Name: Porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van Interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Leer protocollen om de interactie tussen anaërobe bacteriën en gastheercellen te beoordelen met Porphyromonas gingivalis. Deze methode helpt onderzoekers mechanismen van microbiele overleving en internalisatie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui en Collin R. Berry bedanken. Dit werk werd ondersteund door NIH NIDCR-subsidies R01DE016124, R01DE018039 en R01DE023304 aan J.P. Lewis.
Microscopie werd uitgevoerd in de VCU Afdeling Anatomie en Neurobiologie Microscopie Faciliteit, ondersteund, deels, met financiering van NIH-NINDS Centrum kern-subsidie (5P30NS047463).

De volgende protocollen werkwijzen voor het kweken en bestuderen van de invasie door anaërobe species, blz beschrijven gingivalis; evenwel deze protocollen worden gebruikt voor een aantal anaerobe pathogenen. Hoewel HUVECs gebruikt, kan dit protocol worden gebruikt voor andere eukaryote cellen zowel immune als niet-immune. 1. Anaërobe Chamber gebruik en onderhoud Opmerking: P. gingivalis is een anaerobe gevoelig voor normale niveaus van zuurstof aangetroffen in omgevingslucht. Een gecontroleerde anaëroob milieu is essentieel voor de kweek van P. gingivalis. <ol><li> Hier, onderhouden van een aangeduid als anaërobe gemengd gas (80% N2, 10% H2, 10% CO 2) in een vinyl anaërobe kamer (figuur 1A) kunstmatige atmosfeer. Gebruik een luchtsluis (Figuur 1B) voor het overbrengen van items uit het laboratorium omgeving naar de anaërobe kamer. De luchtsluis werkt handmatig, twijs zuivering met N 2 gas vóór de invoering van de gemengde anaerobe gas. </li><li> Gebruik een waterstofsulfide verwijderingskolom (figuur 1C) voor onderhoudsvrije verwijdering van de ongewenste waterstofsulfide. Plaats een ontvochtiger binnen de kamer H 2 O door de katalysator te verwijderen en aërosolen dat de verspreiding van verontreiniging tegengegaan. Opmerking: Waterstofsulfide is een natuurlijk bijproduct van vele anaërobe bacteriën en ophoping is giftig voor bacteriën en kunnen leiden tot beschadiging van de elektronica en de levensduur van de katalysator te verminderen. </li><li> Gebruik een ventilatorkast atmosfeer van de ruimte te circuleren door een palladiumkatalysator, die zuurstof in aanwezigheid van waterstof (figuur 1D) verwijdert. Opmerking: Een recirculerende atmosfeer (HEPA) verwijdert zwevende verontreinigingen met een grootte van 0,22 pm of groter. </li><li> Cultuur anaërobe bacteriën in een 37 ° C incubator die zich binnen de anaërobekamer. Gebruik standaard aseptische technieken bij het werken in de anaërobe kamer. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Figuur 1. Anaerobe vinyl kamer en zijn componenten. (A) A vinyl anaerobe kamer volledig afgesloten van zuurstof voorziet werkruimte twee personen tegelijk (32 in x 78 in). Het bevat een incubator ingesteld op 37 ° C (opnieuw midden). (B) een luchtsluis wordt gebruikt voor de overdracht van voorwerpen uit de laboratoriummilieu de anaërobe kamer. Afgebeeld is een automatische luchtsluis bediend door een controller die kan worden geprogrammeerd om de vacuüm- en ontluchtingsprocedures nodig om een ​​anaerobe omgeving te creëren automatisch uit te voeren. (C) A waterstofsulfide verwijderingskolom biedt onderhoudsvrije hoge capaciteit verwijdering van ongewenst waterstofsulfide. (D) Twee katalysator fan dozengeplaatst in de anaerobe kamer om circuleren atmosfeer van de kamer door middel palladiumkatalysator, die in aanwezigheid van waterstof, zuurstof verwijdert. De anaërobe kamer is opgezet volgens de instructies van de fabrikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 2. Voorbereiding van anaërobe bacteriën Opmerking: P. gingivalis is aerotolerant en kunnen worden opgeslagen in aërobe omstandigheden, maar het zal niet groeien in aanwezigheid van zuurstof op een hoger niveau dan 6% 17,18. Een anaerobe kamer is noodzakelijk voor een goede kweek van P. gingivalis en andere anaërobe soorten (Figuur 1). Goede opleiding en onderwijs op anaerobe kamer gebruik is vereist voordat het werken met microanaerobes 19. <ol><li> Equilibreer alle vloeibare media en borden met de anaërobe Conditionen ten minste 12 uur vóór het experiment om resterende zuurstof te verwijderen. </li><li> Transfer P. gingivalis van -80 ° C vriezer anaërobe kamer, laat ontdooien. </li><li> Streak P. gingivalis op trypticasesoja bloed agar platen (TSA II met 5% schapen bloed). Wikkel platen in parafilm en opslag bij 37 ° C onder anaërobe incubator gedurende 4-7 dagen. </li><li> Te enten P. gingivalis in 3 ml brain hart infusie (BHI) bouillon aangevuld met hemine en menadion, een verrijkt niet-selectieve vloeibare media voor het kweken van anaerobe en veeleisende micro-organismen, met steriele loops. Opmerking: Voor de lange termijn opslag, meng bacterieculturen opgesteld BHI met glycerol of DMSO (10-20% uiteindelijke concentratie) en plaats in een -80 ° C vriezer. </li><li> Bereid een voorgerecht cultuur van P. gingivalis door een 1:10 verdunning en waardoor bacteriën groeien tot mid-log-fase. </li></ol> Opmerking: De optische dichtheid van de bacriaal suspensie wordt bepaald en de bacteriële concentratie voor elke stam te onderzoeken ingesteld. Voor P. gingivalis een suspensie bij OD 660 van 0,7 komt overeen met mid-log fase en ~ 7 x 10 8 cellen / ml. Groeiomstandigheden in het protocol hierboven beschreven zijn specifiek voor P. gingivalis en moeten worden aangepast voor andere bacteriële stammen. 3. endotheelcellen Culture Opmerking: Purchase samengevoegd primaire HUVEC plekken in basaal medium met vasculaire endotheliale groeifactoren (VEGF) bij 37 ° C in 5% CO 2 volgens de instructies van de fabrikant. <ol><li> Zaad HUVECs in T-75 flessen van 2,5 x 10 5 cellen / fles in 15 ml VEGF media. Opmerking: Controleer levensvatbaarheid via een 1: 1 verdunning met 4,0% trypan blauw. Cellen met een gecompromitteerd membraan trypaanblauw behouden, zullen gezonde cellen met intacte membranen wit verschijnen wanneer bekeken onder een binoculair lichtmicroscoop. Count 100 cellen zorgen dat meer dan 80% van de cellen levensvatbaar 20. </li><li> Vervang de media om de 2 dagen met voorverwarmde verse VEGF media tot cellen te bereiken ~ 80% confluentie. </li><li> Was de cellen eenmaal met PBS voorverwarmd. Bevrijden cellen van de T75 kolf door incubatie met 2 ml trypsine-EDTA (0,25%) gedurende 5 min gevolgd door 2 ml trypsine neutraliserende oplossing. </li><li> Verzamel gesuspendeerd HUVEC&#39;s in een 50 ml conische buis. Spoel eventuele extra cellen van T-75 kolven met PBS en overbrengen naar 50 ml conische buizen. </li><li> Centrifugeer cellen bij 200 xg gedurende 10 min. </li><li> Verwijder supernatant, schorten cel pellet in 10 ml voorverwarmde VEGF media. </li><li> Bepaal celconcentratie behulp van een hemocytometer en dergelijke cel telinrichting. </li><li> Bereken hoeveelheid celsuspensie ofwel 6-well plaat (400,000 / putje) of 12-putjesplaat toevoegen dekglaasjes (50.000 / putje). HUVECs zal klaar zijn voor experimenten de volgende dag. </li></ol> 4. Survival Assay Invasion / Interaction(Plating) Opmerking: Bij het uitvoeren van deze test bereiden twee 6-well platen van endotheelcellen gezaaid met 400.000 cellen / putje. Eén plaat wordt gebruikt om bacteriën bevestigd aan en geïnternaliseerd door gastheercellen te beoordelen. De andere plaat zal goed zijn voor intracellulaire bacteriën. De 6-well plaat maakt drievoud van twee monsters per experiment worden uitgevoerd. Voor een overzicht van dit protocol wordt verwezen naar de overleving assay stroomdiagram (figuur 2). <ol><li> Bereid anaërobe bacteriën zoals hierboven beschreven (zie punt 1) totdat ze mid-log groei (OD 660 0,5-0,7) te bereiken. </li><li> Centrifugeer bij 5000 xg bacteriën gedurende 10 min. Opmerking: Als centrifuge buiten anaërobe kamer, dragen bacteriële monsters in een goed afgesloten buis van 15 ml, wikkel de dop met parafilm om zuurstof lekkage te voorkomen. </li><li> Plaats afgedraaid P. gingivalis terug in de kamer, gooi supernatant. Was opnieuw met PBS, pellet bacteriën voordat resuspenderen in VEGF media. Suspensies bereid alle bacteriestammen worden getest bij OD 660 van 0,7 die overeenkomt met mid-log fase (~ 7 x 10 8 cellen / ml). De bacteriën zijn nu klaar voor infectie. </li><li> Transfer 6-well platen met HUVECs uit weefselkweek incubator in anaërobe kamer. Verwijder de media en was driemaal met anaërobe PBS. Voeg 2 ml VEGF anaerobe medium aan elk putje en plaats de platen bij 37 ° C in anaërobe incubator gedurende 20 minuten de temperatuur op infectie evenwicht. Opmerking: Plaat bacteriën op bloed agar platen die gebruikt worden voor de infectie zorgen homogeen zijn en niet verontreinigd na infectie. </li><li> Infect gastheercellen met bacteriën bij een multipliciteit van infectie (MOI bacteriën: host) van 100: 1. Opmerking: HUVEC cel aantal wordt bepaald door het uitvoeren van een trypan uitsluiting testen op een enkele ruim voor infectie. Bacteriële aantal cellen wordt bepaald via optische dichtheid (bijvoorbeeld OD van 0,5 = 5 x 10 8 cellen / ml). Bacterial concentratie wordt ingesteld op juiste MOI basis van HUVEC concentratie 21. </li><li> Plaats 6-well platen met besmette HUVEC in anaërobe incubator de bacteriën te interageren met gastheercellen gedurende 30 min. </li><li> Bereid saponine in BHI (1,0% w / v) in de anaërobe kamer en filtreer door een 0,2 urn filter. </li><li> Overleving van zowel aangesloten en geïnternaliseerde bacteriën. <ol><li> Verwijder platen uit de incubator, aspireren media, wast driemaal met PBS anaërobe en voeg 2 ml gefiltreerd 1,0% saponine (bereid zoals beschreven in stap 4,8). Incubeer gedurende 15 min tot lysis gastheercel mogelijk maken. </li><li> Schrapen onderkant van elk putje met celschraper. Verzamel de celmengsel uit elk putje en een 1: 1 verdunning in BHI. </li><li> Overgaan tot seriële verdunningen van het monster te maken. Afhankelijk van bacteriesoorten en concentratie, stel seriële verdunningen. Begin met 1: 100 of 1: 1000 verdunningen. </li><li> Plaat 200 ul van gewenste verdunning op bloed agarplaten. Wrap tHij platen parafilm en plaats in de anaërobe incubator bij 37 ° C. </li><li> Na zeven dagen incubatie bij 37 ° C, verwijder de platen en tel kolonievormende eenheden (CFU&#39;s) met behulp van een lichtbak handmatig kolonies te tellen. Opmerking: CFU opgesomd. Voor grotere hoeveelheden CFU&#39;s kunnen beelden worden gemaakt en software kan worden gebruikt voor de telling van CFU vergemakkelijken. </li></ol></li><li> Overleving van geïnternaliseerde bacteriën. <ol><li> Verwijder platen uit de incubator. Was driemaal met PBS anaërobe en voeg 2 ml VEGF medium aangevuld met antibiotica (300 pg / ml gentamicine en 400 ug / ml metronidazol). </li><li> Incubeer gedurende 1 uur. Zorg ervoor dat de antibiotica te testen, zodat ze 100% effectief is bij het ​​doden van de gewenste bacteriële stam en zorg ervoor dat ze niet gastheercellen 22,23 dringen. </li><li> Zuig media, voeg 2 ml van gefilterde 1,0% saponine. Incubeer gedurende 15 min tot lysis gastheercel mogelijk maken. </li><li> Schrapen onderkant van elke well met celschraper. Verzamel de cel mengsel uit elk putje en maak 1: 1 verdunning in BHI. </li><li> Maak seriële verdunningen van het monster (1: 100, 1: 1000). </li><li> Plaat 200 ul van gewenste verdunning op bloed agarplaten. Wikkel platen in parafilm en plaats in anaërobe incubator. </li><li> Na zeven dagen incubatie bij 37 ° C platen verwijderd en tellen CFU. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Figuur 2. Schematische weergave van een protocol dat wordt gebruikt voor de overleving van anaërobe bacteriën met eukaryotische cellen. Beide assays voor een totaal bacteriële overleving en de overleving van geïnternaliseerde bacteriën kunnen tegelijkertijd worden uitgevoerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 5. internalisering van bacteriën in Host CeLLS (Fluorescent Microscopy) Opmerking: P. gingivalis wordt gelabeld met 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -Carboxyfluorescein, acetoxymethylester (BCECF-AM). BCECF-AM is een niet-fluorescente membraan-permeabel kleurstof; de omzetting fluoresceïne BCECF via de werking van intracellulaire esterasen kan cellevensvatbaarheid aangeven. P. gingivalis is gelabeld met BCECF-AM kleurstof en vervolgens gebruikt om eukaryotische cellen te infecteren. Na infectie worden de cellen gefixeerd en gemerkt met DAPI en TRITC-falloïdine. De DAPI kleuring gebruikt om eukaryotische celkern vlek ook etiketteren bacteriële cel nucleus, waarbij een tegenmaatregel voor niet-levensvatbare bacteriën die niet metabolisch splitsen BCECF-AM identificatie levert. Gastheercellen worden gemarkeerd met TRITC-phalloidin, een rode kleurstof actine. <ol><li> Autoclaaf dekglaasjes. Aseptisch dekglaasjes naar 12-well plates voor het zaaien van endotheelcellen 5 x 10 4 cellen / putje. (Opgesteld dag voor experiment) </li><li&gt; Hebben endotheelcellen opgesteld op 18 mm (1,5 # dikte) ronde dekglaasjes in 12-wells platen als hierboven beschreven. </li><li> Bereid anaërobe bacteriën gekweekt tot mid-log fase (OD 660 = 0,5-0,7), zoals beschreven in paragraaf 1. </li><li> Was met anaërobe bacteriën 2x PBS met centrifugeren bij 5000 x g en de pellet suspenderen in PBS bij 5-7 x 10 8 cellen / ml. </li><li> Voeg 20 ul van 0,2 mM BCECF-AM tot 2 ml bacteriesuspensie (5-7 x 10 8 cellen / ml) tot een eindconcentratie van BCECF-AM van 2 uM. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min in het donker. </li><li> Transfer platen met endotheelcellen gezaaid op 18 mm (# 1,5 dikte) ronde dekglaasjes van weefselkweek incubator in de anaërobe kamer. Wassen met PBS en uitwisseling met anaërobe VEGF media. Let op: Controleer of HUVECs gezond zijn onder een lichtmicroscoop. HUVECs moet ~ 80% confluent dient morfologie vergelijkbaar met de fabrikanten. </li><li> Centrifuge gelabelde bacteriën op5000 xg gedurende 10 min om resterende BCECF-AM kleurstof te verwijderen. Schorten in 2 ml anaërobe VEGF media. </li><li> Infect gastheercellen met gemerkte bacteriën bij MOI van 100: 1 (bacteriën: host). </li><li> Incubeer in anaërobe kamer bij 37 ° C gedurende 30 min. </li><li> Na infectie wassen cellen met PBS driemaal en fixeer vers bereide 4,0% paraformaldehyde gedurende 10 min. Opmerking: Na de vaststelling van de cellen, kan experiment buiten de anaerobe kamer worden uitgevoerd. </li><li> Coverslips wassen met PBS driemaal. </li><li> Voeg 1 ml 0,2% Triton X-100 gedurende 10 min. </li><li> Coverslips wassen met PBS driemaal. </li><li> Voeg 50 ul van TRITC phalloidin (50 ug / ml) dekglaasjes tot 45 min. </li><li> Was coverslips drie keer, te verwijderen uit de 12-well plaat en plaats op een dia met soft-set montage medium met DAPI. Verzegeling van de zijkanten met nagellak. Opmerking: Dia&#39;s kunnen worden opgeslagen voor een paar maanden in het donker. Vermijd blootstelling aan licht van de foto&#39;s bleken te voorkomen. </li><li> Bekijk slidesmet behulp van een confocale microscoop. <ol><li> Hier, gebruik een 34 kanaals spectraal-systeem (32-kanaals array detector en twee side PMT detectoren, plus een verzonden licht detector) geconfigureerd rond een AxioObserver (omgekeerde) staan ​​met een gemotoriseerde XY podium. Het systeem heeft vijf lasers: blauw diode (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), groene diode (561 nm), rood HeNe (633 nm) en een 440 nm gepulste laser. Voorzie een Fluorescence Lifetime Imaging-systeem met 2 hybride GaAsP detectoren (voor FRET-FLIM). </li><li> Detecteren fluorescentie van DAPI en TRITC in een kanaal met behulp van een dual-band filter met golflengten van 340-380 nm en 540-560 nm en een emissie filter van 435-485 nm en 570-590 nm respectievelijk. Detecteren fluorescentie van BCECF-AM gebruik van een filter met excitatie golflengte van 440-500 nm en een emissie filter van 510-590 nm. Opmerking: Controles voor BCECF-AM moet worden gedaan op elke bacteriestam worden bestudeerd om de juiste etikettering van levende bacteriën te garanderen. Valideren eerste dat nonviable bacteriën zijn DAPI-positieve en BCECF-negatief. Tweede, ervoor te zorgen dat levende bacteriën BCECF-AM kan metaboliseren in fluoresceïne BCECF. Variabele concentraties van de bacteriën of BCECF-AM kleurstof kan getest moeten worden voor een optimale labeling. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hentges, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Anaerobic+Microflora+of+the+Human+Body%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The Anaerobic Microflora of the Human Body.</a> Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).</li>
<li>Willis, A. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillis%2C+AT+%22Anaerobic+bacteriology%3A+clinical+and+laboratory+practice%22">Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice</a>. , (2014).</li>
<li>Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anaerobic+culture+of+clinical+specimens%3A+a+14-month+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study.</a> J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).</li>
<li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outsmarting+the+host%3A+bacteria+modulating+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).</li>
<li>Mayrand, D., Holt, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+asaccharolytic+black-pigmented+Bacteroides+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species.</a> Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).</li>
<li>Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+below+the+gum+line%3A+pathogenic+mechanisms+of+Porphyromonas+gingivalis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).</li>
<li>Haffajee, A. D., Socransky, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+etiological+agents+of+destructive+periodontal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol.+2000%22%5BJournal%5D)">Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases.</a> Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).</li>
<li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+microbial+flora+associated+with+periodontal+health+and+disease+in+man.+A+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study.</a> J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).</li>
<li>Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+microbiota+of+supra-+and+subgingival+plaque+in+health+and+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).</li>
<li>Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis+as+a+potential+community+activist+for+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease.</a> J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).</li>
<li>Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+of+Porphyromonas+gingivalis%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol.+2000%22%5BJournal%5D)">Virulence factors of Porphyromonas gingivalis.</a> Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).</li>
<li>Lamont, R. J., Yilmaz, öZ. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+or+out%3A+the+invasiveness+of+oral+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol.+2000%22%5BJournal%5D)">In or out: the invasiveness of oral bacteria.</a> Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).</li>
<li>Lamont, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis+invasion+of+gingival+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells.</a> Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).</li>
<li>Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+image+analysis+of+the+association+between+Porphyromonas+gingivalis+and+gingival+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).</li>
<li>Rautemaa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Porphyromonas+gingivalis+thiol+proteinase+in+periodontal+tissues+of+chronic+periodontitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients.</a> Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).</li>
<li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity to intracellular bacteria.</a> Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).</li>
<li>Diaz, P., Rogers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+oxygen+on+the+growth+and+physiology+of+Porphyromonas+gingivalis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis.</a> Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).</li>
<li>Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+Porphyromonas+gingivalis+to+microaerophilic+conditions+involves+increased+consumption+of+formate+and+reduced+utilization+of+lactate%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate.</a> Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).</li>
<li>Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+maintaining+Clostridium+difficile+in+an+anaerobic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment.</a> J. Vis. Exp. (79), e50787(2013).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. , (2001).</li>
<li>Koch, A. L., Crandall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photometric+measurement+of+bacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Biology+Teacher%22%5BJournal%5D)">Photometric measurement of bacterial growth.</a> The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).</li>
<li>Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+single-disc+method+for+antibiotic+susceptibility+testing+of+anaerobic+bacteria+Antimicrob%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob.</a> Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).</li>
<li>Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+susceptibility+testing+by+a+standardized+single+disk+method%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method.</a> Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).</li>
<li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).</li>
<li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+endothelial+cells+induces+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis.</a> Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).</li>
<li>Naito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+genome+sequence+of+Porphyromonas+gingivalis+strain+ATCC+33277+and+genomic+comparison+with+strain+W83+revealed+extensive+genome+rearrangements+in+P.+gingivalis%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis.</a> DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).</li>
<li>Goebel, W., Kuhn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+replication+in+the+host+cell+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial replication in the host cell cytosol.</a> Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).</li>
<li>Gospodarowicz, D. III <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+Extracellular+matrix+and+control+of+proliferation+of+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells.</a> J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).</li>
<li>DeQuach, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+high+yielding+method+for+preparing+tissue+specific+extracellular+matrix+coatings+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture.</a> PloS One. 5 (9), e13039(2010).</li>
<li>Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytotoxicity+assay+utilizing+a+fluorescent+dye+that+determines+accurate+surviving+fractions+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells.</a> J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).</li>
<li>Van Veen, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+proton+motive+force+by+the+excretion+of+metal-phosphate+in+the+polyphosphate-accumulating+Acinetobacter+johnsonii+strain+210A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A.</a> J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).</li>
<li>Jackson, V. N., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics%2C+substrate%2C+and+inhibitor+specificity+of+the+monocarboxylate+%28lactate%29+transporter+of+rat+liver+cells+determined+using+the+fluorescent+intracellular+pH+indicator%2C+2%27%2C7%27-bis%28carboxyethyl%29-5%286%29-carboxyfluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein.</a> J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Porphyromonas+gingivalis+FeoB2+in+metal+uptake+and+oxidative+stress+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection.</a> Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).</li>
<li>Anaya-Bergman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis+ferrous+iron+transporter+FeoB1+influences+sensitivity+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress.</a> Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).</li>
<li>Ueshima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+gene+cloning%2C+gene+expression%2C+and+mutants+of+Dps+from+the+obligate+anaerobe+Porphyromonas+gingivalis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis.</a> Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+methods+for+determining+the+viability+of+bacteria+in+association+with+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells.</a> JoVE. (79), (2013).</li>
<li>Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+advancement+of+antifading+agents+for+fluorescence+microscopy+and+single-molecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , (2010).</li>
<li>Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevotella+intermedia+ATCC+25611+targets+host+cell+lamellipodia+in+epithelial+cell+adhesion+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion.</a> Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).</li>
<li>Sengupta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Prevotella+intermedia+strain+17+leucine-rich+repeat+domain+protein+AdpF+with+eukaryotic+cells+promotes+bacterial+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization.</a> Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).</li>
<li>Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+bacterial+invasion+and+infection%3A+contribution+to+atherosclerotic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology.</a> J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).</li>
<li>Grant, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+modulates+the+cytokine+response+of+oral+epithelium+to+periodontal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria.</a> J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).</li>
<li>Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Anaerobic+Bacteria+with+Dental+Stem+Cells%3A+An+In+Vitro+Study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study.</a> PloS One. 9 (11), e110616(2014).</li>
<li>Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+Co-Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells+and+Anaerobic+Pathogens-A+New+In+Vitro+Model+System%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System.</a> PloS One. 8 (11), e78226(2013).</li>
<li>Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+microbial+biofilm+stimulation+of+epithelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses.</a> Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectro%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Iyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AdpC+is+a+Prevotella+intermedia+17+leucine-rich+repeat+internalin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein.</a> Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Alle bovengenoemde werkwijzen kunnen worden gebruikt om specifieke assays voor de interactie van anaërobe bacteriën met eukaryotische cellen te beoordelen ontwerpen. Echter, er zijn verschillende overwegingen bij de experimenten te doen dalen. Ten eerste zijn de microbiële stammen worden gebruikt in een studie. Het is cruciaal bij de vergelijking van twee stammen zowel het overleven assay en microscopisch onderzoek dat ze op vergelijkbare groeifasen en bereiken soortgelijke celconcentraties ...

Anaërobe bacteriën koloniseren vrijwel alle oppervlakken van het menselijk lichaam. Hoewel overwegend in de flora van de darm en urogenitalis waar zuurstof concentraties laag bestaan ​​ze ook bij hoge niveaus op de huid, mond, neus en keel 1. Anaërobe bacteriën zijn een veelvoorkomende oorzaak van endogene infecties en worden vaak geïsoleerd van zieke sites. Vanwege hun veeleisende aard, anaërobe moeilijk te isoleren en cultuur. Studies met anaërobe bacteriën moet gebeuren onder strikte voorwaarden. Moderne anaërobe kweektechnieken kunnen de onderzoekers om de anaërobe instellingen die nodig zijn om veel anaërobe laboratoriumstammen of klinische isolaten 2,3 studeren na te bootsen. Pathogene anaërobe bacteriën hebben een dynamische relatie en co-evolutie met de gastheer cellen waarin zij wonen ontwikkeld. De meeste anaëroben zijn gevoelig voor doding door de gastheer immuunreactie voordat infectilende niveaus. Echter, sommige pathogene bacteriën mechanismen ontsnappen of ontwrichting van de gastheer immuunreactie ontwikkeld. Zij doen dit doel via mechanismen zoals ontwijking van immuunherkenning, neutralisatie van immuunmediatoren, verandering van celgemedieerde immuniteit, invasie van gastheercellen en wijziging van immune signalering 4. Porphyromonas gingivalis, een Gram-negatieve anaerobe betrokken bij zowel orale als extraorale ziekten, is een voorbeeld van een zeer geschikt bacterieel pathogeen kunnen veroorzaken pathogene veranderingen in de ontvangende 5-7. Zakken van biofilm plaque ontstaan ​​uit diepe spleten gevormd tussen de tanden en tandvlees mucosale weefsel anaërobe bacteriën die worden beschermd tegen zuurstof 8 haven. Deze periodontale pockets dienen als niche voor diverse anaerobe pathogenen, zoals P. gingivalis 9. P. gingivalis is een hoeksteen pathogeen dat in staat verbouwening de mondelinge microbiële gemeenschap op manieren die de ontwikkeling en progressie van parodontale aandoeningen 10 te bevorderen. Het produceert een groot aantal virulentiefactoren die actief zijn tegen een breed spectrum van gastheer- en voorziet in mechanismen voor ontwijking van afweer 11. Het kan ook invasie epitheel, endotheel, fibroblasten, en periodontale ligament cellen in vitro en in vivo 14/12 15. Door het effectief invasie van gastheercellen, P. gingivalis kunnen gastheer immuniteit te ontsnappen. Effectieve invasie van gastheercellen mogelijk maakt niet alleen de bacterie afweer van de gastheer ontsnappen, maar ook dient als reservoir voor toekomstige herinfectie en verandert de gastheercel. Studies van de moleculaire mechanismen betrokken bij adhesie en internalisatie van de bacterie door gastheercellen nodig. Onderzoek in verschillende laboratoria is gericht op het begrijpen van de moleculaire geassocieerd met internalisatie P. gingivalis door de gastheercellenalsook de mechanismen te onderdrukken en kapen de immuunrespons en overleven de vijandige gastheer afweermechanismen. Er zijn vele assays kan identificeren en karakteriseren van pathogenen die in staat binnendringende gastheercellen. In vitro studies met anaerobe pathogenen vormen vele experimentele problemen voor de onderzoeker vooral omdat het moeilijk studies die afhankelijk volumineuze instrumenten in afwezigheid van zuurstof uitgevoerd. Dit wordt verergerd door het feit dat eukaryote cellen zuurstof nodig om te groeien en moet dus apart worden bereid in weefselkweek incubator. Een manier om dergelijke obstakels te vermijden is om het onderzoek te verrichten onder atmosferische zuurstof, maar dat de groei van anaerobe bacteriën onmogelijk maken. Een andere methode zou zijn om hitte gedode bacteriën gebruiken om te infecteren en studie gastheer-cel interacties. Echter, verschillen bestaan ​​tussen de warmte gedood en levensvatbare bacteriën die de relevantie van de gastheer-pathogeen interacti verminderenon 16. Het staat centraal in levende bacteriën met ongewijzigde expressie interactie met gastheercellen te bestuderen; derhalve werkwijzen voor het kweken van P. gingivalis in een anaërobe omgeving worden gegeven. Ook zijn twee eenvoudige rendabele protocollen aangetoond voor het beoordelen van het vermogen van P. gingivalis worden geïnternaliseerd door humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC). Het eerste protocol is gebaseerd op het populaire antibioticum bescherming assay. Hoewel de test eenvoudig worden overwegingen bij het gebruik van anaerobe microorganismen gegeven. Het tweede protocol vereist het gebruik van een fluorescerende scanning microscoop te visualiseren interactie en geïnternaliseerd P. gingivalis. Elke test heeft zijn beperkingen en voordelen die zullen worden besproken zijn de onderzoeker een schets voor het bestuderen van het invasieve karakter van anaërobe bacteriën. Hoewel de huidige manuscript bestudeert P. gingivalis en HUVECs, kunnen deze protocollen worden gebruikt voor vele andere anaërobe bacteriën enzoals voor andere typen gastheercellen.

<table><tbody><tr><td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td><td>Coy Laboratory Products</td><td></td><td>Model 2000 incubator&nbsp;</td></tr><tr><td>TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td><td>BBL</td><td>221261</td><td></td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td><td>LifeLine Technology</td><td>FC-0044</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td><td>LifeLine Technology</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>TrypKit</td><td>LifeLine</td><td>LL-0013</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Riedel-de Haen</td><td>16109</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1264</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3761</td><td></td></tr><tr><td>BCECF-AM</td><td>LifeTechnologies</td><td>B1150</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Phalloidin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Circular Coverslips</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaërobe bacteriën ver overtreffen aeroben in vele menselijke niches zoals de darm, mond en vagina. Bovendien, anaërobe infecties komen vaak voor en vaak van inheemse afkomst. Het vermogen van enkele anaerobe pathogenen humane cellen binnen te dringen geeft hen aanpassingsmaatregelen aangeboren immuniteit ontsnappen alsook gastheercel gedrag moduleren. Echter, zodat de anaërobe bacteriën staan ​​tijdens experimenteel onderzoek van de gebeurtenissen kan problemen opleveren. Porphyromonas gingivalis, een Gram-negatieve anaërobe, kan binnenvallen een verscheidenheid van eukaryote niet-fagocytische cellen. Dit artikel schetst hoe succesvol de cultuur en beoordelen van het vermogen van P. gingivalis aan humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) binnendringen. Twee protocollen werden ontwikkeld: een voor bacteriën die met succes kunnen binnendringen en overleven in de gastheer, en andere bacteriën interactie met gastheercellen visualiseren meten. Deze technieken vereisen het gebruik van een AnaeRobic kamer leveren P. gingivalis met een anaërobe omgeving voor optimale groei. Het eerste protocol is gebaseerd op het antibioticum bescherming assay, die grotendeels gebruikt om de invasie van gastheercellen door bacteriën te bestuderen. Echter, het antibioticum bescherming assay beperkt; alleen intracellulaire bacteriën die gekweekt zijn na behandeling met antibiotica en gastheer cellysis worden gemeten. Om alle bacteriën interactie met gastheercellen, zowel levende en dode beoordelen, ontwikkelden we een protocol dat fluorescentie microscopie gebruikt om gastheer-pathogeen interactie te onderzoeken. Bacteriën worden fluorescent gelabeld met 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -carboxyfluorescein acetoxymethylester (BCECF-AM) en gebruikt om eukaryotische cellen te infecteren onder anaërobe omstandigheden. Na bevestiging met paraformaldehyde en permeabilisatie met 0,2% Triton X-100, worden gastheercellen gelabeld met TRITC phalloidin en DAPI naar de cel cytoskelet en de kern respectievelijk labelen. Meerdere images genomen op verschillende brandpunten (Z-stack) worden verkregen voor tijdelijke ruimtelijke visualisatie van bacteriën. Methoden in deze studie kan worden toegepast op elke landbouwgrond anaerobe en eukaryotische celtype.

Protocollen hierboven beschreven werden toegepast in de studie van gastheer-pathogeen interactie tussen P. gingivalis en endotheelcellen. P. gingivalis W83 en P. gingivalis V3150 die een deletie van PG0228 werden gebruikt in de studie. De PG0228 is voorspeld een eiwit dat de niveaus van RNA en eiwitten kunnen veranderen, die uiteindelijk kunnen beïnvloeden interactie van P. coderen gingivalis met gastheercellen. Om het effect van PG0228 op P. onderzoeken gingival...

Dit artikel presenteert twee protocollen: een om anaërobe bacteriën te meten die succesvol kunnen binnendringen en overleven in de gastheer, en de andere om anaërobe bacteriën te visualiseren die interageren met gastheercellen. Dit onderzoek kan worden toegepast op elke cultiveerbare anaëroob en elk type eukaryotische cel.

Porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van Interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Het algemene doel van deze video is om protocollen te demonstreren voor het beoordelen van de interactie tussen anaerobe bacteriën en gastheercellen. De condities die worden gebruikt om gastheercellen te kweken zijn toxisch voor anaerobe bacteriën en vice versa. Dit vormt een uitdaging bij het bestuderen van hun interacties, waardoor condities die optimaal zijn voor beide partijen moeten worden gerealiseerd zodat zij metabolisch actief blijven tijdens de studieperiode.Dergelijke omstandigheden zullen het scenario van gastheer-pathogeeninteractie zoals dat in vivo voorkomt, nauwkeuriger weerspiegelen. De hier gepresenteerde methode zal helpen bij het beantwoorden van vragen over de mechanismen die betrokken zijn bij het overleven van microben, evenals de binding en internalisatie van anaerobe bacteriële cellen tijdens een infectie. Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met deze methode moeite hebben, omdat het werken met anaerobe bacteriën kennis vereist van een anaerobe kamer en goede aseptische technieken.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen waarbij gebruik wordt gemaakt van een anaerobe kamer moeilijk aan te leren zijn. Daarnaast is voorzichtigheid geboden bij het experimenteren met anaerobe kamers voor de kweek en experimenten met Porphyromonas gingivalis. Een vinyl anaerobe kamer wordt onderhouden met een kunstmatige atmosfeer bestaande uit 80% stikstof, 10% waterstof en 10% kooldioxide. Plaats 30 bloedagarplaten, 500 milliliters PBS en 30 milliliters vascular endothelial growth factor of VEGF-medium in de anaerobe kamer.Equilibreer de reagentia 24 uur van tevoren. Zaai 4 × 10⁵ menselijke navelstrengader-endotheelcellen (HUVECs) per well in six-well platen in VEGF-medium en laat deze een nacht in de celkweekincubator staan voor hechting. Bereid Porphyromonas gingivalis-culturen voor in brain heart infusion- of BHI-medium zoals beschreven in de bijbehorende tekst en laat de culturen de logfase bereiken, waarbij de optische dichtheid van de cultuur bij 660 nanometer tussen 0,5 en 0,7 ligt. Transfer de bacteriën naar een 15 milliliter buis en wikkel een stuk Parafilm om de dop om anaerobe afsluiting te waarborgen.Centrifugeer de bacteriën vervolgens in de anaerobe kamer bij 5,000 ×g gedurende 10 minuten. Was de gepelletteerde bacteriën met anaerobe PBS en centrifugeer deze opnieuw bij 5,000 ×g gedurende 10 minuten. Reese brengt de bacteriën over in VEGF-medium om de HU X te infecteren via por ominous transfer.Verplaats de zes-wellplaten van de incubator naar de anaerobe kamer, aspireer het medium uit de testwells en was deze drie keer met anaerobe PBS. Bepaal het celgetal van één representatieve well met een trypan blue-uitsluitingsassay. Voeg vervolgens twee milliliter anaerobe VEGF-medium per well toe en plaats de platen gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius in de anaerobe incubator. Bepaal ter equilibratie de optische dichtheid van de bacteriën en resus.Suspendeer deze in een passend volume VEGF-medium om cellen te infecteren met een multipliciteit van infectie van 100 (verhouding bacteriën tot cellen). Voeg de bacteriële suspensie toe aan de cellen en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in de anaerobe kamer voor infectie en daaropvolgende cellysis. Bereid een saponine-oplossing van 1% gewicht per volume in BHI-medium en filtreer deze door een 0,2 micron filter om de interacties tussen bacteriën en gastheercellen te bestuderen.Haal de zes-wells plaat uit de incubator en aspireer het infectiemedium. Was drie keer met anaeroob PBS. Voeg vervolgens twee milliliters saponine-oplossing toe aan elke well en incubeer gedurende 15 minuten om cellyse mogelijk te maken.Schraap vervolgens de cellen van de bodem van de well en verdun het cell czego-lysaat één op één met BHI-medium. Maak daarna seriële verdunningen beginnend bij één op 100 en plaat 200 µL van een geschikte verdunning op bloedagarplaten. Wikkel de platen in Parafilm en incubeer ze gedurende zeven dagen in een anaerobe incubator bij 37 °C om kolonievorming mogelijk te maken.Tel vervolgens met behulp van een lichtbak de colony-forming units of CFU's op elke plaat na infectie van HU E-cellen. Was de cellen drie keer met anaëroob PBS. Voeg daarna twee milliliter VEGF-medium, aangevuld met vooraf geoptimaliseerde concentraties antibiotica, toe aan de HU E-cellen.Incubeer de cellen gedurende één uur, aspireer het medium en voeg twee milliliters van een 1% saponin-oplossing in BHI toe aan elke well; incubeer gedurende 15 minuten. Schraap vervolgens de gelyseerde cellen af en verzamel het lysaat in een centrifugebuis. Verdun het lysaat één-op-één met BHI-medium en bereid daarna seriële verdunningen voor beginnend bij één-op-100.Pipetteer 200 microliters van de geschikte concentraties op bloedagarplaten. Laat de bacteriën zeven dagen groeien in een anaerobe kamer en tel vervolgens de kolonies.De beschreven uitplaatmethode houdt alleen rekening met de levende bacteriën die interactie hebben met de cellen. Om dit nadeel te overwinnen, maken we gebruik van microscopie, waarbij zowel levende als dode bacteriën in associatie met de cel kunnen worden gevisualiseerd om geïnternaliseerde bacteriën zichtbaar te maken. Breng vervolgens aseptisch de autoclaaf over.De glazen dekglasjes in elke put van een 12-wells plaat, vijf maal 10⁴ per put op het dekglas. Schuif en incubeer gedurende 24 uur om de bacteriën te labelen, centrifugeer, verwijder het supernatant, was de bacteriën en resuspendeer het pellet met anaëroob PBS, centrifugeer opnieuw en herhaal de wasstap. Voeg 20 µL van 0,2 mM BCECF-AM toe aan twee mL anaëroob PBS dat vijf tot zeven maal 10⁸ bevat.Incubeer de bacteriën per milliliter 30 minuten in het donker bij 37 °C. De fluorescerende kleurstof die we gebruiken kan de meeste anaerobe bacteriën kleuren, waardoor geen andere reagentia, zoals een specifiek antilichaam, nodig zijn. Centrifugeer de bacteriële suspensie 10 minuten bij 5.000 ×g om het ongebonden labelreagens te verwijderen en resuspendeer de bacteriën in VEGF-medium.Infecteer vervolgens de UIC-cellen met een ratio van 100 bacteriën per cel en incubeer dit gedurende 30 minuten bij 37 °C. Verwijder na incubatie het infectiemedium en was de cellen drie keer met PBS. Voeg vervolgens 4% paraldehyde toe en incubeer dit gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Om de cellen in de anaerobe kamer te fixeren, worden de gefixeerde cellen uit de kamer verwijderd en worden de dekglasjes vervolgens 3 keer gewassen met PBS. Incubeer de dekglasjes 10 minuten in 1 ml 0,2% Triton X-100 om de cellen te permeabiliseren. Was de dekglasjes daarna opnieuw 3 keer met PBS. Voeg 50 µL TRITC-phalloidine (50 µg/ml) toe aan elk dekglasje en incubeer dit 45 minuten bij kamertemperatuur om het cellulair oligomeer actine te kleuren.Was na incubatie het dekglas 3 keer met PBS. Plaats het dekglas omgekeerd op een objectglas met een zachte montagevloeistof die 1 µg/mL DAPI bevat voor kernkleuring. Seal vervolgens de rand van het dekglas met nagellak en observeer de interactie van de anaerobe bacterie onder een confocale microscoop.Poreuze gingiva met uve wordt in deze resultaten getoond. Seriële verdunning van de cellysaat, bevattende celgebonden of geïnternaliseerde bacteriën tot 100 keer, leverde een telbaar aantal CFU's op bloedagarplaten op. Zeven dagen na incubatie wordt hier de vergelijking getoond van de CFU-opbrengst op agarplaten tussen infecties met wildtype porus vallis W 83 en deletiemutant V 315 infecties.De mutatie beïnvloedt het vermogen van de bacterie om te infecteren. De hier getoonde VE is een grafische weergave van de bacteriële kolonies verkregen uit geïnfecteerde cellen. Wanneer de interactie werd beoordeeld, werden er minder mutante bacteriën teruggewonnen uit geïnfecteerde cellen in vergelijking met de wildtype-stam.De resultaten verkregen na het doden van de extracellulaire bacteriën door antibioticabehandeling worden weergegeven in de rechterkolommen. Opnieuw was de mutante stam inefficiënt in het binnendringen van levende uve-cellen. Bacteriën worden waargenomen na labeling met BCE CFAM.Aanvullende kleuring van de actinefilamenten en de celkern is respectievelijk zichtbaar in rode en blauwe fluorescentie. Zodra men deze technieken beheerst, kan elke methode in zes uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de bacteriën onder anaerobe omstandigheden moeten worden gehouden en dat alle media en benodigdheden tot 24 uur voor het experiment in de anaerobe kamer moeten worden geëquilibreerd.Vergeet niet dat het werken met anaerobe pathogenen extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, het wassen van de handen en het gebruik van aseptische technieken, altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure. Deze methode kan inzicht bieden in predentale pathogenen. De methode kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals aspiratie, pneumonie, intra-abdominale infecties, gynaecologische infecties en vele andere anaerobe infecties die op verschillende plaatsen in het menselijk lichaam voorkomen.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot onze medicamenteuze therapie voor diverse anaerobe pathogenen, omdat remmende maatregelen eenvoudig aan het protocol kunnen worden toegevoegd en de internalisatie direct na de behandeling kan worden gemeten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe anaerobe bacteriën gekweekt kunnen worden en hoe hun vermogen om te interageren met gastheercellen kan worden beoordeeld.

porphyromonas-gingivalis-as-model-organism-for-assessing-interaction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates an in vitro gut host–microbe model to study bacterial viability. A co-culture of Caco-2 and HT29-MTX cells is incubated with bacteria pre-treated under simulated digestive conditions. Epithelial barrier integrity is assessed using transepithelial electrical resistance, and fractions from the medium, solubilized...

In Vitro Gut Model to Assess Bacterial Adhesion and Internalization

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

Source: Alshehri, M. et. al., Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates a co-culture model using multi-species oral biofilms and human oral epithelium. It highlights epithelial immune activation and enables the downstream analysis of host-pathogen interaction.

A Transwell Tissue Model for Studying Interactions Between Human Oral Biofilms and Epithelium

This video demonstrates a technique for assessing the ability of Porphyromonas gingivalis, an anaerobic pathogenic bacterium, to adhere to and invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). After infecting the host cells with the bacteria, the host cells are lysed to release both adhered and internalized bacteria. When the lysate is plated in an appropriate medium, the presence of colonies indicates successful bacteria-host cell interactions.

A Bacterial Infection Assay for Studying Anaerobic Bacteria-Host Cell Interactions

In this video, we demonstrate a procedure to visualize internalized Porphyromonas gingivalis, an anaerobic pathogenic bacterium, within human endothelial cells using confocal microscopy. The bacteria are stained with a fluorescent dye while the host endothelial cell actin cytoskeleton is labeled with a different fluorescent dye. The internalized Porphyromonas gingivalis inside endothelial cells are visualized using confocal microscopy.

Visualization of Internalized Anaerobic Bacteria within Host Endothelial Cells

In this video, we demonstrate an assay to assess the survival of Porphyromonas gingivalis inside human endothelial cells. The measure of survival and growth of internalized Porphyromonas gingivalis is evaluated by the number of colonies on the blood agar plate.

Assessing Internalized Porphyromonas gingivalis in Host Endothelial Cells

Diermodellen hebben bewezen waardevolle instrumenten definiëren gastheer en pathogeen specifieke mechanismen die bijdragen aan de ontwikkeling van chronische ontsteking. Hier beschrijven we een muismodel van orale infectie met het humaan pathogeen Porphyromonas gingivalis en detail methoden om de progressie van inflammatie lokale en systemische plaatsen.

Een muismodel voor pathogenen geïnduceerde Chronische ontsteking op lokale en systemische sites

Gut host-microbe interacties werden geschat aan de hand van een nieuwe benadering van het combineren van een synthetische mondelinge Gemeenschap, in vitro gastro-intestinale spijsvertering en een model van het epitheel van de dunne darm. Presenteren we een methode die aangepast worden kan voor de beoordeling van de cel invasie van ziekteverwekkers en multispecifieke biofilms, of zelfs om te testen op het overlevingsvermogen van probiotische formuleringen.

Beoordelen van de levensvatbaarheid van een synthetische bacteriële Consortium op de In Vitro -Interface van het Gut-Host-microbe

Het huidige protocol schetst de toepassing van organotypische weefselmodellen voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties in vitro. Concreet maakt het beschreven modelsysteem gebruik van een meerlagig oraal epitheel dat wordt blootgesteld aan micro-organismen geassocieerd met biofilms (tandplak) in de context van mondgezondheid versus ziekte.

Organotypische weefselmodelsystemen voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties in vitro

We beschrijven een protocol om de belangrijkste taken van gastheer signaalmoleculen in lytische replicatie van een model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68) te identificeren. Gebruik te maken van genetisch gemodificeerde muizenstammen en embryonale fibroblasten voor γHV68 lytische replicatie, het protocol maakt het mogelijk zowel de fenotypische karakterisatie en moleculaire ondervraging van virus-gastheer interacties in virale lytische replicatie.

Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Leer protocollen om de interactie tussen anaërobe bacteriën en gastheercellen te beoordelen met Porphyromonas gingivalis. Deze methode helpt onderzoekers mechanismen van microbiele overleving en internalisatie te bestuderen.

Porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van Interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen

Meer video's verkennen