Een veelzijdige muizenmodel van Subcortical White Matter Stroke voor de Studie van axonale degeneratie en White Matter Neurobiologie

Het algemene doel van deze procedure is om nauwkeurig een klein infarct te lokaliseren binnen de witte stof van muizen, om deze veelvoorkomende vorm van subcorticaal infarct in de witte stof te modelleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van beroertes, zoals de mechanismen van axonale beschadiging, de neuronale respons op een subcorticaal infarct en de manier waarop de cellulaire elementen van de witte stof reageren tijdens zowel de acute fase als de herstelfase van het infarct. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om een infarct precies in de witte stof te lokaliseren en dat deze compatibel is met een breed scala aan muismodellen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, vanwege de kleine hoeveelheid witte stof die leidt tot een onjuiste lokalisatie van het infarct. Kleine aanpassingen aan de injectiehoek of de stereotactische coördinaten voor elke muizenstam, of aan de stereotactische opstelling, kunnen noodzakelijk zijn. Begin eerst met het bevestigen van een uitgetrokken glazen pipet aan een slang die is aangesloten op een vacuümlinie.

Steek het uitgetrokken uiteinde in de L-Nio-oplossing, of de L-Nio inclusief fluorescente tracer. Start het vacuüm en pas zuiging toe totdat minstens twee millimeter van het gedeelte van de pipet met een diameter van 0,5 millimeter is gevuld. Leg de gevulde pipet opzij.

Plaats de muis vervolgens in een stereotactisch apparaat dat is uitgerust met een stereotactische microscoop. Nadat de muis is geanestheseerd en is voorbereid voor de operatie volgens de goedgekeurde procedures, moet de diepte van de anesthesie worden gecontroleerd met een knijptest aan de teen. Er mag geen reactie optreden.

Stel vervolgens de injectiearm in op 36 graden. Bevestig een houder voor een uitgetrokken glazen pipet aan het distale uiteinde van een drukinjectiesysteem voor lage volumes en bevestig deze aan de injectiearm. Maak een midline incisie van 1,5 centimeter in de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen en droog vervolgens het schederoppervlak met een wattenstaafje.

Kijk vervolgens door een stereotactische microscoop bij een vergroting van één tot drie X en gebruik een micropuntinstrument om eventueel overliggend periostaal weefsel te verwijderen. Markeer bregma met een fijne marker. Gebruik daarna een chirurgische boor, uitgerust met een fijngepunts chirurgisch boorbitje, om een elliptische craniotomie van twee millimeter te boren, beginnend posterieur bij bregma en zich anterieur uitstrekkend net links van de middellijn.

Verwijder botfragmenten en het bovenliggende zachte weefsel zodat de cerebrale cortex zichtbaar wordt. Houd het corticale oppervlak vochtig door tussentijds druppels steriele zoutoplossing aan te brengen. Bevestig vervolgens de gevulde pipet aan de injectiearm.

Lijn het distale uiteinde van de pipet uit met bregma en stel de stereotactische coördinaten in op nul. Beweeg de pipet naar het eerste injectiepunt met behulp van de anterieure, posterieure en mediaal-laterale coördinaten die in tabel één worden vermeld. Beweeg de pipet vervolgens naar het corticale oppervlak en stel de dorso-ventrale meting in op nul.

Laat de pipet langzaam zakken naar de dorso-ventrale coördinaten. Zorg ervoor dat de vergroting van de stereotactische microscoop is ingesteld op drie X en dat het gekalibreerde retikel duidelijk zichtbaar is. Bekijk de schuin geplaatste pipet vanaf de zijkant, zodat de lucht-vloeistofmeniscus in het sagittale vlak zichtbaar is.

De meniscus moet zich in hetzelfde brandvlak van zowel de binnen- als buitenwand van de pipet bevinden. Injecteer nu 100 nanoliters L-Nio in de hersenen met behulp van een lokaal drukinjectiesysteem dat is ingesteld op 20 PSI voor pulsen van 20 milliseconden. Wacht na het injecteren van het totale volume vijf minuten om reflux via het pipetkanaal te voorkomen.

Trek vervolgens de pipet terug en herhaal de injectieprocedure op de tweede en derde set coördinaten die in tabel één worden vermeld. Verwijder na de laatste injectie de pipet en breng voldoende botwas aan om de craniotomieplaats te vullen. Benader tenslotte de randen van de hoofdhuidwond en sluit deze met een dermale lijm.

Plaats het dier na het toedienen van postoperatieve analgesie in een schone kooi. Verschaf postoperatieve antibiotica in het drinkwater gedurende vijf dagen, of tot aan de opoffering indien dit minder dan vijf dagen duurt. Na het opofferen en onthoofden van de muis volgens goedgekeurde procedures, gebruik steriele scharen om de schedel posterieur te openen, en gebruik vervolgens een spatel om de bovenliggende schedel voorzichtig te verwijderen.

Breng vervolgens een steriele spatel van vier millimeter in aan de voorzijde van de hersenen om de bulbus olfactorius en de oogzenuwen door te snijden. Til de hersenen daarna voorzichtig uit het schedeldak en plaats deze in ijskoude dissectiebuffer. Snijd met behulp van een hersenblok en steriele scheermesjes plakjes van twee tot drie millimeter die het getroffen gebied bevatten, en plaats deze in koude dissectiebuffer.

Identificeer onder een dissectiemicroscoop de witte stof onder de motorische cortex in het geïnjecteerde hemisfeer. Bij kortere post-stroke intervallen kan injectie van L-Nio gemengd met gangbare laboratoriumkleurstoffen, zoals fast green, de visuele identificatie van het infarct mogelijk maken. Bij langere post-stroke intervallen kan de regio visueel worden geïdentificeerd aan de hand van focale necrose en myelinebleekheid.

Zodra geïdentificeerd, gebruik een scalpel om de regio witte stof die het infarct bevat zorgvuldig te dissekeren. Verwijder de bovenliggende cortex en het onderliggende striatum, indien gewenst. Zoals hier wordt getoond, demonstreert immunofluorescente kleuring voor neurale filamenten, weergegeven in rood, de mate van axonaal verlies zeven dagen na het infarct, gebruikmakend van de mediale benadering.

Met behulp van de posterieure hoekbenadering wordt de witstofinfarctlaesie getarget net boven het laterale ventrikel, waarbij een intense microgliereactiviteit zichtbaar is, gedetecteerd door immunolabeling voor IBA-1. Twee markers voor astrocyten-intermediaire filamenten, vimentine (weergegeven in rood) en glial fibrillary acidic protein (weergegeven in groen), onthullen veranderingen in de morfologie van astrocyten in de witte stof na een beroerte. Co-injectie van fluorescent dextraanamine op het moment van de inductie van de beroerte maakt de identificatie mogelijk van individuele neuronen met axonen die door de beroerte zijn beschadigd.

Het grootste deel van de labeling vindt plaats in axonen binnen neuronen van laag vijf en zes in de primaire sensorimotorische cortices boven het infarct. Deze afbeelding representeert zeven dagen na het infarct. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 45 minuten worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een focale witte stof-infarct bij een muis induceert en het brein voorbereidt voor diverse downstream-verwerkingen, wat nuttig is om belangrijke vragen over beroertes en neurologisch herstel te beantwoorden.