Name: Een Cell Gratis Assay om te studeren Chromatine decondensatie aan het eind van Mitosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Leer een cell-vrij assay om chromatine-decondensatie aan het eind van mitose te bestuderen met HeLa-cellen en Xenopus laevis eicel-extract. Deze methode maakt biochemische manipulatie en isolatie van chromatine-dynamica mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Duitse Research Foundation en de ERC (AN377 / 3-2 en 309.528 CHROMDECON om WA) en een PhD Fellowship van de Boehringer Ingelheim Fonds om AKS figuur 1 &amp; 2 worden herdrukt van Developmental Cell 31 (3), Magalska et al., RuvB-achtige ATPasen functie in chromatine decondensatie aan het einde van de mitose, 305-318, 2014, met toestemming van Elsevier.

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220, 719-721 (1983).</li>
<li>de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+mitotic+chromosomes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract.</a> Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Galy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+gp210+in+mitotic+nuclear-envelope+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown.</a> J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+use+of+Xenopus+egg+extracts+to+study+DNA+replication+and+chromatin+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins.</a> Methods. 57, 203-213 (2012).</li>
<li>Gant, T. M., Wilson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).</li>
<li>Magalska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvB-like+ATPases+function+in+chromatin+decondensation+at+the+end+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis.</a> Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).</li>
<li>Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+structure+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome structure and condensation.</a> Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).</li>
<li>Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+condensation+requires+Brn1p%2C+the+yeast+homologue+of+Barren%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren.</a> Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+remodels+sperm+chromatin+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 69, 759-767 (1992).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+decondensation+in+Xenopus+egg+cytoplasm+is+mediated+by+nucleoplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin.</a> Cell. 65, 569-578 (1991).</li>
<li>Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+nucleoplasmin+from+Xenopus+laevis+oocytes+and+analysis+of+its+developmental+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression.</a> Genes Dev. 1, 97-107 (1987).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Gasser, S. M., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+the+isolation+of+individual+and+clustered+mitotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes.</a> Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).</li>
<li>Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+in+vitro+assays+to+analyze+the+function+of+transmembrane+nucleoporins+and+targeting+of+inner+nuclear+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins.</a> Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).</li>
<li>Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+condensin+complex+is+required+for+proper+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts.</a> J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly+with+lambda+DNA+in+fractionated+Xenopus+egg+extracts%3A+an+unexpected+role+for+glycogen+in+formation+of+a+higher+order+chromatin+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate.</a> J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).</li>
<li>Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+by+nucleosomes+but+not+H1+in+reconstituted+preblastoderm+Drosophila+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin.</a> EMBO J. 13, 373-379 (1994).</li>
<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
<li>Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-independent+nuclear+envelope+assembly+induced+by+Ran+GTPase+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts.</a> Science. 288, 1429-1432 (2000).</li>
<li>Paulson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+chromosome+clusters+from+metaphase-arrested+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells.</a> Chromosoma. 85, 571-581 (1982).</li>
<li>Ramadan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc48%2Fp97+promotes+reformation+of+the+nucleus+by+extracting+the+kinase+Aurora+B+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin.</a> Nature. 450, 1258-1262 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Xenopus laevis ei extracten zijn een zeer nuttig instrument om getrouw weer cellulaire processen in vitro en dit systeem werd met succes gebruikt in de karakterisering van de celcyclus en celdeling gebeurtenissen 2, 3,5,6,17. Door grote winkels nucleaire componenten afgezonderd in het ei tijdens oögenese, ei-extracten zijn een uitstekende bron van cellulaire componenten. Vergeleken met andere benaderingen, zoals RNAi op zoogdierweefsel cellijnen of genetische manipulatie, het een ...

Xenopus laevis ei extract is een krachtige en algemeen toegepaste gereedschap studeren complexe cellulaire gebeurtenissen in de eenvoud van een celvrije assay. Sinds hun eerste beschrijving van Lohka &amp; Masui 1 zij zijn uitgebreid gebruikt om mitotische processen zoals chromatinecondensatie 2, assemblage van de spoel 3, afbraak nucleaire envelop 4, maar ook nucleocytoplasmatisch vervoer 5 of DNA-replicatie 6 bestuderen. De gebeurtenissen die plaatsvinden aan het eind van mitose, noodzakelijk voor hervorming van de interfase nucleus zoals envelope reformatie nucleaire en nucleaire porie complex montage veel minder begrepen vergelijking met de vroege mitotische gebeurtenissen, maar kan eveneens worden bestudeerd door Xenopus ei extract 7. We hebben onlangs een assay gebaseerd op Xenopus ei extract chromatine decondensatie studie eind mitose 8 vastgesteld, een onder onderzochte proces i wachtts gedetailleerde karakterisering. In meercelligen wordt zeer gecondenseerde chromatine op mitotische vermelding om getrouw scheiding van het genetisch materiaal uit te voeren. Om de chromatine toegankelijk voor genexpressie en DNA-replicatie tijdens interfase, moet worden verdicht de-eind mitose. In vertebraten, chromatine tot vijftig maal meer samengeperst tijdens mitose opzichte interfase 9, in tegenstelling tot gisten wanneer de mitotische verdichting meestal lager, bijvoorbeeld, twee-voudig S. 10 cerevisiae. Gewervelde chromatine decondensatie is voornamelijk bestudeerd in de context van sperma DNA reorganisatie na ei bevruchting. Een moleculair mechanisme, waarbij nucleoplasmin, een overvloedige eicel eiwit, ruilt sperma-specifieke protaminen naar histonen H2A en H2B opgeslagen in het ei. Deze werkwijze werd opgehelderd middels Xenopus ei extract 11, 12. De uitdrukkingvan nucleoplasmin is beperkt tot eicellen 13 en mitotische chromatine niet van deze sperma-specifieke protaminen bevatten. Daarom chromatine decondensatie eind mitose is nucleoplasmin onafhankelijk 8. Voor de in vitro decondensatie reactie gebruiken we extract gegenereerd uit geactiveerde X. laevis eieren en chromatine clusters geïsoleerd uit gesynchroniseerde HeLa-cellen. Behandeling van eieren met een calciumionofoor bootst de calcium introductie in de eicel die door sperma ingang tijdens de bevruchting. De calcium golf activeert de celcyclus hervatting en het ei, gearresteerd in de tweede metafase van de meiose, ontwikkelt tot de eerste interfase 14. Daarom ei extracten bereid vorm geactiveerd eieren vertegenwoordigen de mitotische afslag / interphase staat en bevoegd zijn om evenementen die specifiek zijn voor mitotische exit zoals chromatine decondensatie, nucleaire envelop induceren en porie complex reformatie. Voor de isolatie van mitotische chromatin clusters we gebruikten een enigszins aangepaste versie van het protocol gepubliceerd door Gasser &amp; Laemmli 15, waarbij chromosoom clusters worden vrijgemaakt door lysis van HeLa-cellen in mitose gesynchroniseerd en geïsoleerd in polyamine bevattende buffers met gradiënt centrifugeren.

<table><tbody><tr><td>spermine tetrahydrochloride</td><td>Fluka analytical</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>spermidine trihydrochloride</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>high-purity digitonin</td><td>Millipore</td><td>300410-1GM</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Applichem</td><td>A0999,0100</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>thymidine</td><td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>nocodazole</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>37% formaldehyde solution</td><td>Roth</td><td>7398-1</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>trypan blue solution (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF hydrochloride</td><td>Applichem</td><td>A1421,0001</td><td></td></tr><tr><td>pepstatin</td><td>Roth</td><td>2936.1/2/3</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Roth</td><td>CN334</td><td></td></tr><tr><td>aprotinin</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (colloidal silica particles solution)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&sup2; tissue culture flasks</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer (40 ml tissue grinder)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer chamber</td><td>Assistent</td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;m cell strainer, nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>cytochalasin B</td><td>Applichem</td><td>A7657,0010</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Roth</td><td>8682.3</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>L-cystein</td><td>Merck</td><td>1,028,381,000</td><td></td></tr><tr><td>hCG available as Ovogest</td><td>MSD</td><td>1431593</td><td></td></tr><tr><td>PMSG available as Intergonan</td><td>MSD</td><td>1431015</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (mixed calcium-magnesium-salt)</td><td>Enzo</td><td>ALX-450-002-M010</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")</td><td>Braun</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP, 2 Na x 3 H20</td><td>Roth</td><td>K056.1/2/3/4</td><td></td></tr><tr><td>creatine phosphat disodium salt</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>creatine phosphokinase</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 &micro;l)</td><td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>50% glutaraldehyde solution, grade I</td><td>Sigma alderich</td><td>G7651-10 ml</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>0.1% (w/v) poly-L-lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 &micro;l)</td><td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>12 mm coverslips</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 #1</td><td></td></tr></tbody></table>

een cell gratis assay om te studeren chromatine decondensatie aan het eind van mitosis

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

Tijdens de celcyclus van gewervelde dieren ondergaat chromatine uitgebreide structurele en functionele veranderingen. Bij binnenkomst in de mitose condenseert het massief tot staafvormige chromosomen die individueel worden verplaatst door het mitotische spindelapparaat. Mitotische chromatinecondensatie levert chromosomen op die vijftig keer dichter zijn gecompacteerd dan in de interfase. Tijdens het verlaten van de mitose moeten chromosomen hun functionele interfasetoestand herstellen, die is omsloten door een nucleaire envelop en competent is voor replicatie en transcriptie. Het decondensatieproces is morfologisch goed beschreven, maar in moleculaire termen slecht begrepen: we missen kennis over de onderliggende moleculaire gebeurtenissen en in grote mate over de betrokken factoren en hun regulatie. We beschrijven hier een celvrij systeem dat de chromatine-decondensatie getrouw in vitro naspeelt, gebaseerd op mitotische chromatineclusters gezuiverd uit gesynchroniseerde HeLa-cellen en X. laevis-eicelextract. Ons celvrije systeem biedt een belangrijk hulpmiddel voor verdere moleculaire karakterisering van chromatine-decondensatie en de coördinatie ervan met processen die tegelijkertijd plaatsvinden tijdens het verlaten van de mitose, zoals herstel van de nucleaire envelop en poriecomplex.

Tijd afhankelijkheid van de decondensatie reactie Figuur 1 toont een typisch tijdsverloop van de decondensatie assay. De cluster chromosomen zichtbaar aan het begin van de reactie decondenses en overgaat in een enkele, rond en glad kern. Als het ei extract wordt vervangen door sucrosebuffer het chromosoom cluster blijft gecondenseerd, die suggereren dat decondensatie activiteit aanwezig in het ei extract. Chromatine decondensatie is een energie a...

De moleculaire mechanismen van de decondensatie van sterk gecompacteerde mitotische chromatine zijn slecht gedefinieerd. We presenteren een celvrije test op basis van mitotische chromatineclusters geïsoleerd uit HeLa-cellen en Xenopus laevis eierextract die het decondensatieproces in vitro getrouw reconstrueert.

Een Cell Gratis Assay om te studeren Chromatine decondensatie aan het eind van Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Het algemene doel van dit experiment is om de decondensatie van chromatine, zoals deze plaatsvindt aan het einde van de mitose, getrouw te reconstitueren in de eenvoud van een celvrije assay. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar mitose, omdat het de karakterisering van het moleculaire mechanisme van chromatinedecondensatie mogelijk maakt en de identificatie van de betrokken regulatiefactoren faciliteert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het biochemisch eenvoudig gemanipuleerd kan worden en chromatine.Dekolonisatie kan geïsoleerd worden bestudeerd, los van andere gebeurtenissen in de celcyclus. Begin met het isoleren van mitotische chromatineclusters uit helo-cellen en bereid de buffers voor voor deเตรียมing van IIC xenopus lavis eiextract zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Gebruik, zodra deze zijn bereid, een spuit van vijf milliliter uitgerust met een naald van gauge 27 om 500 internationale eenheden humaan choriongonadotrofine te injecteren in kikkers bij wie de ovulatie is geïnduceerd.Injecteer de kikkers op de avond voor het experiment onder de huid van de dorsale lymfzak om de afgifte van de eitjes te induceren. Houd de kikkers na inductie gedurende 13 tot 17 uur op 18 °C in individuele tanks met 1,2 liters Mark's modified Ringers buffer. Verwijder, nadat de kikkers hun eitjes hebben gelegd, de eitjes die al geactiveerd zijn samen met alle eitjes die er slecht uitzien. Verzamel deze door de tanks correct leeg te gieten in glazen bekerglazen van 600 tot 1000 milliliter.Het sorteren van de eieren is cruciaal, aangezien de uiteindelijke kwaliteit van de extracten afhangt van deze stap. Verwijder geactiveerde, sliertige en anderszins slecht uitziende eieren. Ga ook in latere stappen door met het verwijderen van slechte eieren.Giet het S-supernatant af zodra de eitjes zijn bezonken, en vul het bekerglas daarna opnieuw met verse buffer. Herhaal dit proces vier keer om de eitjes te wassen na de laatste wasbeurt. Verwijder het supernatant nog één keer en vul het bekerglas vervolgens met een 2%L cysteïne-oplossing om de eitjes af te grenzen.Vervang na twee tot vier minuten de buffer door verse buffer die L-cysteïne bevat. Beschouw de degelering als voltooid wanneer het volume van de eitjes na ongeveer vijf tot zeven minuten drastisch afneemt en de eitjes dichter op elkaar komen te liggen. Was de eitjes vervolgens voorzichtig in mark's modified ringers buffer door de buffer af te gieten en opnieuw te vullen, waarbij de vloeistof langs de wand van het bekerglas wordt gegoten in plaats van direct op de eitjes.Activeer vervolgens de eieren in 100 milliliters Marx modified ringers buffer met acht microliters van twee milligrams per milliliter Ca²⁺. Stop de activatie zodra de contractie van de animal cap zichtbaar wordt.Of was de eieren na 10 minuten na activatie zorgvuldig in Mark's modified Ringer's-buffer door de buffer af te gieten en opnieuw te vullen; laat de eieren na de laatste wasbeurt bezinken. Incubeer de eieren gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in Mark's modified Ringer's-buffer. Bereid vervolgens centrifugisatiebuisjes van vijf milliliters voor met 50 µL sucrosebuffer en 50 µL 100-voudig protease-inhibitor.Meng 5 µL van 1 M DTT, 12,5 µL cycloheximide en 2,5 µL cytochalasin B. Was de eieren twee keer met koud sucrosebuffer en breng ze vervolgens over in de centrifugebuisjes. Pak de eieren samen door de buisjes één minuut lang te centrifugeren bij 130 ×g met behulp van een plastic Pasteurpipet met een brede opening. Verwijder na centrifugatie het overtollige buffer met een plastic Pasteurpipet en vul de resterende ruimte aan met meer eieren.Centrifugeer vervolgens de met ei gevulde buisjes in een rotor met zwaaibekers van 5 ml gedurende 20 minuten bij 4 °C en 21.000 ×g. Nu de oplossing is gescheiden in drie lagen, steekt u een spuit van 5 ml met een naald van 16 gauge door de zijkant van de buis in de middelste laag, tussen het gele eigeel aan de bovenzijde en net boven het donkere ei-debris aan de onderzijde. Overbreng het laag-snelheid fasische extract in een nieuw buisje op ijs en voeg vervolgens 10 µL van een 100-voudige protease-inhibitor toe.Meng 1 µL 1 M DTT, 2,5 µL cycloheximide in een concentratie van 20 mg/mL en 0,5 µL cyto B. Voeg 10 mg/mL toe aan elke milliliter van het lagesnelheidsextract. Centrifugeer het lagesnelheidsfase-extract gedurende 12 minuten bij 355.000 ×g in een 10 x 2 mL rotor. Verwijder vervolgens voorzichtig de lipidelaag aan de bovenzijde en breng het supernatant met het hogesnelheidsextract over naar een nieuwe buis.Deze stap is cruciaal voor het produceren van een monster van hoge kwaliteit. Zorg ervoor dat de verwijderde vloeistof geen contaminaties bevat van de lipidelaag aan de bovenkant of de storende bodemlaag. Pipetteer 18 µL van het high-speed extract in een reactiebuis van 1,5 mL, en voeg vervolgens 0,5 µL glycogeen en 0,5 µL energy mix toe.Voeg 0.3 µL van 6-dimethylpurine en 0.7 µL van de mitotische clusters toe. Gebruik tips met een brede opening om de reactie direct na toevoeging van het chromatine te mengen om afschering van het gedecompenseerde chromatine te voorkomen. Incubeer het reactiemengsel na het mengen tot twee uur bij 20 °C.Fixeer vervolgens het monster door 0,5 milliliter ijskoud fixatief toe te voegen dat 4%paraldehyde, 0,5%glutaraldehyde en 0,1 milligram per milliliter dpi bevat. Incubeer het monster gedurende 20 tot 30 minuten op ijs met behulp van tips met een brede opening. Codeer daarna ronde dekglasjes van 12 millimeter met een 0,1% gewicht-volume poly-L-lysine-oplossing en incubeer de dekglasjes gedurende vijf minuten om de affiniteit van de dekglasjes te verhogen.Droog de dekglasjes daarna op filterpapier om het chromatine te fixeren. Voeg, zodra ze droog zijn, de gecoate dekglasjes toe aan de bodem van centrifugerbuisjes met een platte bodem van zes milliliter, zodanig dat de gecoate zijde naar boven is gericht. Voeg vervolgens 800 µL van het 30% sucrosekussen toe en breng het volledige gefixeerde monster in een laag daarop aan.Centrifuge het monster gedurende 15 minuten bij 4 °C en 2.500 ×g. Giet vervolgens het supernatant af en verwijder de dekglasjes uit de buisjes door voorzichtig met een naald van 16 gauge tegen de bodem van de centrifugebuis te prikken. Wanneer het dekglasje aan één zijde door de naald wordt opgetild, gebruik dan een pincet om het dekglasje te verwijderen, was het dekglasje snel door het in gedeïoniseerd water te dippen en droog het vervolgens voorzichtig door de zijkant tegen filterpapier te drukken. Plaats daarna een druppel monteermedium op een microscoopglasplaatje en laat de monsterzijde van het dekglasje erop zakken.Plaats het dekglas op het montage medium. Droog het dekglas voorzichtig met een papieren wisdoek, verzegel de rand van het dekglas met nagellak en bewaar het preparaat in het donker tot het wordt afgebeeld. Hier is het typische tijdsverloop van de decompensatie-assay.De cluster van chromosomen die aan het begin van de reactie zichtbaar is, decon, condenseert en fuseert tot één enkele ronde en gladde kern. Wanneer het eiextract wordt vervangen door sucrosebuffer, blijft de chromosomencluster gecondenseerd, wat suggereert dat decompensatie-activiteit aanwezig is in het eiextract. In het hier getoonde experiment werden niet-gehydrolyseerde ATP- of GTP-analogen aan de reactie toegevoegd.Beide additieven remmen de decondensatie, wat bewijst dat dit actieve proces afhankelijk is van zowel ATP- als GTP-hydrolyse. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer twee uur worden uitgevoerd voor de bereiding van het eiextract op Singapore-niveau, en in drie uur voor de assay voor het bevorderen van de dekolonisatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het succes kritisch afhangt van de kwaliteit van het extract.Vooral voor immuno-depleties wordt aangeraden om vers bereid extract te gebruiken volgens deze procedure. Andere methoden, zoals immuno-depleties en de toevoeging van recombinante eiwitten, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke factoren betrokken zijn. Deze techniek zal de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van mitose of kernstructuur en -functie om chromatin-dehumanisatie te onderzoeken zoals deze plaatsvindt aan het einde van de mitose in dierlijke cellen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u lever-eiextracten van Xenopus bereidt en hoe u deze methode toepast om chromatin-decolonisatie te reconstitueren. Vergeet niet dat werken met Paraform Hyde, Hyde en DARPA gevaarlijk kan zijn en dat er voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen.

a-cell-free-assay-to-study-chromatin-decondensation-at-end

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is een methode...

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

Metafase naar anafase transitie wordt geactiveerd door middel van anafase-bevorderende complex (APC / C)-afhankelijke ubiquitinering en de daarop volgende vernietiging van cycline B. Hier hebben we een systeem dat, na pulse-chase etikettering, maakt het monitoren cycline B proteolyse in hele cel populaties en vergemakkelijkt de detectie van inmenging van de mitotische checkpoint.

Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het visualiseren van een DNA dubbelstrengs breuken signaleringeiwit geactiveerd in reactie op DNA schade en de lokalisatie tijdens mitose.

Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten

This video describes the protocol for chromatin shearing using micrococcal nuclease enzymatic digestion. Chromatin shearing is an essential step in Chromatin immunoprecipitation or ChIp workflow, which helps investigate protein-DNA interaction in human chronic myeloid leukemia cells. In the feature protocol chromatin shearing is performed using sonication.

Chromatin Shearing: A Method to Generate Chromatin Fragments Using Enzymatic Digestion

We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.

Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

Oögenese bij zoogdieren is bekend dat zij vergissing-geneigd, met name als gevolg van chromosoom missegregation. Dit manuscript chromatine verspreid voorbereiding worden methoden beschreven voor muis profase, metafase I en II-geënsceneerde eicellen. Deze fundamentele technieken toestaan voor de studie van chromatine-gebonden eiwitten en chromosoom morfologie in zoogdieren oögenese.

Chromatine verspreid preparaten voor de analyse van muis oöcyt progressie van profase naar metafase II

De plasticiteit van nucleaire het platform wordt beheerd door dynamische Epigenetische mechanismen, met inbegrip van niet-coderende RNAs, DNA methylering, nucleosoom herpositionering evenals Histon samenstelling en wijziging. Hier beschrijven we een Formaldehyde-Assisted isolatie van regelgevende elementen (FAIRE)-protocol, waarmee de bepaling van de chromatine toegankelijkheid in een reproduceerbare, goedkope en eenvoudige wijze.

Formaldehyde-bijgewoonde isolatie van regelgevende elementen maatregel chromatine toegankelijkheid in zoogdiercellen

Live-cel imaging biedt een schat aan informatie op afzonderlijke cellen of hele populaties die onbereikbaar is door de vaste cel imaging alleen. Hier, worden live-cel imaging protocollen te beoordelen cel lot beslissingen naar aanleiding van de behandeling met de anti-mitotische drug paclitaxel beschreven.

Op lange termijn Live-cel Imaging om te beoordelen van cel lot in reactie op Paclitaxel

Dit protocol beschrijft een gemakkelijke en handige methode om te etiketteren en visualiseren van levende chromosomen in mitotische cellen met behulp van Histone2B-GFP BacMam 2.0 label en een draaiende schijf confocale microscopie systeem.

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Chromatin immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van genregulatie. De methode omvat echter moeilijkheden bij het verkrijgen van reproduceerbare chromatine fragmentatie door mechanische afschuiving. Hier bieden we een verbeterd protocol voor een ChIP assay met enzymatische spijsvertering.

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

Time-lapse microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van meiose in ontluikende gist. Dit protocol beschrijft een methode die celcyclussynchronisatie, time-lapse-microscopie en voorwaardelijke uitputting van een doeleiwit combineert om aan te tonen hoe de functie van een specifiek eiwit tijdens meiotische chromosoomsegregatie kan worden bestudeerd.

Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen

Leer een cell-vrij assay om chromatine-decondensatie aan het eind van mitose te bestuderen met HeLa-cellen en Xenopus laevis eicel-extract. Deze methode maakt biochemische manipulatie en isolatie van chromatine-dynamica mogelijk.

Een Cell Gratis Assay om te studeren Chromatine decondensatie aan het eind van Mitosis

Meer video's verkennen