manager en vervolgens toevoegen. Meet vervolgens hun Xan-intensiteitsratio door op meer multi-meting te klikken en deselecteer het selectievakje één rij per slice. Voor time-lapsefilms.Volg de FGA-zones één voor één door een ROI van type controle M te tekenen om elk tijdspunt te meten en verplaats de ROI indien nodig om de intensiteitswaarden in de tijd te volgen. Kopieer vervolgens de metingen vanuit het resultatenvenster naar een spreadsheet om fluorescentie om te rekenen naar pH-waarden. Plot na het berekenen van de 490-tot-440-ratio voor fagosomen in de kalibratietijdlapse-films in een spreadsheet de ratio-waarden over de tijd.Bereken vervolgens de gemiddelde ratio-waarden voor alle fagosomen binnen het gezichtsveld op vijf tijdstippen in het midden van de tijdsperiode die overeenkomt met elke pH-kalibratieoplossing. Zet deze gemiddelde 490-naar-440-ratio-waarden uit tegen de daadwerkelijk gemeten pH door ten minste drie onafhankelijke kalibraties te combineren in één enkele grafiek. Voer daarna een niet-lineaire regressieanalyse uit om een vergelijking te verkrijgen waarmee de ratio-waarden kunnen worden omgezet in pH.Deze figuur laat zien hoe de fagosomen en de ingenomen Xan worden onderscheiden. Het linkerpaneel toont een samengevoegd brightfield-beeld en een 490 tot 440 Fitz zy en ratio. Terwijl het rechterpaneel alleen het brightfield-beeld toont.Fagosomen kunnen worden onderscheiden van externe partikels die ofwel niet colocaliseren met cellen, of waarvan de fluorescentie niet overeenkomt met een donker centrum omringd door een helderdere ring, wat kenmerkend is voor fagosomen in de getoonde brightfield-afbeelding. Hier zijn de typische tijdsklassen van wild-type en HV CN one-knock-out neutrofielen FGA omal pH in de wild-type neutrofielen, de pH's zijn neutraal of licht alkalisch tijdens vroege tijdstippen. Na opname kunnen de fagosomen van HV CN one-knock-out neutrofielen ofwel alkalisch of zuur zijn compiling. Snapshots genomen 30 tot 35 minuten na de toevoeging van targets maken het mogelijk om de gemiddelde populatie smal pH te berekenen uit een groot aantal fagosomen in de histogrammen van de hier getoonde Fitz Xan-ratio's.We konden de verschillen in de pH van kleine blaasjes waarnemen tussen wild-type en HVCN1-knock-out neutrofielen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in zes uur worden uitgevoerd. Beginnend bij de optimalisatiestap tijdens het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om aan optimalisatie van de beeldvormingscondities te denken. Ten eerste kan het optimaliseren van de antilichaamconcentratie voor de optimalisatiestap ook nuttig zijn om een robuuste fagocytose na deze procedure te garanderen.Andere methoden, zoals het meten van de ROS-productie of het meten van de bacteriële doding, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of de hoeveelheid ROS of het vermogen van het fagosoom om bacteriën te doden samen met de pH verandert na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de fagocytbiologie om te onderzoeken welke factoren het vermogen van fagocytische cellen beïnvloeden om de ingenomen materialen te doden of te verwerken om verdere immuunresponsen op te wekken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u geometrische fluorescentiemicroscopie uitvoert om fysiologische parameters van fagosomen in real-time in levende cellen te meten.Vergeet niet dat het werken met UNIFOR-remmers en levende cellen uiterst gevaarlijk kan zijn, en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a high-resolution total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy technique for real-time visualization of phagosome formation and closure during macrophage-mediated phagocytosis of IgG-opsonized red blood cells (RBCs) attached to the surface of a glass bottom dish. The macrophages extend pseudopodia around the RBCs and engulf them inside the phagosomes, detaching them from the glass surface.

TIRF Microscopy-Based Visualization of Phagosome Formation and Closure

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen

Er zijn verschillende methoden beschikbaar om intracellulaire pH te meten, maar zeer weinig van deze laten gelijktijdige meting van cytoplasmatisch en organellair pH toe. Hier beschrijven we in detail een snelle en nauwkeurige methodologie om gelijktijdig cytoplasmatisch en vesiculair pH te meten door middel van ratiometrische beeldvorming van levende cellen.

Gelijktijdige meting van de pH in Endocytische en Cytosolic compartimenten in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Hier presenteren we een protocol om fagocytose van fluorescerende deeltjes door een adherante macrofaag-cellijn te kwantificeren met behulp van een fluorometrische methode. Deze methode maakt een hoge doorvoerkwantificering van deeltjesinternalisatie mogelijk, evenals de resulterende actinepolymerisatie.

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

We beschrijven een experimentele opstelling om fagosoombevorming en -afsluiting in drie dimensies in levende macrofagen met ongekend hoge resolutie te visualiseren, met behulp van total internal reflection fluorescentiemicroscopie. Het maakt het mogelijk om de basis van de fagocytische cup, de uitbreidende pseudopoden, evenals de precieze plaats van fagosooombaan te monitoren.

&quot;Phagosome Closure Assay&quot; naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM)

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige methode om de pH en phagosomal gebied en het cytoplasmatische pH van mens en muis neutrofielen via de ratiometrische indicator seminaphthorhodafluor (SNARF) -1 of S-1 te meten. Dit wordt bereikt met behulp van levende cellen confocale fluorescentie microscopie en beeldanalyse.

Beeldvorming van de neutrofielen phagosome en cytoplasma Met behulp van een Ratiometrische pH Indicator

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Neurodegeneratieve ziekten worden geassocieerd met ontregelde microgliafuncties. Dit artikel schetst een in vitro test van fagocytose van neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen. Kwantitatieve microscopie-uitleingen worden beschreven voor zowel live-cell time-lapse imaging als fixed-cell high-content imaging.

In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen

Hier wordt een protocol gepresenteerd om dynamische beelden van mesenchymale stamcel (MSC) gemedieerde regulatie van macrofaag (MΦ) fagocytose van niet-opsonized gist (zymosan) deeltjes die zijn geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te kwantificeren en te produceren.

Mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; Kwantificering en beeldvorming

We beschrijven protocollen voor het meten van pH, oxidatieve gebeurtenissen en eiwitvertering in individuele macropinosomen in levende cellen. De nadruk wordt gelegd op dual-fluorofoor ratiometrische microscopie en de voordelen die het biedt ten opzichte van populatiegebaseerde technieken.

Het meten van de pH, redoxchemie en degradatieve capaciteit van macropinosomen met behulp van dual-fluorofoor ratiometrische microscopie

Leer ratiometrische fluorescentiemicroscopie om phagosomale pH in levende fagocyten te meten. Deze methode maakt real-time monitoring van pH-veranderingen mogelijk voor inzicht in fagosoomrijping en pathogeeninteracties.

Meten phagosome pH door Ratiometrische fluorescentie microscopie

Meer video's verkennen