Een veelzijdige muizenmodel van Subcortical White Matter Stroke voor de Studie van axonale degeneratie en White Matter Neurobiologie

Het algemene doel van deze procedure is om een kleine beroerte nauwkeurig te lokaliseren in de witte stof van muizen om deze veelvoorkomende vorm van subcorticale witte stof-beroerte te modelleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het beroerteveld, zoals mechanismen van axonschade, neuronale respons op subcorticale beroerte en hoe de cellulaire elementen van de witte stof reageren tijdens zowel de acute als de herstelfasen van een beroerte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om een beroerte nauwkeurig te lokaliseren in de witte stof en dat het kan worden gebruikt met een breed scala aan muizenmodellen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen, vanwege de kleine hoeveelheid witte stof die leidt tot mislokalisatie van de beroerte. Kleine aanpassingen aan de injectiehoek of stereotactische coördinaten voor elke muisstam, of stereotactische opstelling kunnen vereist zijn. Begin met het bevestigen van een getrokken glaspipet aan slangen die zijn bevestigd aan een vacuümlijn.

Plaats het getrokken uiteinde in de L-Nio-oplossing, of L-Nio plus fluorescente tracer. Start de vacuüm en breng zuiging aan totdat ten minste twee millimeter van het 0,5 millimeter dikke gedeelte van de pipet is gevuld. Leg de gevulde pipet op een zijde.

Plaats vervolgens de muis in een stereotactisch apparaat uitgerust met een stereotactische microscoop. Nadat de muis is verdoofd en voorbereid op de operatie volgens goedgekeurde procedures, controleert u de diepte van de anesthesie met een teenprik. Er mag geen reactie zijn.

Stel vervolgens de injectiearm in op 36 graden. Bevestig een getrokken glaspipethouder aan het distale uiteinde van een lage volume drukinjectiesysteem en bevestig deze aan de injectiearm. Na het maken van een 1,5 centimeter middelste hoofdhuid incisie om de schedel bloot te leggen, droogt u het oppervlak van de schedel af met een wattenstaafje.

Bekijk vervolgens, terwijl u door een stereotactische microscoop kijkt, met een vergroting van één tot drie X, gebruik een micropuntgereedschap om eventueel overliggend periostweefsel te verwijderen. Markeer bregma met een fijnpuntmarker. Gebruik vervolgens een chirurgisch boortje uitgerust met een fijn puntig chirurgisch boortje om een twee millimeter elliptische craniotomie te boren, beginnend achteraan bij bregma en zich uitstrekkend naar voren net links van de middenlijn.

Verwijder botfragmenten en overliggend zacht weefsel zodat de hersenschors kan worden gevisualiseerd. Houd het corticale oppervlak vochtig door met tussenpozen druppels steriel zoutoplossing aan te brengen. Bevestig vervolgens de gevulde pipet aan de injectorarm.

Lign het distale uiteinde van de pipet met bregma en nullen de stereotactische coördinaten. Breng de pipet naar het eerste injectiepunt met behulp van de anterieure, posterieure en mediaal-lateraal coördinaten die in tabel één zijn vermeld. Breng vervolgens de pipet naar het corticale oppervlak en nullen de dorsaal-ventrale meting.

Laat de pipet langzaam zakken naar de dorsaal-ventrale coördinaten. Zorg ervoor dat de vergroting van de stereotactische microscoop is ingesteld op drie X en dat het gekalibreerde reticle duidelijk kan worden bekeken. Bekijk de schuine pipet van de zijkant zodat de lucht-vloeistof meniscus een sagittaal zicht heeft.

De meniscus moet in hetzelfde focale vlak verschijnen van zowel de binnen- als buitenwand van de pipet. Injecteer nu, met behulp van een lokaal drukinjectiesysteem ingesteld op 20 PSI voor 20 milliseconde pulsen, 100 nanoliters L-Nio in de hersenen. Wacht na het injecteren van het totale volume vijf minuten om reflux door de pipetbaan te voorkomen.

Trek vervolgens de pipet terug en herhaal de injectieprocedure bij de tweede en derde set coördinaten die in tabel één zijn opgegeven. Na de laatste injectie, verwijder de pipet en plaats genoeg botwas om de craniotomieplaats te vullen. Breng tenslotte de randen van de hoofdhuidwond bij elkaar en bind ze met dermaal hechtmiddel.

Na het toedienen van postoperatieve pijnstilling, plaatst u het dier in een schone kooi. Geef postoperatieve antibiotica in het drinkwater gedurende vijf dagen, of tot het offeren als dit minder dan vijf dagen is. Na het offeren en onthoofden van de muis volgens goedgekeurde procedures, gebruikt u steriele schaar om de schedel achteraan te openen en gebruikt u vervolgens een spatel om voorzichtig het overliggende schedeldak te verwijderen.

Plaats vervolgens een steriele vier millimeter spatel aan de voorkant van de hersenen om de reukbol en de oogzenuwen door te snijden. Til vervolgens voorzichtig de hersenen uit het calvarium en plaats ze in ijskoud dissectiebuffer. Gebruik een hersenblok en steriele scheermesjes om twee tot drie millimeter plakken te snijden die de aangetaste regio bevatten en plaats ze in koude dissectiebuffer.

Onder een dissectiemicroscoop identificeert u de witte stof onder de motorische cortex in de geïnjecteerde hemisfeer. Bij eerdere post-beroerte intervallen kan injectie van L-Nio gemengd met gangbare laboratoriumkleurstoffen, zoals fast green, visuele identificatie van de beroerte mogelijk maken. Bij langere post-beroerte intervallen kan de regio visueel worden geïdentificeerd door focale necrose en myeline bleekheid.

Eenmaal geïdentificeerd, gebruikt u een scalpel om de regio van de witte stof met de beroerte voorzichtig te dissecteren. Verwijder eventueel overliggend cortex en onderliggend striatum, zoals gewenst. Zoals hier getoond, toont immunofluorescente markering voor neurale filamenten, getoond in rood, de mate van axonverlies zeven dagen na de beroerte, met behulp van de mediale benadering.

Met behulp van de achterste hoekige benadering wordt de witte stof-beroerte lesie gericht net boven de laterale ventrikel en toont intense microglia-reactiviteit, zoals gedetecteerd door immunolabeling voor IBA-1. Twee astrocyt intermediaire filament-markeringen, vimentin, getoond in rood, en gliale fibrillaire zure eiwit, getoond in groen, onthullen veranderingen in morfologie van witte stof astrocyten na beroerte. Co-