Name: Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer een geoptimaliseerde scratch assay om migratieveranderingen in muizen long-mesenchymale stromale cellen te detecteren na schade door oplosbaar sigarettenrookextract. Deze methode biedt betrouwbare kwantitatieve metingen voor longregeneratief onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn de andere leden van het lab dankbaar voor hun technische assistentie bij het ontwikkelen van de CSE-schadetest, en hun ondersteuning en advies tijdens de ontwikkeling van deze test. Bovendien zijn we de Holy Cross Fenwick Scholar Committee dankbaar voor hun ondersteuning van Nicholas Cormier, en het Holy Cross College Honors programma voor hun ondersteuning van Alexander Yeo.

Opmerking: Voor deze studie, long mesenchymale stromacellen (LR-MSC&#39;s) vanaf het distale longweefsel werden geïsoleerd hetzij op basis van hun expressie van celoppervlak merkers (CD45 negatieve, CD31 neg, Sca-1 hoog EpCAM neg) 14,15 behulp explant out-groei van 16, of met behulp van enzymatische vertering 17. Hechtende LR-MSC&#39;s werden gekweekt in DMEM met hoge glucose en geen glutamine, 15% FBS, 1 x antibioticum / antimycoticum en 2 mM glutamine (voortaan compleet medium) en geïncubeerd bij 37 ° C, 5% CO2. LR-MSCs werden 3-4 keer gepasseerd om een ​​populatie van cellen te verzekeren relatief homogene groei kenmerken van de migratie assay. 1. Het voorbereiden van een Confluent Monolayer <ol><li> Om MSCs van standaard 100 mm kweekschalen los, wassen cellen met 10 ml 37 ° C voorverwarmde PBS, zuig het PBS en voeg 4 ml trypsine (0,25%). Incubeer 3-5 min in een 37 ° C incubator. Zuig de cells in een conische buis, voeg gelijk volume compleet medium en centrifugeer bij 300 g gedurende 5 min om pellet de cellen af. Opmerking: Langere incubatie in trypsine kan het celoppervlak receptoren veranderen en mogelijk invloed migratie. </li><li> Zuig media en resuspendeer cellen in verse volledige media. Tellen cellen, met uitzondering van dode cellen met behulp van trypan blauw exclusie en plaat 500.000 mesenchymale stromale cellen in 4 ml van volledig medium op een 60 mm celkweek schaal. Opmerking: Afhankelijk van de bron van de cellen, kunnen tests noodzakelijk zijn om het optimale aantal cellen nodig te bepalen. </li><li> Incubeer de cellen tot platen 90% confluent optimale celhechting en proliferatie, gewoonlijk 48-72 uur voor MSCs. Opmerking: 100% samenvloeiing is niet aan te raden, omdat veel verankering-afhankelijke cellen ervaring contact inhibitie, die hun trekkende capaciteit kunnen veranderen. Platen met minder dan 80% confluentie leiden tot onbruikbare&#39;s omdat de beeldanalyse software gap interpreterens tussen cellen als deel van de omtrek van de kras (zie figuur 1D). </li><li> Nadat de cellen 90% samenvloeiing hebben bereikt, schade aan de cellen afhankelijk van de toepassing. Tot cel schade na blootstelling aan oplosbare sigarettenrook extract (CSE) te beoordelen, het genereren van 100% CSE door het tekenen van de rook van 1 Universiteit van Kentucky onderzoek sigaret (3R4F) tot en met 25 ml van complete media in een Büchner kolf meer dan 2 min 18. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 24 uur in 4 ml 1-4% CSE verdund in volledige media. Na incubatie was de cellen tweemaal met 4 ml warme steriele PBS alvorens te vervangen door 4 ml vers compleet medium. Opmerking: Beschadiging cellen met hoge concentraties van sigarettenrook extract (&gt; 5%) kunnen aanzienlijk verminderen samenvloeiing. </li></ol> 2. Het creëren van de Scratch <ol><li> In een steriele omgeving, verwijder dan het deksel van de 60 mm plaat van beschadigde MSC&#39;s, en leggen een rechte rand (bijvoorbeeld een gesteriliseerde kunststof liniaal) across de bovenrand van de plaat. Zonder het verwijderen van de media, een steriele 200 ul pipet tip geleid door de steriele straight-edge om 03:59 parallelle krassen over de plaat van ongeveer 5 mm van elkaar en 50 mm lang. Opmerking: Een rechte rand minimaliseert de hoeveelheid rotatie-aanpassingen die nodig zijn om de plaat wanneer het op de microscoop podium. Het is noodzakelijk dat de krassen verschijnen volledig verticale (of horizontale) op het scherm. Het genereren van meerdere krassen op een 60 mm plaat neemt niet weg micro zodanig dat celmigratie (data niet getoond) treft, maar kan ook voor andere celtypen. Het gebruik van kleinere putjes wordt niet aanbevolen aangezien de variabiliteit van groeiende cellen nabij de rand van de put wordt meer uitgesproken en kunnen uniform generatie krassen beïnvloeden. </li><li> Zuig het medium en voorzichtig wassen van de platen met 2 ml voorverwarmde compleet medium aan cellen voorkomen hechten aan het midden van de kras en naar cel verwijderens die zijn losgemaakt door het krassen. Vervangen door 4 ml vers compleet medium. </li><li> Met behulp van een steriele permanent marker, labelen elke kras 1-4 aan de onderzijde van de plaat op de locatie die niet zal bemoeien met de beeldvorming van de krassen. Opmerking: Het is belangrijk dat beelden van dezelfde nul vergeleken vóór en na de migratie, omdat er variatie scratch breedte kan worden. </li></ol> 3. Rekening Eerste Beelden van de Scratch Opmerking: Als de scratch test wordt uitgevoerd op meerdere platen, wordt aanbevolen dat de eerste beelden van de krassen op een enkele plaat worden genomen voordat krassen worden gemaakt op de volgende plaat. <ol><li> Gebruik een omgekeerde fase contrast microscoop met een camera nodig zijn om de beelden voor analyse te genereren. </li><li> Plaats de cultuur plaat op de microscoop, en gebruik de laag vermogen doelstelling (10X) op peil te lokaliseren # 1. Als condensatie op het deksel van de cultuur plaat een duidelijk imag belemmerte van de cellen, gebruik maken van een verwarmd podium set tot 37 ° C. </li><li> Houd de kras volledig horizontaal en in het midden van het gezichtsveld verkrijgen zoveel als nodig is om beelden omvatten 90% van de lengte van de kras is. Verkrijgen beelden van de verschillende delen van de kras met geen overlap tussen de beelden. Opmerking: De lichtbreking aan de randen van de kweekschaal overbelicht afbeeldingen, waardoor ze onmogelijk te analyseren. Daarom niet beelden te nemen van de eerste en de laatste 5% van de lengte van de scratch&#39;s. </li><li> Afbeeldingen vanaf elke kras in een aparte map. </li><li> Herhaal stap 3,2-3,4 voor krassen 2, 3 en 4. </li><li> Terugkeer platen in de incubator onmiddellijk na de eerste imaging. Laat cellen migreren 4-7 uur. Opmerking: 7 uur is optimaal bij de beoordeling van MSC&#39;s beschadigd met CSE. Incuberen van de cellen gedurende meer dan 7 uur wordt niet aanbevolen omdat celproliferatie kan fungeren als een verstorende variabele celmigratie (zie optionele opmerking 8,2 hieronder). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Het analyseren van Initial Scratch Afbeeldingen <ol><li> Download ImageJ en installeer de Wound Healing Tool plugin (zie de tabel van Materialen / Equipment). </li><li> Open het beeldbestand in ImageJ, klik op &quot;Process&quot; en &quot;Find Edges&quot; om de cellen rond de scratch voor de Wound Healing Tool om de scratch gebied (Figuur 2B) te berekenen markeren. Vervolgens klikt u op &quot;Beeld&quot;, &quot;aanpassen&quot;, &quot;Color Threshold&quot; en in het dropdown menu label &quot;Threshold Kleur&quot; verander de waarde naar &quot;B &amp; W.&quot; </li><li> In het menu &quot;Color Threshold&quot;, passen zowel helderheid drempel schuifjes tot een optimaal contrast tussen de nul en cel voorzijde wordt bereikt. Met het oog op de grootste bereik wanneer het proberen om het contrast in het beeld te creëren, beweegt de onderste schuif helemaal naar rechts (volledig zwart beeld), en daarna pas de bovenste schuifknop om maximaal contrast te genereren. </li><li> Langzaam aan te passen de top brightness schuifregelaar van links naar rechts totdat het beeld verschijnt netjes de contour van de scratch (figuur 2C). Zodra de randen van de kras zijn geïdentificeerd, klikt u op &quot;More Tools&quot; in de werkbalk ImageJ, selecteer &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; uit het dropdown menu, en druk op de &quot;M&quot; knop (die zal verschijnen in de werkbalk ImageJ) om de scratch gebied markeren en de output van de berekende gebied in een resultaten pop-out-venster (Figuur 2D). </li><li> Kopieer en plak alle nummers uit de resultaten (Figuur 2E) in een Excel-spreadsheet. Zorg ervoor dat u de gegevens van individuele krassen scheiden. </li></ol> 5. Met Final Beelden van de Scratch <ol><li> Nadat de cellen zijn gemigreerd (4-7 uur) Herhaal stap 3,2-3,4. Afbeelding de platen in de volgorde waarin ze werden bekrast zodat cellen op elke plaat evenveel tijd te migreren hebben gehad. Opmerking: De cellen kunnen worden afgebeeld op verschillende tijdstippen, afhankelijk van de Sensiteit voor zowel temperatuur als pH-veranderingen. Als alternatief kan live cell imaging gebruikt om de cellen te volgen in real-time als ze migreren. </li></ol> 6. Het analyseren van Final Scratch Afbeeldingen <ol><li> Herhaal stap 4,2-4,5 voor de uiteindelijke scratch beelden. </li></ol> 7. Berekening van de Scratch gebied van migratie Kwantificeer <ol><li> Bereken het gemiddelde pre-migratie gebied door het middelen van de beginstrook waarden van de respectievelijke krassen. </li><li> Bereken de totale migratie door het aftrekken van de uiteindelijke migratie oppervlak per beeld, berekend in stap 6, de gemiddelde pre-migratie gebied (stap 7,1). Genereer een lijst met waarden voor elke kras die de verandering in de migratie. </li><li> Verzamel de gegevens van meerdere krassen van dezelfde testgroep (alle borden en al krassen cellen blootgesteld aan 0% CSE). Gebruik een variantie analyse test om de verschillen tussen de experimentele groepen te analyseren. </li><li> Als de cellen langzaam migrerenen vereisen een langere incubatietijd na krabben (meer dan 10-12 uur), voeren een BrdU incorporatie assay of EDU 19 om te bepalen of cellen zij enige proliferatie tijdens de periode waarin de assay migratie optreedt. Kies een migratie assay tijd om significante celproliferatie te voorkomen. </li></ol> 8. Optioneel <ol><li> Om te beoordelen of significant celsenescentie optreedt als gevolg van het krassen procedure, voert een senescentie-geassocieerde beta-galactosidase test op een proefplaat op vooraf bepaalde tijdstippen na 19 krabben. </li></ol>

<ol><li>Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative%2C+facile%2C+and+high-throughput+image-based+cell+migration+method+is+a+robust+alternative+to+the+scratch+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).</li>
<li>Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+integrating+signals+from+front+to+back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).</li>
<li>Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+or+stromal+cells%3A+a+review+of+clinical+applications+and+manufacturing+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices.</a> Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).</li>
<li>Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+alters+nuclear+shape+and+reduces+cell+motility+in+three+dimensional+model+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).</li>
<li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li>
<li>Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha4beta1+Integrin+Regulates+Lamellipodia+Protrusion+Via+a+Focal+Complex%2Ffocal+Adhesion-Independent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).</li>
<li>Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+wound+healing+effect+of+Calendula+extracts+using+the+scratch+assay+with+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts.</a> J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li>
<li>Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-conditioned+medium+accelerates+skin+wound+healing%3A+an+in+vitro+study+of+fibroblast+and+keratinocyte+scratch+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays.</a> Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).</li>
<li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).</li>
<li>Chung, C. A., Chen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cell+sedimentation+on+measuring+chondrocyte+population+migration+using+a+Boyden+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber.</a> J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).</li>
<li>Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lymphocyte+traffic+by+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules.</a> Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).</li>
<li>Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigidity-driven+growth+and+migration+of+epithelial+cells+on+microstructured+anisotropic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).</li>
<li>Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+Dependence+of+Lung+Mesenchymal+Stromal+Cell+Dynamics+Following+Pneumonectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy.</a> Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).</li>
<li>McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+fibroblastic+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+lung+are+highly+enriched+in+the+sca-1+positive+cell+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction.</a> Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).</li>
<li>Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cell+Post-Transplantation+Survival%2C+Persistence%2C+Paracrine+Expression%2C+and+Repair+of+Elastase-Injured+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).</li>
<li>Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+aging+on+the+regenerative+properties+of+bone+marrow-%2C+muscle-%2C+and+adipose-derived+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells.</a> PLoS One. 9 (12), e115963(2014).</li>
<li>Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cigarette+smoke+extract+on+human+airway+smooth+muscle+cells+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD.</a> Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).</li>
<li>Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+detect+biomarkers+of+cellular+senescence%3A+the+senescence-associated+beta-galactosidase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay.</a> Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hier beschreven protocol voorziet in een kwantitatief robuuste, gestandaardiseerde methode om te presteren en scratch testen analyseren. Eenvoudige scratch testen worden routinematig gebruikt in veel verschillende gebieden van onderzoek om cellulaire migratie te onderzoeken. Echter, van oudsher de kras test is een gestandaardiseerde set-up en kwantificering protocol, wat heeft geleid tot problemen met reproduceerbaarheid 7,10 ontbrak. Veel van de wijzigingen en optimalisaties voor de verbetering van de scr...

Celmigratie is sterk gecoördineerde en essentieel voor vele fysiologische processen zoals weefselontwikkeling, herstel en regeneratie, alsook pathologische processen zoals kanker metastase en arteriosclerose 1. Inzicht in celmigratie is bijzonder relevant voor nieuwe therapieën gebruikt om beschadigde weefsels te herstellen en te behandelen pathologische aandoeningen, waaronder celtransplantatie technologieën en kunstmatige weefsel enten 2. Gezien de huidige interesse in de rol van mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) bij het ​​mediëren van weefselherstel 3, kwantificeren het trekkende vermogen van deze cellen met behulp van een test die is rigoureus kwantificeerbaar, flexibele en kosteneffectieve van belang. Belangrijk is dat dergelijke test voldoende gevoelig relatief subtiele veranderingen in de cellulaire trekkende capaciteit sporen na schade. De huidige methoden voor het kwantificeren van cel migratie, waaronder scratch assays, trans-en migratie assays (Boyden chAmbers), micropillar arrays, en mobiele uitsluiting zone assays beschikken over een reeks van beperkingen in de reproduceerbaarheid, aanpasbaarheid, kwantificering en kosten-effectiviteit 1,4,5. De geoptimaliseerde scratch test hier beschreven toont robuuste resultaten, meetbare en image-based analysemogelijkheden, kosteneffectiviteit en aanpassingsvermogen aan andere toepassingen. Scratch assays werden gebruikt in verschillende capaciteiten voor celmigratie en proliferatie onder verschillende experimentele condities 5 evalueren. De bepaling houdt in het enten van de aangewezen cellen groeien ze of nabij confluentie voltooien en krassen op de resulterende monolaag met een steriele naald of een pipet tip 6. Analyse wordt meestal uitgevoerd door vergelijking van de breedte van de kras over meerdere tijdstippen op willekeurig gekozen plaatsen 7-9. Ondanks zijn prominente gebruik wordt de scratch test verstoord door problemen met reproduceerbaarheid en kwantificering. Variabiliteit ingenereren van de kras niet alleen verandert de micro-omgeving van de cellen, maar ook celmigratie belemmeren door beschadiging van het plaatoppervlak en de onderliggende extracellulaire matrix 5. Assays worden vaak uitgevoerd in 7-12 uur, maar voor cellijnen weergeven langzamere migratie en langere testtijden, proliferatie wordt een verstorende variabele 7,10. Ten slotte kan verouderde cellen gegenereerd door het krassen procesfactoren die interfereren met de extracellulaire signalering nodig is om het verschil in de monolaag 1 vrijgeven. Het optimaliseren van de scratch test vereist creëren van een consistente kloof die niet interfereert met de oppervlakte-eigenschappen, het minimaliseren assay tijdsduur en het voorkomen van ongewenste celdood tijdens de manipulatie. De stop gebaseerde test is een optimalisatie van een cel verboden zone assay. Deze test maakt gebruik van een stop in het midden van de put die celgroei uitsluit, maar laat de cellen worden geplateerd om de centrale verboden zone.Om migratie te beoordelen, wordt de stop verwijderd, en de daaruit voortvloeiende uitsluiting zone biedt een oppervlak voor de migratie te voorkomen. Echter, deze test moeilijk te passen of aan te passen 10 en voor sommige toepassingen, kan deze techniek ook hoge kosten. In tegenstelling tot nul assays en derivaten daarvan, trans-well migratie assays (of Boyden kamer assays) beoordelen migratie door het kwantificeren van het aantal cellen die van de ene kamer door een microporeus filter membraan, in een kamer die chemotactische 8,11, 12. Deze techniek heeft nut beperkt hechtende cellen zoals MSCs omdat na migratie door het poreuze membraan, de cellen hechten aan de membraanzijde blootgesteld aan de chemotactische middelen en kan moeilijk nauwkeurig te kwantificeren. Terwijl de test is in staat om een driedimensionale migratiepatronen onderzoeken de beperkte cel typen waarvoor zij kan celmigratie grens zijn nut nauwkeurig kwantificeren 10. Een ander alternatief nul assays maakt gebruik van een micro-pijlers array, die cellulaire motiliteit gemeten door een driedimensionale ruimte met behulp van het vermogen van cellen te vervormen en migreren in de array als een surrogaat. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomeren genezen over een precieze vorm en behandeld met ozon en fibronectine produceert een homogene en niet-afbreekbare micro-omgeving. Afstand micro-pijlers kan ook worden gevarieerd als nodig is om het vermogen van cellen om de matrix 4 voer te meten. De mal wordt gecreëerd door diepe reactief ion etsen van siliciumschijven een negatieve versie van de high-aspect-ratio-array 13 te creëren. Terwijl de test wordt versterkt door de aanpasbaarheid, vermogen modelleren driedimensionale migratie en analyse door directe visualisatie van migrerende cellen, moeilijk maken micro-pijlers arrays economisch belemmert het wijdverbreide gebruik. De geoptimaliseerde scratch test beschreven in dit protocol zorgt voor een efficiënte, cost-effectieve methode voor het produceren van consistente krassen die kunnen worden geanalyseerd met vrij beschikbare software. In plaats van eenvoudige breedte metingen over de scratch voor en na celmigratie, de software stelt de gebruiker in staat om totale scratch gebieden te bepalen vóór en na de migratie. Deze vooruitgang beperkt de kwestie van het proberen om te bepalen waar de kras de breedte metingen moeten worden genomen, en of de breedte van de kras is uniform langs zijn totale lengte. Bovendien is een zorgvuldige optimalisatie van celaantallen, celconfluentie en het type en de mate van schade toegebracht aan de cellen behandeld om verdere optimalisatie van de assay.

<table><tbody><tr><td>DMEM (high glucose, no added glutamine)</td><td>Life Technologies</td><td>31053-036</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091002</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV3007901</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine, 200 mM, Thermo Scientific HyClone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>TypeLE cell dissociation reagent</td><td>Life Technologies</td><td>12563-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Falcon standard 60 mm tissue culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterile 200 &mu;l pipet tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-502</td><td></td></tr><tr><td>Inverted light microscope with camera attachment</td><td>Variable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software&nbsp;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRI_Wound_Healing plugin</td><td><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statistical analysis software</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimalisatie van de wond scratch assay om veranderingen in muizen mesenchymale stromal cell migratie detect na schade door oplosbare sigarettenrook extract

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Celmigratie is essentieel voor veel fysiologische en pathologische processen, waaronder weefselontwikkeling, reparatie en regeneratie, kankermetastasen en ontstekingsreacties. Gezien de huidige interesse in de rol van mesenchymale stromale cellen bij het mediëren van weefselreparatie, zijn we geïnteresseerd in het kwantificeren van het migratievermogen van deze cellen en het begrijpen hoe het migratievermogen kan veranderen na schade. Optimalisatie van een rigoureus kwantitatief migratie-assay dat zowel gemakkelijk aan te passen als kosteneffectief is om uit te voeren, is de sleutel tot het beantwoorden van vragen over veranderingen in celmigratie als reactie op verschillende stimuli. Huidige methoden voor het kwantificeren van celmigratie, inclusief scratch assays, trans-well migratie-assays (Boyden kamers), micropillar arrays en cel-uitsluitingszone-assays, hebben een reeks beperkingen in reproduceerbaarheid, aanpasbaarheid, kwantificering en kosteneffectiviteit. Ondanks het prominente gebruik, wordt de scratch assay geconfronteerd met problemen met betrekking tot reproduceerbaarheid die verband houden met schade aan de celmicro-omgeving, belemmeringen voor celmigratie, invloed van naburige senescerende cellen en celproliferatie, evenals een gebrek aan rigoureuze kwantificering. De hier beschreven geoptimaliseerde scratch assay toont robuuste resultaten, meetbare en beeldgebaseerde analysemogelijkheden, kosteneffectiviteit en aanpasbaarheid aan andere toepassingen.

De scratch assays hier gepresenteerde werden uitgevoerd met muizen long inwoner mesenchymale stromale cellen (LR-MSC) en geïsoleerd zoals genoemd in het protocol toelichting. De LR-MSC&#39;s werden geënt bij een dichtheid van 500.000 cellen in een 60 mm weefselkweekplaat en gekweekt tot 90% confluentie in 48 uur. Om schade te genereren, 4% CSE (hierboven beschreven) werd geïncubeerd met de cellen gedurende 24 uur na de initiële zaaien maar vóór de scratch test. Voor elke test werd de scratch gegenereerd met behulp van e...

Het vermogen om te migreren is een belangrijke functie van veel verschillende celtypen, inclusief mesenchymale stromale cellen (MSC's). Het kwantificeren van veranderingen in migratievermogen na schade is echter een uitdaging. Dit protocol beschrijft een eenvoudig aanpasbare migratietest die rigoureuze statistiek gebruikt om veranderingen in het migratievermogen van MSC's na schade te kwantificeren.

Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Het algemene doel van deze assay is het detecteren van veranderingen in het migratievermogen van mesenchymale stromale cellen uit de longen na beschadiging met een oplosbaar extract van sigarettenrook. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen in het veld van de regeneratieve biologie van de longen te beantwoorden, waaronder hoe het migratievermogen van longprogenitorcellen kan worden verbeterd om longherstel te ondersteunen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze is geoptimaliseerd om betere kwantitatieve metingen van celmigratie te leveren, terwijl de uitvoering economisch blijft en de methode eenvoudig aan te passen is.In deze demonstratie wordt de scratch-assay gebruikt om de migratiecapaciteit van muis-longmesenchymale stromale cellen, of MSC's, te kwantificeren. Na blootstelling aan een oplosbaar extract van sigarettenrook worden de MSC's gekweekt in compleet medium op platen van 60 millimeter en beschadigd zoals beschreven in de protocoltekst. Een passende confluentie is belangrijk voor de scratch-assay, omdat dit waarborgt dat de imaging-software de grenzen van de kras correct kan identificeren.Dit voorbeeld toont MSC's bij 95% confluentie, geschikt voor het maken van krassen in een steriele omgeving. Verwijder het deksel van een plaat met beschadigde MSC's en leg een rechte rand, zoals een gesteriliseerde plastic liniaal, over de bovenrand van de plaat. Een rechte rand minimaliseert het aantal rotatieaanpassingen dat nodig is voor de plaat wanneer deze later op de microscooptafel wordt geplaatst voor beeldvorming.Maak zonder het medium te verwijderen vier parallelle krassen over de plaat, ongeveer vijf millimeter uit elkaar en 50 millimeter lang, met een steriele pipetpunt van 200 µL die wordt geleid door een steriele liniaal. Het aanbrengen van meerdere krassen op een plaat van 60 millimeter verandert de micro-omgeving niet op een wijze die de celmigratie van MSC's beïnvloedt, maar dit kan bij andere celtypen wel een overweging zijn. Aspireer het medium en was de plaat voorzichtig met twee milliliter voorverwarmd compleet medium.Dit voorkomt dat cellen aan het centrum van de kras hechten en verwijdert cellen die door het krassen los zijn geraakt. Vervang dit door vier milliliters vers compleet medium en label elke kras van één tot vier op de onderzijde van de plaat met een steriele, permanente marker op posities die de beeldvorming niet belemmeren. De initiële beelden van elke kras moeten worden vastgelegd, omdat het belangrijk is dat beelden van dezelfde kras vóór en na de migratie worden vergeleken, aangezien er variatie kan zijn in de breedte van de krassen.Als de kras-assay op meerdere platen wordt uitgevoerd, wordt aanbevolen om eerst de beginbeelden van alle krassen op één enkele plaat vast te leggen voordat er krassen worden gemaakt op de volgende plaat. Gebruik een geïnverteerde fasecontrastmicroscoop met een camera om de voor de analyse benodigde beelden te verkrijgen. Plaats de kweekplaat op de microscoop en gebruik het objectief met lage vergroting om de kras te lokaliseren.Nummer één. Het is essentieel dat de kras volledig horizontaal op het scherm verschijnt. Terwijl de kras volledig horizontaal en in het midden van het gezichtsveld wordt gehouden, moeten er zoveel mogelijk beelden worden vastgelegd als nodig is om 90% van de lengte van de kras te omvatten. Neem beelden van verschillende delen van de kras zonder overlap tussen de beelden.Neem geen beelden van de eerste en laatste 5% van de lengte van de kras, omdat de lichtbreking aan de randen van de kweekschaal de beelden overbelicht, waardoor analyse onmogelijk wordt. Sla de beelden van kras nummer één op in een map. Verkrijg op dezelfde wijze beelden voor kras twee, drie en vier, en sla de beelden van elke kras op in een aparte map.Plaats de platen onmiddellijk na deze initiële beeldvorming terug in de incubator. Laat de cellen vier tot zeven uur migreren voordat deze assay wordt gestart. Download de Image J-software en installeer de wound healing tool-plugin.Open het afbeeldingsbestand in ImageJ, klik vervolgens op 'process' en selecteer 'find edges' om de cellen rondom de kras te markeren voor de wound healing tool. Om het oppervlak van de kras te berekenen, klikt u op 'image adjust' en 'color threshold', en wijzigt u in het vervolgkeuzemenu met het label 'threshold color' de waarde naar BNW binnen het color threshold-menu. Verschuif de onderste schuifregelaar volledig naar rechts om het beeld geheel zwart te maken, en stel vervolgens de bovenste schuifregelaar zo in dat er een maximaal contrast ontstaat tussen de kras en het cellfront.Verschuif de bovenste helderheidsschuif langzaam van links naar rechts totdat de contour van de kras duidelijk in het beeld zichtbaar is. Zodra de randen van de kras zijn geïdentificeerd, klikt u op 'more tools'. Selecteer in de Image J-werkbalk de 'MRI wound healing tool' uit het vervolgkeuzemenu en druk op de M-knop om het krasgebied te markeren en het berekende oppervlak weer te geven.Kopieer en plak in een pop-upvenster met resultaten alle getallen vanuit het resultatenvenster in een Excel-spreadsheet. Zorg ervoor dat de gegevens van individuele krassen gescheiden blijven. Nadat de cellen vier tot zeven uur hebben gemigreerd, wordt de procedure voor beeldverwerving voor de krassen herhaald; fotografeer de platen in dezelfde volgorde als waarin ze zijn gekrast, zodat de cellen op elke plaat een gelijke migratietijd hebben gehad.De cellen kunnen op meerdere tijdstippen worden afgebeeld, afhankelijk van hun gevoeligheid voor zowel temperatuur- als pH-veranderingen. De uiteindelijke beelden van de kras worden vervolgens geanalyseerd met Image J op dezelfde wijze als gedemonstreerd voor de initiële beelden van de kras. Krasgebieden kunnen ook worden berekend om de migratie te kwantificeren, indien correct.Confluentie is cruciaal voor het succes van de scratch-assay. Hier wordt een succesvolle scratch van muis long-MSC's bij 95% confluentie getoond. In contrast hiermee is een confluentie van 70% te laag voor een succesvolle scratch en kan dit leiden tot foutieve grenzen.Dit zijn representatieve originele beelden van vóór en na migratie, met de bijbehorende grenzen van het krasgebied zoals gedefinieerd door de beeldgevingssoftware. Deze grafieken tonen het gemiddelde berekende krasoppervlak in pixels voor elk van de vier krassen die zijn gemaakt in een plaat met murine long MSC's bij 95% confluentie, zowel vóór als na migratie bij blootstelling aan respectievelijk 0% of 4% sigarettenrookextract. Een vergelijking van de berekende gemiddelde verandering in krasoppervlak onthulde minder migratie van murine long MSC's na blootstelling aan 4% sigarettenrookextract.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de celconfluentie voor het specifieke celtype waarmee we werkten te optimaliseren en zorgvuldig te monitoren, en te oefenen met het aanbrengen van de krassen om ervoor te zorgen dat deze zo uniform mogelijk zijn. Na deze procedure kunnen andere technieken, zoals immunohistochemie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over veranderingen en eiwitexpressie die de celmigratie kunnen beïnvloeden.

optimization-wound-scratch-assay-to-detect-changes-murine-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video describes a non-contact co-culture wound healing assay to evaluate the migratory capacity of murine myoblasts. This helps to understand signal-sending and signal-receiving components of the paracrine non-canonical Wnt signaling interactions in vitro.

Wound Assay to Evaluate the Migratory Capacity of Murine Myoblasts in Co-Culture

Deze studie meldt twee verschillende methoden voor de analyse van de invasie van de cel en migratie: de bepaling van Boyden kamer en de in vitro video Microscoop gebaseerde wondgenezing bepaling. De protocollen voor deze twee experimenten worden beschreven, en hun voor- en nadelen worden vergeleken.

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.

Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Hier presenteren we een protocol om te evalueren van het effect van peptiden op de migratie van bronchiale epitheliale cellen. Deze methode zorgt voor de snelle en zeer reproduceerbaar accumulatie van kwantitatieve gegevens over de snelheid van cel migratie en wond sluiting.

Een roman In Vitro wond genezing Assay om te evalueren van de cel migratie

Hier beschrijven we een procedure om te testen de cel migratie in vitro met een geautomatiseerde optische camera Microscoop. De kras assay is wijd verbeid gebruikt wanneer de sluiting van de kras gedurende een ingestelde periode wordt gevolgd. De optische Microscoop kunt betrouwbare en goedkope detectie van cel migratie.

Kras Assay voor In Vitro testen van cel migratie met een geautomatiseerde optische Camera geoptimaliseerd

Deze studie richt zich op een in vitro model voor wond genezing (kras assay) als een mechanisme om te bepalen hoe milieu aanwezige contaminanten zoals arsenicum invloed cellulaire migratie. De resultaten tonen aan dat deze in vitro -assay snelle en vroege aanwijzingen van wijzigingen in cellulaire migratie vóór in vivo experimenten biedt.

In Vitro Kras Assay om aan te tonen van de gevolgen van arsenicum huid cel migratie

Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.

Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

We presenteren een kosteneffectieve methode om de scratch migratie test die een nieuwe aanpak voor het bepalen van celmigratie biedt zonder het gebruik van apparatuur-intensieve methoden. Terwijl fibroblasten werden gebruikt in dit protocol, kan het worden aangepast en gebruikt om extra celtypen en invloeden op celmigratie te bestuderen.

Een kosteneffectieve en aanpasbare scratchmigratietest

Door de integratie van interactie-ervaringsontwerp en analyse van gebruikersvereisten, introduceren we een innovatieve celschraper die cellulaire wondgenezingstesten verbetert in termen van reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid, bruikbaarheid, cellulaire integriteit en gebruikerservaring.

Een hulpmiddel om automatisch stabiele en reproduceerbare celvrije openingen te creëren voor het verbeteren van de betrouwbaarheid van de celwondgenezingstest

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

Hier beschrijven we een in vitro model voor het isoleren en differentiëren van luchtwegepitheelcellen van muizen, waarbij we ons richten op hun acclimatisatie aan chronisch sigarettenrookextract (CSE). Het model kan worden gebruikt om de multi-omics-impact van CSE uitgebreid te karakteriseren, wat mogelijk inzicht geeft in de cellulaire reacties onder chronische blootstelling aan rook.

In vitro model voor het bestuderen van differentiatie en veranderingen van multi-omics op muizen luchtwegepitheelcellen gestimuleerd met sigarettenrookextract

Leer een geoptimaliseerde scratch assay om migratieveranderingen in muizen long-mesenchymale stromale cellen te detecteren na schade door oplosbaar sigarettenrookextract. Deze methode biedt betrouwbare kwantitatieve metingen voor longregeneratief onderzoek.

Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract (Video) | JoVE Journal

Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

Meer video's verkennen