Meten phagosome pH door Ratiometrische fluorescentie microscopie

Het algemene doel van deze reeks experimenten is om het fagosomale pH in levende cellen te meten met behulp van ratiometrische fluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van fagocytbiologie, zoals het identificeren van belangrijke moleculen in pathogeeninteracties of het effect van genetische verstoring of geneesmiddelen op fagocytose. Het grote voordeel van deze techniek is dat in tegenstelling tot populatiegebaseerde methoden zoals feiten of spectroscopie-effecten, zoals veranderingen in de migratie van deeltjesbinding of in de heterogeniteit van de individuele fagosomen, kan worden gedetecteerd.

De implicaties van deze techniek reiken tot onze therapieën tegen pathogene chemische organismen, omdat veel van deze micro-organismen fragoso-pH kunnen veranderen om afleiding binnen fagosomen te voorkomen. Om deze procedure te starten, voegt u 20 milligram gedroogde Xan toe aan 10 milliliter steriel PBS-vortex en verwarmt u het in een kokend waterbad gedurende 10 minuten. Koel vervolgens af en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 2000 Gs.

Verwijder daarna het supernatant en suspendeert u de Xan opnieuw in één milliliter PBS. Soniceer het gedurende 10 minuten in een waterbad. Soniceer vervolgens en breng 500 microliter van de gesuspendeerde Xan over naar twee 1,5 milliliter buizen en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 11.000 Gs.

Herhaal de wassing met 500 microliter PBS. Was de Xan vervolgens twee keer in 500 microliter vers bereide 0,1 molaire natriumcarbonaat-oplossing met een pH van 9,3 en suspendeer opnieuw in 490 microliter natriumcarbonaat-oplossing na de laatste wassing. Voeg vervolgens 10 microliter FZ opgelost in DMSO toe aan de Xan-vortex, bij een concentratie van 10 milligram per milliliter.

Bedek met folie en incubeer met agitatie gedurende vier uur bij kamertemperatuur Om het ongebonden oog te verwijderen, wast u eerst met 0,5 milliliter DMSO plus 150 microliter PBS, inclusief sonicatie tussen de wasstappen. Was vervolgens met 0,5 milliliter DMSO plus 300 microliter PBS, vervolgens gewassen met 0,5 milliliter DMSO plus 450 microliter PBS gevolgd door alleen PBS. Voeg daarna één microliter Xan toe aan 500 microliter PBS en vortex.

Voeg vervolgens 10 microliter verdunde xma-zand toe aan de rand van de hemo cytometerkamer waar deze de dekglasmontage ontmoet, monteer de hemo cytometer op een lichtveldmicroscoop uitgerust met een 20 x objectief. Focus op de bovenste linkerhoek met 16 vierkanten en tel alle xmas-zanddeeltjes in dit gebied. Gebruik een handteller om de procedure te herhalen in de onderste rechterhoek.

Bereken vervolgens de Xan-concentratie met behulp van deze vergelijking. Opsoniseer vervolgens de gelabelde Xan met het rabid anti Xan-antilichaam bij een verdunning van een op honderd, vortex en incubeer het monster gedurende één uur in een waterbad van 37 graden Celsius. Tel vervolgens de xmas-zanddeeltjes met behulp van een hemo cytometer en verdun vervolgens tot 100 keer 10 tot de zesde deeltjes per milliliter.

Na het isoleren van de primaire muisneutrofielen, voegt u twee keer 10 tot de vijfde van neutrofielen toe aan het midden van een 35 millimeter glazen bodemschaal. Verspreid vervolgens de druppel door 50 microliter medium toe te voegen en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius om de cellen te laten hechten. Voeg vervolgens één milliliter HBSS toe, warm tot 37 graden Celsius, met myeloperoxidaseremmer.

Monteer de schaal op een veldfluorescentiemicroscoop, uitgerust met een verwarmingssysteem van 37 graden Celsius en een 40 x olie-objectief. Incubeer de cellen zonder beeldvorming gedurende 10 minuten om de cellen en apparatuur te laten gelijkwaardig worden. Pas vervolgens de microscoopinstellingen aan om een lichtveldtransmissiebeeld te verkrijgen met 440 nanometer of 490 nanometer excitatie en 535 nanometer emissie elke 30 seconden.

Na twee minuten voegt u 10 keer 10 tot de zesde fitzy zy-zand toe aan het midden van de schaal en blijft u 30 minuten beeldvorming uitvoeren. Na 30 minuten stopt u de time-lapse-acquisitie en start u een timer. Beweeg de stage en maak 10 of meer snapshots in verschillende gezichtsvelden om andere vaga-zones binnen vijf minuten te beeldvormen.

Bij deze procedure ontdooit u de kalibratieoplossingen en verwarmt u ze tot 37 graden Celsius in een waterbad. Controleer de pH met een pH-meter en noteer deze. Monteer vervolgens een peristaltische pomp op de glazen bodemschaal voorafgaand aan de beeldacquisitie.

Voer vervolgens live videomicroscopie uit aan het einde van de 30 minuten durende acquisitieperiode. Zet de pomp aan om de oplossing in de schaal te verwijderen. Voeg vervolgens één milliliter van de eerste kalibratieoplossing toe en stop de pomp.

Wacht vijf minuten tot het signaal gestabiliseerd is. Herhaal de procedure met elke kalibratieoplossing. Om de time-lapse-films en fagosoombeeldjes te analyseren, opent u de afbeeldingen met image J. Trek de achtergrond in het 490-kanaal af door een klein vierkant ROI te tekenen in een gebied zonder cellen.

Gebruik de vierhoekige polygoonselectietool en klik op plugins. Trek vervolgens BG-aftrekking uit. Upload dezelfde ROI op het 440-kanaal door op bewerken te klikken.

Selecteer vervolgens, gevolgd door selectie herstellen en herhaal de achtergrondaftrekkerij. Maak een 32-bits ratiobeeld van het 490-kanaal gedeeld door het 440-kanaal door eerst op proces te klikken. Vervolgens beeldcalculator.

Selecteer vervolgens de juiste afbeeldingen in de afbeelding een en afbeelding twee vervolgkeuzemenu's. Selecteer delen in het bewerkingsvervolgkeuzemenu en vink het selectievakje 32 bits resultaat aan. Verander vervolgens de kleurencoderingslookup-tabel naar een ratio-compatibele kleurencodering door op afbeelding te klikken en vervolgens op tabellen.