Name: Water in olie emulsies: Een nieuw systeem voor het samenstellen van water-oplosbare-Chlorophyll bindende eiwitten met Pigmenten Hydrofobe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Leer een water-in-olie emulsie methode voor het assembleren van wateroplosbare chlorofyl-bindende eiwitten met hydrofobe pigmenten. Deze techniek maakt gedetailleerd onderzoek naar chlorofyl-eiwit interacties mogelijk zonder tagging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DN erkent de steun van EU FP7-projecten PEPDIODE (GA 256.672) en REGPOT-2012-2013-1 (GA 316.157), en een persoonlijke onderzoeksbeurs (nr 268/10) van het Israël Science Foundation. Wij danken Prof. Shmuel Rubinstein, School of Engineering and Applied Sciences, Universiteit van Harvard, Cambridge MA, Verenigde Staten voor het nemen van de confocale microscopie beelden.

1. Voorbereiding Chl a Stock Solutions <ol><li> Kritische stap: Voer alle stappen van chlorofyl voorbereiding in een chemische kap, onder groen licht (520 nm) of in het donker om photodamage een minimum te beperken. Voeg altijd stikstof of argon voor het bevriezen van de pigmenten voor opslag. Zorg ervoor dat alle oplosmiddelen zijn analytische kwaliteit. </li><li> Weeg ongeveer 5 mg gelyofiliseerde Spirulina platensis cellen of andere cellen die slechts cyanobacterie Chl een in thylakoïdmembranen doppen en met een mortier en stamper. </li><li> Laad gebroken cellen op een glazen kolom en was met ongeveer 50-100 ml 100% aceton om carotenoïden te verwijderen. Gooi de geëlueerde oranje / groene fractie. Opmerking: Als de oranje fractie niet wordt geëlueerd met 100 ml aceton blijven de cellen te wassen met aceton tot de groene fractie begint te elueren. </li><li> Exchange aceton met 100% methanol en laat de groene fractie die een Chl. Het volume geëlueerd fraction kan variëren tussen 50-100 ml. In het begin, de geëlueerde fractie een donkergroene kleur, die verandert in lichtgroen eind elutie. Wanneer de kleur geëlueerde fractie verandert in lichtgroen stopt de elutie. </li><li> Damp de methanol met een rotatieverdamper totdat het extract volledig droog. Heeft warmte niet van toepassing zijn op de oplossing; waarborgen dat de verdamper waterbad temperatuur niet boven 30 ° C. Opmerking: De tijd van verdamping is afhankelijk van de hoeveelheid methanol fractie verdampt en variabel tussen 10-60 min. Het is belangrijk om het extract drogen. </li><li> Lossen de pigmenten van de droge stof in een klein volume diethylether (ongeveer 5-10 ml) en gefiltreerd door watten. Zorg ervoor dat de pigmenten volledig voordat filtering worden opgelost in ether. </li><li> Damp de diethylether totdat de pigmenten zijn volledig droog (10-30 min). Opmerking: De droge pigmenten kan worden gespoeld met en onder stikstof of argon gehouden op -20 ° C, in het donker totdat zij worden verwerkt. </li><li> Los de droge pigmenten in het kleinst mogelijke volume van 100% methanol (ongeveer 1 ml), zelfs indien niet alles volledig is gesuspendeerd. Voeg 4 ml aceton aan de oplossing en veeg het glas voorzichtig om de pigmenten volledig op te lossen. </li><li> Met een Pasteur-pipet, plaatst het monster voorzichtig op een kolom van DEAE SEPHAROSE geëquilibreerd in 100% aceton. </li><li> Elueer carotenoïden (een oranje-gele band) met 100% aceton. Dan, elueren Chl een (groene band) met 3: 1 v / v aceton / methanol mengsel. Opmerking: Het volume aceton en aceton / methanolmengsel is ongeveer gelijk aan de hoeveelheid DEAE SEPHAROSE geladen op de kolom. </li><li> Verifiëren Chl een zuiverheid dunnelaagchromatografie onder toepassing van een 68: 25: 5: 2 dichloormethaan / n-hexaan / isopropanol / methanol (v / v) mengsel als elutiemiddel 17. </li><li> Damp het oplosmiddel met een rotatieverdamper totdat de Chl een volledig droog (10-60 min). Opmerking: De droge Chl a kan worden gespoeld met stikstof of argon en onder argonatmosfeer opgeslagen bij -20 ° C in het donker. </li><li> Bereid Chl een voorraadoplossing door het opnieuw oplossen van het droge Chl een in 2-4 ml 100% ethanol. Noot: De extinctiecoëfficiënt van Chl een bij 663 nm 74.400 cm -1 -1 M (83,3 cm -1 (mg / ml) -1) in ethanol. Een typische stockoplossing moet een OD van 1860 overeenkomend met een concentratie van 25 mM (23 mg / ml) zijn. Toevoegen van 20 ui van deze voorraad tot een emulsie die 5 ml organische fase, en 1 mg WSCP in 1 ml waterige fase resulteert in een mengsel met 10-voudige molaire overmaat van Chl a vs. WSCP. </li></ol> 2. Voorbereiden Organische fase van de emulsie Opmerking: De organische fase van de emulsie bestaat uit minerale olie die 4,5% (v / v) Span 80 en 0,4% (v / v) Tween 80. <ol><li> Weeg in een 50 ml buis 0,2 g Tween 80, 1,8 g Span 80 en 38 g minerale olie. Meng goed alle componenten en afkoelen op ijs. Opmerking: De organische fase kan in 4 ° C worden bewaard tot een week. </li></ol> 3. bereiding van de waterige fase van de emulsie Opmerking: De waterfase van de emulsie kan zijn samengesteld uit ofwel gezuiverd WSCP of ruwe extract van bacteriën tot overexpressie WSCP. <ol><li> Het voorbereiden van een waterige fase die gezuiverde WSCP. <ol><li> Kweek E. coli BL21 bacteriën bevattende WSCP plasmide 12 in 1 liter LB-medium bij 37 ° C tot OD van 0,3-0,6. </li><li> Induceren eiwitexpressie door toevoeging van 1 mM IPTG. Na inductie bacteriën groeien bij 30 ° C gedurende 12-16 uur. </li><li> Oogst bacteriën door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Los de pellet in bindingsbuffer en ultrasone trillingen op ijs (30 sec op 15 sec off, vijf keer). Gebruik 10 ml buffer voor de pellet verkregen door centrifugeren van 250 mlLB-medium met overexpressie van het eiwit. Opmerking: Afhankelijk van de zuiveringswerkwijze kan het bindende buffer samengesteld uit 100 mM fosfaatbuffer, pH 7,2 of 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA. </li><li> Spin down het cellysaat bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Zuiver WSCP door affiniteitschromatografie. Afhankelijk van het label gefuseerd aan WSCP, zuiveren recombinante eiwitten onder toepassing van de geschikte commercieel verkrijgbare affiniteitschromatografie voor eiwitzuivering volgende instructies van de fabrikant. </li><li> Voor emulsiebereiding Gebruik gezuiverd WSCP in 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,8. Zorg ervoor dat de uiteindelijke eiwit bedrag dat wordt gebruikt voor de oplossing is 0,5-1,0 mg per 1 ml buffer. </li></ol></li><li> Het voorbereiden van een waterige fase die ruwe bacteriële lysaat met WSCP. <ol><li> Kweek E. coli BL21 cellen bevattende plasmide dat WSCP in 250 ml LB-medium bij 37 ° C tot OD 0,3-0,6. </li><li> Induceren eiwit expressie met1 mM IPTG en groei van bacteriën overnacht bij 30 ° C. </li><li> Oogst bacteriecellen door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Los het pellet in 1-2 ml 50 mM natriumfosfaatbuffer pH 7,8, ultrasone trillingen (30 sec op, 15 seconden af, drie keer) en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Bereid de waterfase van de emulsie door mengen 0,125 ml supernatant met 0,875 ml van 50 mM natriumfosfaatbuffer pH 7,8. </li></ol></li></ol> 4. Montage van WSCP met Chl een in Emulsion <ol><li> Transfer 5 ml olie-oppervlakteactieve mengsel in een glazen flesje en afkoelen op ijs. Voordat pipetteren, controleren of alle componenten van de organische fase grondig gemengd en er geen fasescheiding tussen oppervlakteactieve stoffen en minerale olie. </li><li> Voeg 1 ml ijskoude waterige fase bereid zoals in hoofdstuk 3-5 ml organische fase. </li><li> Meng beide fasen met een tissue homogenisator gedurende 2 minuten bij 9500 rpm op ijs.</li><li> Kritische stap: Uit deze fase op, voeren alle verdere stappen onder groen licht (520 nm) om photodamage een minimum te beperken. Voeg 20 ul van 25 mM Chl een voorraad-oplossing (zie paragraaf 1.13) aan de emulsie. Verspreiden door de knop en het omkeren van de glazen flacon. Zorg ervoor dat de Chl gelijkmatig wordt verdeeld in de emulsie. </li><li> Incubeer de emulsie gedurende 1-2 uur op ijs in het donker. </li><li> Om breken de emulsie en afzonderlijke druppeltjes van de organische fase overdracht van de emulsie 1,5 ml plastic buizen en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Als de assemblage succesvol is, moet de onderste waterfase een groene kleur hebben. </li><li> Gooi de bovenste oliefase en voeg 1 ml van minerale olie. Meng goed de minerale olie met het ingehulde emulsie door vortex of door het wegknippen van de buis grondig. Spin down het monster bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap tot een heldere meniscus het scheiden van de waterige en mijnwerkeral oliefase, zonder enige intermediaire emulsie wordt verkregen. </li><li> Voer deze stap in een chemische kap. Nadat de waterige en oliehoudende fasen duidelijk gescheiden, mineraal- olie en voeg 1 ml met water verzadigde diethylether. Vortex en spin neer het monster bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap twee keer. </li><li> Na de tweede centrifugeren, verwijder de diethylether en laat de buizen geopend voor 5-20 min in de kap. </li><li> Tenslotte plaatst de waterige fase die het WSCP / Chl complex op een ontzoutingskolom en elueer met buffer geschikt voor verdere experimenten. Opmerking: Het eiwit is stabiel in Tris buffers fosfaten in een breed pH (6,0-7,5). Het monster kan worden opgeslagen bij 4 ° C beschermd tegen licht maximaal een maand. </li></ol>

<ol><li>Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+photosynthesis+and+phototrophy+illuminated%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated.</a> Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).</li>
<li>Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+the+difference+in+absorbance+spectra+for+the+FMO+antenna+protein+from+various+green+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth.+Res%22%5BJournal%5D)">The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria.</a> Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).</li>
<li>Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+native+and+refolded+peridinin-chlorophyll-proteins+from+dinoflagellates%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).</li>
<li>Renger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+soluble+chlorophyll+binding+protein+of+higher+plants%3A+a+most+suitable+model+system+for+basic+analyses+of+pigment-pigment+and+pigment-protein+interactions+in+chlorophyll+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes.</a> J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).</li>
<li>Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+in+Brassicaceae+plants+is+a+stress-induced+chlorophyll-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein.</a> Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).</li>
<li>Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+%28WSCP%29+of+Arabidopsis+is+expressed+in+the+gynoecium+and+developing+silique%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique.</a> Planta. 236, 251-259 (2012).</li>
<li>Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+water+soluble+chlorophyll-binding+protein+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants.</a> J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).</li>
<li>Horigome, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+and+photoprotective+function+of+water-soluble+chlorophyll-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).</li>
<li>Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Role+of+Water-Soluble+Chlorophyll+Proteins+in+the+Transitory+Storage+of+Chorophyllide%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide.</a> Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).</li>
<li>Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll+protein%2C+a+putative+carrier+of+chlorophyll+molecules+in+cauliflower%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower.</a> J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).</li>
<li>Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+water-soluble+chlorophyll+protein+from+Brassica+oleracea+var.+Botrys+binds+various+chlorophyll+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives.</a> Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).</li>
<li>Takahashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+characterization+and+analysis+of+the+intracellular+localization+of+a+water-soluble+Chl-binding+protein+from+Brussels+sprouts+%28Brassica+oleracea+var.+gemmifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera).</a> Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).</li>
<li>Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll-binding+protein+from+Japanese+wild+radish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish.</a> J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).</li>
<li>Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+is+involved+in+herbivore+resistance+activation+during+greening+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).</li>
<li>Hughes, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magneto-optic+spectroscopy+of+a+protein+tetramer+binding+two+exciton-coupled+chlorophylls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).</li>
<li>Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+water-soluble+chlorophyll-binding+proteins+with+native+hydrophobic+chlorophylls+in+water-in-oil+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions.</a> BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).</li>
<li>Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stereospecific+interaction+between+chlorophylls+and+chlorophyllase.+Possible+implication+for+chlorophyll+biosynthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation.</a> J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).</li>
<li>Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+properties+and+a+possible+function+of+a+water-soluble+chlorophyll+a%2Fb-protein+from+brussels+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts.</a> Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).</li>
<li>Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+water-soluble+chlorophyll-proteins+from+Lepidium+virginicum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum.</a> Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Ons doel was om een ​​nieuw algemeen stelsel samenstel van in water oplosbare chlorofyl-bindende eiwitten met hydrofobe pigmenten ontwikkelen. Hier wordt aangetoond dat de nieuwe reconstructie op basis van W / O-emulsie is een algemene benadering bewezen te werken voor de montage WSCP apoproteïnen van spruitjes, bloemkool, Japanse mierikswortel en Virginia pepperweed recombinant tot expressie gebracht in E. coli. Hier resultaten gepresenteerd van reconstitutie van 1 mg WSCP met 10-voudige molaire overmaat van <...

Hydrofobe pigmenten zoals chlorofyl (Chls), bacteriochlorofylen (BChls) en carotenoïden zijn de primaire co-factoren in fotosynthetische reactie centra en lichte harvesting eiwitten die elektronentransport, en licht energie op te vangen en de overdracht uit te voeren. Het reactiemengsel centra en de meeste van de Chl-bindende light harvesting complexen transmembraan eiwitten. De Fenna-Matthews-Olson (FMO) eiwit van niet-oxygenic fotosynthetische groene zwavel bacteriën 1,2, en de peridinin-Chl eiwit (PCP) van dinoflagellaten 3 zijn uitzonderlijke voorbeelden van water oplosbare licht harvesting eiwitten. De in water oplosbare chlorofyl bindende eiwitten (WSCPs) van Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae en Amaranthaceae installaties 4, 5 zijn een uniek voorbeeld, maar in tegenstelling tot FMO en PCP, deze zijn niet betrokken in light harvesting of in een van de primaire fotosynthetische reactie , en hun precieze physiological functies zijn nog onduidelijk 5-8. Hun hoge Chl-bindingsaffiniteit hebben geleid tot een voorgestelde functie als tijdelijke dragers van Chls Chl en derivaten 9,10. Als alternatief werd de hypothese dat WSCP speelt een rol in het wegvangen Chls in beschadigde cellen en beschermt tegen Chl-geïnduceerde oxidatieve schade 7,11-13. Recenter werd gesuggereerd dat WSCP functioneert als een proteaseremmer en speelt een rol bij herbivore weerstand en reguleert celdood bij bloemontwikkeling 14. WSCPs worden onderverdeeld in twee hoofdklassen volgens hun fotofysische eigenschappen. De eerste klasse (klasse I, bijv. Uit Chenopodium album) kan photoconversion ondergaan bij belichting. II WSCPs van Brassica planten, die niet photoconversion 5,10 ondergaan, worden verder onderverdeeld in klasse IIa (bijv., Uit Brassica oleracea, Raphanus sativus) en IIb (bijv., Van Lepidium virginicum </em&gt;). De structuur van de klasse IIb WSCP van Lepidium virginicum werd opgelost door röntgenkristallografie bij 2,0 Å resolutie 8. Het openbaart een symmetrische homotetrameer waarin het eiwit subeenheden vormen een hydrofobe kern. Elke subeenheid bindt één Chl die resulteert in een strakke regeling van vier dicht opeengepakte Chls binnen core.This eenvoudige all Chl opstelling maakt WSCPs een nuttig model voor het bestuderen binding en assemblage van Chl-eiwitcomplexen, en de effecten van aangrenzende Chls en eiwit omgevingen op de spectrale en elektronische eigenschappen van individuele Chls. Bovendien kan het sjablonen voor het construeren van kunstmatige Chl-bindende eiwitten die kunnen worden gebruikt voor lichte oogsten modules in kunstmatige fotosynthetische nicatieapparatuur. Rigoureuze studies van natief WSCPs niet haalbaar omdat de complexen gezuiverd uit planten een heterogeen mengsel van tetrameren met verschillende combinaties van een Chl bevatten altijden Chl b 9. Aldus wordt een werkwijze voor het assembleren van recombinant tot expressie WSCPs met Chls in vitro vereist. Dit wordt uitgedaagd door de verwaarloosbare wateroplosbaarheid van Chls waardoor het onmogelijk om het complex in vitro assembleren door eenvoudig mengen van het wateroplosbare apoproteins met pigmenten in waterige oplossingen. In vitro assemblage door mengen van de apoproteïnen met thylakoïdmembranen 15 werd aangetoond, maar deze methode wordt beperkt tot de natieve Chls in de thylakoiden. Schmidt et al. rapporteerde over het monteren van een aantal Chl en BChl derivaten met WSCP van bloemkool (CaWSCP) door recombinant expressie brengen van een histidine-tag eiwit in E. coli immobiliseren deze op een Ni-affiniteitskolom en invoering Chl derivaten opgelost in 11 detergentia. Succesvol reconstitutie van recombinant WSCPs van A. thaliana 6, en spruitjes (BoWSCP), Japans wilde radijs (RshWSCP) eend Virginia pepperweed (LvWSCP) op een dergelijke manier werden ook gemeld. Hier presenteren we een nieuwe, algemene, eenvoudige werkwijze voor het assembleren Chls met WSCP die geen tagging vereist of immobiliseren van de eiwitten. Het berust op het bereiden van emulsies van de waterige oplossingen van de wateroplosbare apoproteïnen in minerale olie. De eiwitten worden aldus ingekapseld in water-in-olie (W / O) microdruppeltjes met zeer hoog oppervlak volumeverhouding 16. De hydrofobe cofactoren worden vervolgens opgelost in de olie en worden gemakkelijk geïntroduceerd in de druppeltjes van de oliefase. We rapporteren volgens de werkwijze voor het samenstellen van verschillende varianten van WSCP apoproteïnen recombinant tot expressie gebracht in E. coli met Chl a. We tonen het samenstel uit ruw lysaat van WSCP overexpressie bacteriën die kunnen worden gebruikt als een screening voor de ontwikkeling van nieuwe Chl eiwitten.

<table><tbody><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Span80</td><td>Sigma</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges</td><td>Bio Rad</td><td>10011164</td><td>Affiniteitschromatografie voor WSCP-zuivering met native sequentie.</td></tr><tr><td>His Trap HF column</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5248-02</td><td>Affiniteitschromatografie voor WSCP-zuivering met His-tag</td></tr><tr><td>DEAE Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-0709-01</td><td>Chromatografiemedium voor chlorophyll-zuivering</td></tr></tbody></table>

water in olie emulsies: een nieuw systeem voor het samenstellen van water-oplosbare-chlorophyll bindende eiwitten met pigmenten hydrofobe

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorofyl (Chls) en bacteriochlorofylen (BChls) zijn de primaire co-factoren die fotosynthetische licht oogsten en elektron transport uit te voeren. Hun functionaliteit kritisch afhankelijk van hun specifieke organisatie in grote en ingewikkelde multisubunit transmembraaneiwit complexen. Om te begrijpen op moleculair niveau hoe deze complexen vergemakkelijken zonne-energie conversie, is het essentieel om eiwit-pigment en pigment pigment-interacties en hun effect op opgewonden dynamiek begrijpen. Een manier van het verkrijgen van een dergelijk begrip is door de aanleg en het bestuderen van complexen van Chls met eenvoudige water oplosbare recombinante eiwitten. Echter, waarin de lipofiele Chls en BChls in water oplosbare eiwitten is moeilijk. Bovendien is er geen algemene methode, die kan worden gebruikt voor montage van in water oplosbare eiwitten met hydrofobe pigmenten. Hier tonen we een eenvoudige en high throughput systeem op basis van water-in-olie emulsies, die mogelijk maakt assembly van in water oplosbare eiwitten met hydrofobe Chls. De nieuwe werkwijze werd gevalideerd door het samenvoegen van recombinant versies van de in water oplosbare chlorofyl bindingeiwit Brassicaceae planten (WSCP) met een Chl. We tonen de succesvolle montage van Chl een met behulp van ruwe lysaten van WSCP uitdrukken E. coli cellen, die kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen van een genetische screen voor nieuwe wateroplosbare Chl-bindende eiwitten en voor studies van Chl-eiwit interacties en assemblageprocessen.

Recombinante WSCP apoproteins werden geassembleerd met Chl in een W / O-emulsies volgens de in de vorige paragraaf beschreven protocol. Het protocol werd uitgevoerd met behulp waterfasen dat hetzij zuiver WSCPs of lysaten E.coli overexpressie WSCP (figuur 1). Het protocol is eenvoudig, snel en vereist geen speciale apparatuur nodig, behalve een tissue homogenisator. De absorptie en CD spectra...

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en high-throughput werkwijze voor het samenstellen in water oplosbare eiwitten met hydrofobe pigmenten die is gebaseerd op water-in-olie-emulsies. We tonen de effectiviteit van de werkwijze voor de assemblage van natieve chlorofyl vier varianten van recombinant water oplosbare chlorofyl-bindende eiwitten (WSCPs) van Brassica planten tot expressie gebracht in E. coli.

Water in olie emulsies: Een nieuw systeem voor het samenstellen van water-oplosbare-Chlorophyll bindende eiwitten met Pigmenten Hydrofobe

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Het algemene doel van deze techniek is om de incorporatie van wateronoplosbare chlorofyllen in de bindingsplaatsen van wateroplosbare eiwitten mogelijk te maken. Deze methode maakt de assemblage van chlorofyllen met recombinante eiwitten mogelijk, wat grondige studies naar chlorofyl-eiwitinteracties toestaat en nieuwe mogelijkheden opent voor het construeren van innovatieve chlorofyl-eiwitcomplexen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het geen tagging of immobilisatie van de eiwitten vereist.Hierdoor is het zeer geschikt voor screeningassays. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dominica Bednarczyk, een postdoc in mijn onderzoeksgroep. Voer bij het bereiden van de volgende stamoplossingen alle stappen voor de chlorofylbereiding uit onder een zuurkast bij groen licht of in het donker om fotobeschadiging te minimaliseren.Voeg altijd stikstof of argon toe voordat de pigmenten voor bewaring worden ingevroren en zorg ervoor dat alle oplosmiddelen van analytische kwaliteit zijn. Begin met het wegen van ongeveer vijf gram gelyofiliseerde Spirulina platensis-cellen of andere cyanobacteriecellen die alleen chlorofyl a of chlorofyl-a in thylakoïdmembranen bevatten, en gebruik een vijzel en stamper om deze te vermalen. De kritieke stap tijdens de chlorofylextractie is om ervoor te zorgen dat de cyanobacteriecellen grondig zijn gelyofiliseerd en om de volledige verwijdering van water uit de DEAE-Sepharose te garanderen door middel van meerdere wasbeurten met aceton.Breng de geplette cellen over op een glazen kolom en was het weefsel met ongeveer 50-100 milliliters 100% aceton om de carotenoïden te verwijderen. Gooi na het wassen de geëlueerde oranje-groene fractie weg. De werkelijke kleur kan variëren van oranje-groen tot groen, afhankelijk van de cyanobacteriecultuur en de groeicondities.Vervang het aceton door 100% methanol en verzamel de groene fractie die chlorofyl a bevat. Stop de elutie wanneer de kleur van de geëlueerde fractie verandert van donkergroen naar lichtgroen. Verdam vervolgens het methanol met een rotatieverdamper met een waterbad dat 30 graden Celsius niet overschrijdt, totdat het extract volledig droog is. Gebruik daarna een klein volume diethylether om de pigmenten uit de gedroogde extracten volledig op te lossen en filtreer de oplossing door watten, waarbij een aanvullend klein volume ether wordt gebruikt om de pigmenten van de watten af te wassen.Verdampt de diethylether totdat de pigmenten volledig droog zijn. Indien u op dit punt stopt, bewaar de droge pigmenten dan onder stikstof of argon bij 20 °C in het donker tot verdere verwerking. Om door te gaan met de bereiding van chlorofyl a, los de droge pigmenten gedeeltelijk op in het kleinst mogelijke volume 100% aceton, voeg vervolgens 4 ml aceton toe aan de suspensie en draai de kolf rond om de pigmenten volledig op te lossen.Laad de monsteroplossing voorzichtig met een Pasteur-pipet op een DEAE-Sepharose-kolom die is geëquilibreerd in 100% acetone en elueer de carotenoïden met 100% acetone. Gebruik vervolgens een mengsel van acetone-methanol in een volumeverhouding van 3:1 om chlorofyl a te elueren. U kunt een zaklamp gebruiken om de kolom tijdens de elutie kort te verlichten om de werkelijke pigmentkleuren te kunnen waarnemen.Verifieer de zuiverheid van chlorofyl a met dunne-laagchromatografie door een volumeverhouding van 68:25:5:2 van dichloormethaan en hexaan, isopropanol en methanol te gebruiken om het monster te elueren. Verdamp vervolgens het oplosmiddel met een rotavapor tot het chlorofyl a volledig droog is. Om een voorraadoplossing van chlorofyl a te bereiden, lost u het droge chlorofyl a opnieuw op in 2-4 milliliters van 100% methanol.Om de organische fase van de emulsie te bereiden, weeg in een buis van 50 milliliter 0,2 gram Tween 80, 1,8 gram Span 80 en 38 gram minerale olie af. Meng de componenten goed en plaats de oplossing op ijs om te koelen. Om een waterige fase te bereiden die gezuiverd wateroplosbaar chlorofyl-bindend eiwit, of WSCP, bevat, kweek E.coli BL21-bacteriën die het WSCP-gen bevatten in 1 liter LB-medium bij 37 °C tot een OD600 van 0,3 tot 0,6.Voeg 1 millimolar IPTG toe om de eiwitexpressie te induceren en kweek de bacteriën gedurende 12-16 uur bij 30 °C, oogst daarna de bacteriën door centrifugatie bij 5000 G en 4 °C gedurende 10 minuten. Los het pellet op in een buffer die geschikt is voor affiniteitschromatografie, breng de bacteriesuspensie over naar kleinere buisjes en sonicize op ijs. Na het centrifugeren van het lysaat worden de recombinante getagde WSCP-eiwitten gezuiverd met behulp van het passende commercieel verkrijgbare affiniteitschromatografiesysteem voor eiwitzuivering, volgens de instructies van de fabrikant.Bereid de waterfase van de emulsie voor door de buffer uit te wisselen naar 50 millimolaire fosfaatbuffer pH 7,8 en de concentratie van het gezuiverde WSCP aan te passen naar 0,5 tot 1 milligram per milliliter. Om een waterfase voor te bereiden die ruw bacterieel lysaat met WSCP bevat, worden E.coli BL21-cellen die een plasmide tot expressie brengen van WSCP gekweekt in 250 milliliter LB bij 37 graden Celsius tot de logfase. Voeg 1 millimolair IPTG toe om de eiwitexpressie te induceren en kweek de bacteriën gedurende de nacht bij 30 graden Celsius.De volgende dag, na het oogsten van de bacteriële cellen, wordt 1-2 milliliters 50 millimolair natriumfosfaatbuffer pH 7,8 gebruikt om de pellet op te lossen. Centrifugeer vervolgens, na sonicatie, het lysaat bij 12.000 G en 4 graden Celsius gedurende 30 minuten. Bereid de waterige fase van de emulsie door 0,125 milliliters supernatant te mengen met 0,875 milliliters 50 millimolair natriumfosfaatbuffer pH 7,8.Om WSCP met chlorofyl a in emulsie te assembleren, brengt u 5 milliliters van een grondig gemengd olie-surfactantmengsel over in een glazen vial en koelt u dit op ijs. Voeg 1 milliliter van de zojuist bereide ijskoude waterige fase toe en gebruik een weefselhomogenisator op 9 500 RPM op ijs gedurende twee minuten om beide fasen te mengen. Voer vanaf dit punt alle stappen onder groen licht uit om fotbeschadiging te minimaliseren, en voeg 20 microliters van een 25 millimolaire chlorofyl a-stockoplossing toe aan de emulsie.Dispergeer door het glazen vials te tikken en om te keren om ervoor te zorgen dat het chlorofyl a gelijkmatig over de emulsie is verdeeld, en incubeer vervolgens 1-2 uur op ijs in het donker. De kritieke stap tijdens de bereiding van de emulsie is het afkoelen van zowel de waterfase als de organische fase vóór het mengen. Breng vervolgens, om de emulsie te verbreken en de waterdruppels van de organische fase te scheiden, de emulsie over naar plastic buisjes van 1,5 milliliter en centrifugeer 5 minuten bij 14.000 G bij kamertemperatuur.Verwijder de bovenste oliefase en voeg 1 milliliter minerale olie toe aan de onderste fase, meng dit vervolgens goed door te vortexen of door de buis om te keren. Verwijder na het centrifugeren van het monster de bovenste oliefase en herhaal de toevoeging van minerale olie en de centrifugatie totdat een heldere meniscus is bereikt die de waterige en minerale oliefasen scheidt zonder tussenliggende emulsie. Voeg nu 1 milliliter waterverzadigde diethylether toe aan de waterige fase.Vortex vervolgens het monster en centrifugeer dit daarna 5 minuten bij 14.000 G bij kamertemperatuur. Verwijder na de derde centrifugatie in de zuurkast de diethylether en laat de buisjes 5-20 minuten openstaan. Laad tot slot de waterige fase met het WSCP-chlorofyl a-complex op een ontzoutingskolom en elueer met een buffer die geschikt is voor toekomstige experimenten.Bewaar het monster bij 4 graden Celsius, afgeschermd van licht, gedurende maximaal één maand. Met gebruik van het in deze video beschreven protocol werden recombinante WSCP-apoproteïnen geassembleerd met chlorofyl a in water- en olie-emulsies. Hier worden de absorpties en CD-spectra getoond van chlorofyl a-complexen met vier recombinante WSCP-varianten.De resultaten vertonen qua bandevormige eindpositie overeenstemming met eerder gerapporteerde spectra van de respectievelijke natuurlijke complexen. Deze figuur toont de positieve assemblage van WSCP met chlorofyl a in lysaten van WSCP-expresserende cellen, zichtbaar aan de groene kleur van de waterfase. Dit resultaat demonstreert het potentieel van water-olie-emulsies als een snel screeningsysteem voor de positieve assemblage van WSCP's met chlorofyllen.Zoals hier wordt aangetoond, vertonen druppels van lysaten met WSCP een duidelijke chlorofyl a-fluorescentie in confocale microscopiebeelden. Dit impliceert dat de succesvolle assemblage van WSCP-chlorofylcomplexen direct in de waterdruppels kan worden gedetecteerd, wat een basis kan vormen voor screeningssystemen op basis van water-in-olie-emulgies. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in vijf uur worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het werken met chlorofyllen snel moet gebeuren, zonder de chlorofyllen bloot te stellen aan licht en zuurstof. Na de ontwikkeling stelde deze techniek ons in staat om een breed scala aan wateroplosbare chlorofylbindende eiwitten voor te bereiden, die worden gebruikt om het effect van de eiwitomgeving op de elektrolytische en spectrale eigenschappen van chlorofyllen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe chlorofyllen uit cyanobacteriën kunnen worden geëxtraheerd en gezuiverd, en hoe ze kunnen worden samengevoegd in wateroplosbare eiwitten met behulp van water-olie-emulsies.Vergeet niet dat het werken met organische oplosmiddelen, zoals ether, methanol of aceton, schadelijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het werken in een zuurkast, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

water-oil-emulsions-new-system-for-assembling-water-soluble

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Dit protocol beschrijft de reconstituurtie van licht-oogstcomplexen in vitro. Deze integrale membraaneiwitten coördineren chlorofylen en carotenoiden en zijn verantwoordelijk voor het oogsten van licht in hogere planten en groene algen.

In Vitro Reconstructie van Licht-oogsten Complexen van planten en groene algen

Organische kleurstofmoleculen en oleic zuur gecoate upconverting nanodeeltjes zijn niet wateroplosbaar. Dit protocol beschrijft een ‘plug and play’ methode die de overdracht van organische kleurstofmoleculen en upconverting deeltjes van hun oorspronkelijke hydrofobe oplosmiddel naar water mogelijk maakt.

Een &#39;Plug and Play&#39; methode om water verspreidende Nanoassemblies bevattende een Amfifiele Polymer, organische kleurstoffen en Upconverting Nanodeeltjes maken

Dit artikel beschrijft praktische methoden om hydrogels te bereiden in vrijstaande films en geïmpregneerde membranen en om hun fysische eigenschappen te karakteriseren, inclusief watertransporteigenschappen.

Synthese van Hydrogels met Antifouling eigenschappen membranen voor waterzuivering

Dit protocol beschrijft een klinisch-middelen uit het oplossen van de hydrofobe bestanddelen in een waterige omgeving met behulp van combinaties van het zelf monteren van peptide en aminozuur oplossingen. Onze methode is opgelost een belangrijke beperking van hydrofobe therapeutics, die veilig en efficiënt vervoermiddel oplosbaarheid en levering methoden in klinische instellingen.

Oplosbaarheid van hydrofobe bestanddelen in waterige oplossing met behulp van combinaties van het zelf monteren van Peptide en aminozuur

Hier presenteren we twee ultrasnelle protocollen voor reconstructie van membraaneiwitten in fusogenic proteoliposomes, en de fusie van dergelijke proteoliposomes met doel lipide bilayers voor wasmiddel-gratis bezorging van deze membraaneiwitten binnen de postfusion dubbelgelaagde. De combinatie van deze benaderingen kan snel en gemakkelijk-gecontroleerde vergadering van complexe multi-component membraan systemen.

Wasmiddel-vrije ultrasnelle reconstitutie van membraaneiwitten in lipide-Bilayers met behulp van Fusogenic aanvullende geladen Proteoliposomes.

Hier presenteren we een protocol om te isoleren fucoxanthin chlorofyl a/c bindende proteïnen (FCP) van diatomeeën en in liposomen met natuurlijke lipide composities aan het bestuderen van excitatie energieoverdracht op ion samenstelling veranderingen te integreren.

Isoleren en de integratie van licht-oogst antennes van Diatomee Cyclotella Meneghiniana in liposomen met thylakoïde lipiden

Op het snijvlak van organische en waterige oplosmiddelen assembleren op maat gemaakte amfifiele elastine-achtige eiwitten zich in complexe supramoleculaire structuren zoals blaasjes, vezels en coacervaten die worden geactiveerd door omgevingsparameters. De beschreven assemblageprotocollen leveren Op eiwitmembraan gebaseerde compartimenten (PMBC's) met tunable eigenschappen, waardoor de inkapseling van verschillende lading.

Geleid Assemblage van Elastin-achtige eiwitten in gedefinieerde supramoleculaire structuren en cargo-encapsulation in vitro

We rapporteren een protocol voor het produceren van een hybride lipide membraan op de water/lucht interface door het smeren van de lipide bilayer met koper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) moleculen. Het resulterende hybride lipidemembraan heeft een lipide/CuPc/lipide sandwichstructuur. Dit protocol kan ook worden toegepast op de vorming van andere functionele nanomaterialen.

Self-Assembly van hybride lipid membranen doped met hydrofobe organische moleculen op de Water / Air Interface

Oliën die worden gebruikt voor medicijnafgiftetoepassingen kunnen het lipidenprofiel van patiënten verstoren, wat ongewenst is bij hart- en vaatziekten. Omega-3-vetzurenrijke oliën zijn een gezond alternatief voor conventionele oliën en hebben een enorm potentieel voor zelf-geëmulgeerde medicijnafgiftesystemen.

Zelf-nano-emulgering van gezonde oliën om de oplosbaarheid van lipofiele geneesmiddelen te verbeteren

Het huidige protocol beschrijft octanol-assisted liposome assembly (OLA), een microfluïdische techniek om biocompatibele liposomen te genereren. OLA produceert monodisperse, micron-sized liposomen met efficiënte inkapseling, waardoor onmiddellijke experimenten op de chip mogelijk zijn. Dit protocol is naar verwachting bijzonder geschikt voor synthetische biologie en synthetisch celonderzoek.

On-chip octanol-geassisteerde liposoomassemblage voor bio-engineering

Dit protocol beschrijft het Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)-systeem dat wordt gebruikt bij het bouwen van synthetische cellen. Het schetst de belangrijkste fasen met representatieve resultaten in verschillende microcompartimenten. Het protocol heeft tot doel best practices vast te stellen voor diverse laboratoria in de synthetische celgemeenschap, waardoor de vooruitgang in de ontwikkeling van synthetische cellen wordt bevorderd.

Celvrij eiwitsynthesesysteem voor het bouwen van synthetische cellen

Leer een water-in-olie emulsie methode voor het assembleren van wateroplosbare chlorofyl-bindende eiwitten met hydrofobe pigmenten. Deze techniek maakt gedetailleerd onderzoek naar chlorofyl-eiwit interacties mogelijk zonder tagging.

Water in olie emulsies: Een nieuw systeem voor het samenstellen van water-oplosbare-Chlorophyll bindende eiwitten met Pigmenten Hydrofobe (Video) | JoVE Journal

Water in olie emulsies: Een nieuw systeem voor het samenstellen van water-oplosbare-Chlorophyll bindende eiwitten met Pigmenten Hydrofobe

Meer video's verkennen