Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

Het algemene doel van deze methodologie is om oplosbaar en onoplosbaar alfa-synucleïne te extraheren uit post-mortem Parkinson-hersenen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van de ziekte van Parkinson. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een relatief eenvoudige techniek is die gebruik maakt van gangbare laboratoriumreagentia en instrumenten.

Na het bereiden van de nodige oplossingen en buffers, begint u door een monster van 0,5 gram bevroren basale ganglia-weefsel op een kleine petrischaal te plaatsen. Gebruik een steriele scalpelmes om snel in fragmenten van één millimeter vierkant te snijden. Verzamel het gesneden weefsel in een buis van 15 milliliter en voeg 10 volumes ijskoud, 1X TBS toe aan de buis.

Homogeniseer de monsters met behulp van een mechanische homogenisator bij 20.000 rpm gedurende 10 seconden. Koel vervolgens twee minuten op ijs. Herhaal de homogenisatie drie keer, telkens koelend op ijs.

Centrifugeer het homogenaat bij 10.000 gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Breng het ruwe homogenaatsupernatant over naar polycarbonaat centrifugeerbuizen en centrifugeer gedurende een uur bij 100.000 gs bij vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar gekoelde buizen op ijs en bewaar dit als de TBS-oplosbare fractie.

Was in vijf volumes 1X TBS-buffer en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 100.000 gs bij vier graden Celsius. Aspibeer en gooi het supernatant weg. Herhaal vervolgens de wassing.

Grondig wassen van de pellets tussen ultracentrifugeringsstappen is cruciaal voor het succes van deze procedure. Nadat de monsters een temperatuur van 10 graden Celsius hebben bereikt om SDS-precipitatie te voorkomen, voegt u vijf volumes 1X TBS-SDS toe en resuspendeert het laatste pellet door 10 seconden te soniceren bij 20 kilohertz bij kamertemperatuur. Ultracentrifugeer gedurende 30 minuten bij 100.000 gs bij 25 graden Celsius.

Na ultracentrifugatie, brengt u het supernatant over naar gekoelde buizen op ijs en bewaart u dit als de SDS-oplosbare fractie. Voeg vijf volumes 1X TBS-SDS-buffer bij kamertemperatuur toe aan het pellet en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 100.000 gs bij 25 graden Celsius. Gooi de wasbuffer weg en herhaal de wassing.

Nadat het supernatant is weggegooid, voegt u 50 microliter 1X TBS-SDS-Urea toe en lost op met behulp van een sonicator ingesteld op 20 kilohertz gedurende 10 seconden. Label dit monster als de ureumoplosbare fractie. Het is essentieel om er zeker van te zijn dat alle onoplosbare eiwitten in de procedure worden geëxtraheerd.

Verdun TBS-SDS-Urea-monsters een-op-een met 1X TBS-buffer om compatibiliteit met eiwitanalysereagentia mogelijk te maken, en analyseer elke fractie op totaal eiwitgehalte met behulp van een commercieel eiwitanalysekit volgens het protocol van de fabrikant. Verdeel monsters in aliquoten van 20 microliter met 10% glycerol om toekomstige vries-dooicycli te verminderen, en bewaar bij min 80 graden Celsius. Laad 10 microliter van de TBS-, TBS-SDS- en TBS-SDS-Urea-extracten in een molecuulgewichtmarker op 10 putjes, vier tot 12 procent Bis-Tris-polyacrylamidegel met MOPS als lopende buffer volgens standaardtechnieken.

Laat de gel gedurende een uur bij 200 volt lopen, of totdat de blauwe kleurstof uit de laadbuffer de bodem van de gel heeft bereikt. Maak een nylonmembraan nat in 100% methanol en week vervolgens in transferbuffer met 20% methanol. Maak een markering op de blot om de eiwitzijde en de oriëntatie van de molecuulgewichtgroottemarkers te bepalen.

Leg de gel met het membraan naast nat filterpapier. Voer de overdracht gedurende twee uur uit bij 40 volt. Blokkeer de in 5% BSA-oplossing in 1X PBS-T gedurende 30 minuten met schudden bij 70 rpm om niet-specifieke binding van primaire antilichaam aan het membraan te voorkomen.

Probeer de eiwitblot door incubatie met zes milliliter van de primaire antilichaam Syn-1 alfa-synucleïne verdund tot 1 op 750 in PBS-T overnacht bij vier graden Celsius. Was de volgende dag het membraan drie keer met 1X PBS-T gedurende vijf minuten elke keer. Bewerk daarna de blot met het juiste HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam verdund tot 1 op 2000 in PBS-T gedurende 30 minuten.

Was het membraan zoals eerder met 1X PBS-T. Dompel de blots in een opgewaardeerde chemiluminescentie-oplossing volgens de instructies van de fabrikant in een donkere kamer. Bedek de blots met huishoudfolie en vang het signaal op met behulp van autoradiografie.

Na het beeldvorming, incubeer de western blot met zes milliliter western blot-stripbuffer gedurende 10 minuten met constant schudden om de blot van alfa-synucleïne-antilichaamsignaal te strippen. Herhaal de western blot-procedure om de membraan te sonderen met beta-actine primaire antilichaam bij een verdunning van 1 op 8000. Scan en zet het uiteindelijke beeld om in een Tiff-afbeelding en meet de dichtheden met behulp van NIH ImageJ voor kwantitatieve doeleinden.

De volgende afbeeldingen zijn representatieve immunoblots van alfa-synucleïne niveaus uit PD en controle humane basale ganglia weefsel. De TBS-, SDS- en ureumoplosbare fracties werden geanalyseerd op de aanwezigheid van alfa-synucleïne met behulp van westerse immunoblot. 10 milligram eiwit werd in elke laan geladen.

In de TBS-fractie zijn alfa-synucleïne monomeren in alle gevallen aanwezig. De asterisk vertegenwoordigt mogelijk een C-terminaal afgeknotte vorm van alfa-synucleïne. In de SDS-fractie zijn enkele oligomeren van alfa-synucleïne samen met monomeren te zien, aangegeven door de vaste pijlpunt in het PD-weefsel.

In de ureumfractie worden monomeren, oligomeren en geaggregeerde alfa-synucleïne variabel tot uiting in de PD-gevallen, wat hun respectieve Lewy-bodybelasting weerspiegelt. De neurologisch normale controlemonsters verton