Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

Het algemene doel van deze test is om veranderingen in de migratiekracht van longmesenchymale stromale cellen na schade door oplosbaar sigarettenrookextract te detecteren. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in het veld van longregeneratieve biologie te beantwoorden, inclusief hoe de migratiekracht van longvoorlopercellen kan worden verbeterd om longherstel te ondersteunen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze is geoptimaliseerd om betere kwantitatieve metingen voor celmigratie te leveren, terwijl het nog steeds economisch uit te voeren en gemakkelijk aan te passen is.

In deze demonstratie wordt de scratch assay gebruikt om de migratiekracht van muis longmesenchymale stromale cellen, of MSC's, te kwantificeren. Na blootstelling aan oplosbaar sigarettenrookextract worden de MSC's gekweekt in compleet medium op platen van 60 millimeter en beschadigd zoals beschreven in de protocoltekst. Een geschikte confluentie is belangrijk voor de scratch assay omdat het ervoor zorgt dat de beeldverwerkingssoftware de randen van de snede correct kan identificeren.

Dit voorbeeld toont MSC's met 95% confluentie die geschikt zijn voor schrapen in een steriele omgeving. Verwijder het deksel van een plaat met beschadigde MSC's en leg een rechte rand, zoals een gesteriliseerde plastic liniaal, over de bovenrand van de plaat. Een rechte rand minimaliseert de hoeveelheid rotatieaanpassingen die nodig zijn voor de plaat wanneer deze later op de microscoopstandaard wordt geplaatst voor beeldvorming.

Zonder het medium te verwijderen, gebruikt u een steriele 200 microliter pipettentip, geleid door de steriele rechte rand, om vier parallelle sneden over de plaat te maken, ongeveer vijf millimeter uit elkaar en 50 millimeter lang. Het genereren van meerdere sneden op een 60 millimeter plaat verandert niet de micro-omgeving op een manier die de celmigratie voor MSC's beïnvloedt, maar kan een overweging zijn voor andere celtypen. Afzuiging van het medium en lichtjes wassen van de plaat met twee milliliter voorverwarmd compleet medium.

Dit voorkomt dat cellen zich hechten aan het centrum van de snede en verwijdert cellen die zijn losgemaakt door het schrappen. Vervang door vier milliliter vers compleet medium en gebruik een steriele, permanente marker om elke snede van één tot vier op de onderkant van de plaat te labelen op locaties die niet interfereren met de beeldvorming. De eerste beelden van elke snede moeten worden genomen omdat het belangrijk is dat beelden van dezelfde snede worden vergeleken vóór en na migratie, aangezien er variatie kan zijn in de snedebreedte.

Als de scratch assay op meerdere platen wordt uitgevoerd, wordt aanbevolen dat de eerste beelden van alle sneden op een enkele plaat worden genomen voordat sneden worden gemaakt op de volgende plaat. Gebruik een omgekeerde fasecontrastmicroscoop met een camera om de beelden te verkrijgen die nodig zijn voor analyse. Plaats de kweekplaat op de microscoop en gebruik het objectief met lage vergroting om de snede te lokaliseren.

Nummer één. Het is van cruciaal belang dat de snede volledig horizontaal op het scherm verschijnt terwijl de snede volledig horizontaal en in het midden van het gezichtsveld wordt gehouden, verkrijg zoveel beelden als nodig is om 90% van de lengte van de snede te omvatten. Verkrijg beelden van verschillende delen van de snede zonder overlapping tussen de beelden.

Neem geen beelden van de eerste en laatste 5% van de lengte van de snede omdat de breking van licht aan de randen van de kweekschaal de beelden overbelicht, waardoor ze onmogelijk te analyseren zijn. Sla beelden van snede, nummer één op in een map. Verkrijg beelden voor sneden twee, drie en vier op dezelfde manier, en sla beelden van elke snede op in een aparte map.

Breng de platen onmiddellijk na deze initiële beeldvorming terug naar de incubator. Laat de cellen vier tot zeven uur migreren voordat u begint met deze test. Download de Image J-software en installeer de wound healing tool-plugin.

Open het afbeeldingsbestand in Image J, klik vervolgens op proces en zoek randen om de cellen rond de snede voor de wound healing tool te markeren. Om het snedegebied te berekenen, klik op afbeelding aanpassen en kleurdrempel, en verander in het vervolgkeuzemenu gelabeld drempelkleur de waarde naar BNW binnen het kleurdrempelmenu. Verplaats de onderste schuifregelaar volledig naar rechts om de afbeelding volledig zwart te maken en pas vervolgens de bovenste schuifregelaar aan om maximaal contrast tussen de snede en celvoorkant te genereren.

Pas langzaam de bovenste helderheidsschuifregelaar van links naar rechts aan totdat de afbeelding het contour van de snede duidelijk weergeeft. Zodra de randen van de snede zijn geïdentificeerd, klikt u op meer tools. Selecteer in de Image J-werkbalk de MRI-wound healing tool uit het vervolgkeuzemenu en druk op de M-knop om het snedegebied te markeren en het berekende gebied uit te voeren.

In een uitklapbaar resultaatvenster kopieert en plakt u alle getallen uit het resultatenvenster in een Excel-spreadsheet. Zorg ervoor dat u gegevens van individuele sneden scheidt. Nadat de cellen vier tot zeven uur zijn gemigreerd, herhaalt u de procedure voor het verkrijgen van afbeeldingen voor de sneden, beeld de platen in dezelfde volgorde af waarin ze zijn geschraapt, zodat cellen op elke plaat gelijke tijd hebben gehad om te migreren.

De cellen kunnen op meerdere tijdstippen worden gefotografeerd, afhankelijk van hun gevoeligheid voor temperatuur- en pH-veranderingen. De uiteindelijke snedebeelden worden vervolgens geanalyseerd met Image J op dezelfde manier als gedemonstreerd voor de initiële snedebeelden. Snedegebieden kunnen ook worden berekend om migratie te kwantificeren, correct.

Confluentie is cruciaal voor het succes van de scratch assay. Een succesvolle snede van muis long MSC's bij 95% confluentie wordt hier getoond. In tegenstelling hiermee is een 70% confluentie te laag voor een succesvolle snede en kan het valse randen produceren.

Dit zijn representatie