Name: Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Leer chromatine immunoprecipitatie voor het identificeren van eiwit-DNA interacties in Arabidopsis. Deze methode onthult genregulatiemechanismen en kan worden aangepast voor andere plantensoorten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen The Plant Cell bedanken voor het toestaan van het gebruik van enkele gegevens die in dit tijdschrift zijn gepubliceerd om de representatieve resultaten hier beschreven in Figuur 4 uit te werken. Dit werk werd ondersteund door het EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), en door het Spaanse Ministerio de Economía y Competitividad (grants BIO2010-15589 en BIO2013-43098-R).

1. Verknoping van het plantenmateriaal (1 uur) <ol><li> Groeien de Arabidopsis-lijnen die in het experiment (wild type - WT - versus mutanten, en / of lijnen expressie de gecodeerde versie van het eiwit van interesse tot expressie lijnen versus het label niet gefuseerd aan een eiwit) gedurende 12-18 dagen op grote petrischalen (150 mm) met MS-agar medium (1 L: 1x Murashige &amp; Skoog zouten, 10 g sucrose, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% agar). Als alternatief, groeien planten op potten met 3: 1 mix van bodem en vermiculiet. LET OP! Formaldehyde is giftig bij inademing, aanraking met de huid, en moet in een chemische kap dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen worden behandeld. Stappen 1,2-1,6 moet onder de zuurkast worden uitgevoerd. </li><li> Maak kleine gaatjes in het deksel van de 50 ml buizen met een laboratoriumbrander verwarmde naald. Voeg 40 ml 1x PBS buffer en 1,08 ml formaldehyde tot een eindconcentratie van 1% (37% stock sresolutie). Verzamel in die 50 ml tubes 1,5 gram plantenmateriaal. Houd de buisjes op ijs tijdens verknopen. </li><li> Sluit de 50 ml buizen met deksel. Plaats de buizen in een exsiccator en toepassen vacuum. Vacuüm infiltreren het weefsel voor 10 min, laat dan het vacuüm voorzichtig, om te voorkomen dat karnen van de oplossing. Meng het monster. Herhaal tweemaal. Na infiltratie, acht het plantmateriaal en bevestigen dat het wordt licht doorschijnend en neigen te zinken naar de bodem van de buis (figuur 2). </li><li> Voeg 2,5 ml van 2 M glycine tot een uiteindelijke concentratie van 0,125 M. worden gerealiseerd vacuüm gedurende 5 min. Glycine werkt als een competitieve remmer van formaldehyde crosslinking. </li><li> Gooi de PBS formaldehyde-glycine-oplossing door het inverteren van de gesloten 50 ml buis met gaten in het deksel. </li><li> Tweemaal met 1x PBS en eenmaal spoelen met water plantjes werp de wasoplossing zoals beschreven in stap 1,5. Droog ze op een papieren handdoek en bevriezen in vloeibare nitrogen. OPMERKING: Bevroren weefsel kan bij -80 ° C worden bewaard weken. </li></ol> 2. Bereiding van antilichamen (1 dag) Opmerking: Voor immunoprecipitatie, wordt het gebruik van magnetische korrels geconjugeerd met antilichamen via een eiwit G of eiwit een linker met hoge affiniteit voor het constante domein van de zware keten antilichaam aanbevolen. De DNA-eiwitcomplexen kan niet-specifiek hechten aan het oppervlak van de beads-antilichaam conjugaten. Daarom is het noodzakelijk om controles uit te voeren zonder specifieke antilichamen tegen het niet-specifieke achtergrondbinding te kwantificeren. <ol><li> Voor elke immunoprecipitatie bereiden 15 ul van magnetische korrels in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Het aantal kralen afhankelijk van de hoeveelheid van het chromatine gebruikt voor immunoprecipitatie en ook de antilichamen. </li><li> Te wassen, voeg 1 ml chromatine immunoprecipitatie (ChIP) verdunningsbuffer om de kralen, meng door rotatie en plaats de 1,5 ml microcentrifuge tuin een magnetisch rek. Wacht ongeveer 1 minuut te laten de kralen hechten aan de magneet. Met de 1,5 ml microcentrifugebuizen nog in het rek, verwijder het supernatant door pipetteren. Herhaal tweemaal. OPMERKING: Voor iedere plant lijn immunoprecipitatie twee sets nodig: één met de kralen en antilichaam (Ab) en een tweede geen antilichaam (No-Ab) controle met slechts magnetische korrels. </li><li> Resuspendeer de kralen in 200 ul ChIP verdunningsbuffer. Voeg de vereiste hoeveelheid van de specifieke Ab een van de twee buizen voor ieder plantenlijn (de exacte verdunning verschilt per Ab en moet experimenteel worden geoptimaliseerd of, in het geval van commerciële antilichamen, de instructies van de fabrikant). Gebruik dit monster voor immunoprecipitatie. Voeg dezelfde hoeveelheid niet-specifieke IgG aan de andere buis, die zal worden gebruikt als negatieve controle. </li><li> Incubeer O / N op een draaiend wiel bij 4 ° C te laten de antilichamen hechten aan de kralen. </li></ol> 3. Chromatine Extraction (4 uur) </p&gt; <ol><li> Maal grondig het bevroren plantmateriaal in vloeibare stikstof met behulp van vijzel tot het poeder wordt homogeen en lichtgroen. Breng het poeder om een ​​nieuwe 50 ml buis. </li><li> Voor stappen 3,2-3,6, werk onder de zuurkast. Voeg 30 ml van Extractiebuffer 1 (ExB 1), en meng goed om het weefsel poeder weken. Vanaf deze stap, houd de monsters bij 4 ° C te allen tijde. Bevroren weefsel en vloeibare stikstof restjes zal de buffer te bevriezen. Zorg ervoor dat de bevroren weefsel volledig ontdooien door het omkeren van de buizen 4-5 keer om de 2 min. </li><li> Schakel de suspensie door deze door een filtratie weefsel met poriegrootte van 22-25 urn in een nieuwe 50 ml buis en centrifugeer bij 1000 xg deze gedurende 20 min bij 4 ° C. Opmerking: In deze stap worden de kernen en de organellen zullen pellet. ExB 1 bevat voldoende sucrose tot hoge dichtheid verschaffen en te voorkomen dat verstoring van organel structuur. </li><li> Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof door decanteren. Op dit staGE, zich aan een groene pellet van ongeveer 2 ml. </li><li> Resuspendeer de pellet in 5 ml ExB 2. Resuspensie van de pellet moeilijk op dit punt. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. OPMERKING: ExB 2 bevat 1% Triton X-100 om te helpen barsten de chloroplasten open en verwijder chlorofyl. </li><li> Resuspendeer de pellet in 300 pl extractiebuffer 3 (ExB 3). </li><li> In een schone microfugebuis, voeg 600 pl ExB 3. Neem de geresuspendeerde pellet uit stap 3,6 en combineer het voorzichtig bovenop de schone ExB 3. </li><li> Spin gedurende 1 uur bij 16.000 xg bij 4 ° C. OPMERKING: Deze stap helpt bij het verwijderen van het reinigingsmiddel uit het monster. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door afzuigen met een pipet. Resuspendeer de nucleaire pellet in 300 ui sonicatiebuffer door langzaam op en neer pipetteren om bellenvorming te vermijden, die sonicatie efficiëntie kunnen beïnvloeden. Zorgvuldig pipet uit de suspensie en overbrengen naar een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. LET OP: Dezebuffer bevat SDS, om de kernen lyseren en laat de chromatine. </li><li> Ultrasone trillingen van de schorsing van de kernen lyseren en willekeurig scheren het chromatine in kleine fragmenten. Gebruik sonicatie omstandigheden die chromatine verrijkt fragmenten tussen 200-800 bp (20-30 cycli met de instellingen 30 sec ON / OFF 30 sec bij 4 ° C voor de sonificatie-inrichting in de tabel van materialen / reagentia beschreven) maken. Controleer de efficiëntie van sonificatie door elektroforetische scheiding van de verkregen DNA-fragmenten op een agarosegel 13, laden 2 pl gesoniceerd chromatine (figuur 3). LET OP! Zorg ervoor dat het oor beschermingsmiddelen te dragen tijdens het sonicatie stap in het geval dat de echografie-apparaat niet is opgenomen in een geluiddichte kast. Cruciale stap! De chromatine fragmentatie is grotendeels afhankelijk van de ultrasoonapparaat apparatuur. De sonicatie voorwaarden moeten worden aangepast om verrijking bereiken in de geschikte DNA afmetingen. BekijkenFiguur 3 voor een voorbeeld van hoe de chromatine fragmentatie te optimaliseren. </li><li> Draai de oplossing eenmaal bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Breng de supernatant door pipetteren een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. Gooi de pellet. Neem 1/10 van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis, markeren als input en bevriezen bij -20 ° C. </li><li> Verdun het chromatine 10x met chip verdunning buffer te verdunnen SDS aan de uiteindelijke concentratie van 0,1%. Opmerking: De monsters kunnen worden ingevroren en opgeslagen bij -20 ° C gedurende enkele weken. </li></ol> 4. Immunoprecipitatie van het eiwit van belang en de Redding van DNA (1 dag, 3 uur) <ol><li> Was de korrels gecoat met Ab uit stap 2,4 driemaal met 1 ml ChIP verdunningsbuffer om overmaat antilichaam te verwijderen, zoals beschreven in stap 2.2. Hersuspenderen in 200 pl ChIP verdunningsbuffer. Voeg 50 ul van geïsoleerde chromatine. Incubeer O / N op een draaiend wiel bij 4 ° C. OPMERKING: Controleer de concentratiop het chromatine in microvolume UV-Vis spectrofotometer. 50 pl geïsoleerde chromatine zou meer dan 10 ug DNA bevatten. </li><li> Voor de stappen 4,2-4,5 werk in 4 ° C. Was de kralen tweemaal in 1 ml laag zout wasbuffer zoals beschreven in stap 2.2. </li><li> Was de korrels eenmaal in 1 ml High Salt wasbuffer. </li><li> Was de korrels eenmaal in 1 ml LiCl wasbuffer. </li><li> Was de kralen tweemaal in 1 ml TE-buffer. Na de laatste wasbeurt, zorg ervoor dat de TE-buffer links in de buis volledig te verwijderen door aspiratie met een pipet. </li><li> Haal de INPUT monsters (stap 3.9). Overdracht 5 pi van de invoer voor een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en verder zoals de ChIP monsters. Omgekeerde verknoping door toevoeging van 200 ul van 5% chelateringsionenuitwisselingshars en incubeer gedurende 10 min bij 95 ° C schudden elke 2-3 min. Spin neer op 16.000 xg gedurende 30 sec en de bovenstaande zorgvuldig te dragen naar een nieuwe microcentrifugebuis door pipetteren. OPMERKING: Terwijl de tranele werkwijze voor het verknopen omkering gaat om een ​​O / N incubatie met NaCl, de incubatie met een ion chelerende hars bij 95 ° C maakt efficiënte decrosslinking en elutie van DNA in 10 min, dus waardoor het protocol een dag korter. </li><li> Voeg 2 pl proteinase K (10 mg / ml) en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min om eiwitten te verteren en vrij DNA. </li><li> Stop de reactie door incubatie bij 95 ° C gedurende 10 min. </li><li> Snel draaien bij 16000 g gedurende 30 sec en overbrengen supernatant naar een nieuwe buis door pipetteren. </li><li> Reinig het DNA geïsoleerd met behulp van een standaard DNA-fragmenten zuiveringskit. OPMERKING: Ga volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Breng de DNA bindende kolom uit de kit een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Elueer het gezuiverde DNA door het toevoegen van 20 gl DNase-vrij water tot het midden van de kolom en centrifugeren bij 16.000 xg gedurende 60 sec. Stoppunt: monsters kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende enkele weken. </li></ol&gt; 5. Het meten van Overvloed van de bindingsplaatsen in de Immunologisch DNA door qPCR (4 uur) OPMERKING: DNA geïsoleerd uit het neergeslagen chromatine moet worden geanalyseerd om te bepalen welke DNA-fragmenten ChIP-ed zijn van de totale chromatine, vanwege de binding aan het eiwit van belang. <ol><li> Ontwerp van primers voor genoomgebieden plaats met een smelttemperatuur (Tm) van 60 ° C en een GC-gehalte van 30% -80%. Zoals chromatine gefragmenteerd door sonificatie, moet de lengte van de geamplificeerde sequentie niet meer dan 150-200 nucleotiden (tabel 1) zijn. LET OP: Een handig hulpmiddel voor primer ontwerp is Primer 3-programma (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Aanvullende richtlijnen voor primer ontwerp zijn beschikbaar in eerdere rapporten 8, 14,15. </li><li> Gebruik een BLAST programma om ervoor te zorgen dat de primers zijn specifieke (vooral promotors kan dit TF bindingssequenties delen) en test de primer efficiëntie using 01:10 verdunningen in water van de input DNA (stap 4.9). Bepaalde gebieden van het genoom beter dan anderen worden gezuiverd. Het is daarom belangrijk om PCR primers te ontwerpen en controleren van het verdunde ingang DNA. </li><li> Verdun het gezuiverde DNA 1:10 met water en Pipetteer 5 ul van de verdunde DNA in een PCR-buis voor elke reactie. OPMERKING: Verdun alleen de hoeveelheid nodig omdat DNA kan hechten aan de wanden van de 1,5 ml microcentrifuge buisjes. Multiple-ontdooien bevriezen cycli toename van het aantal aangesloten DNA-moleculen. Voor elk primerpaar, versterking in de ingang, Ab-chip en geen Ab-chip moet worden geanalyseerd. </li><li> Om de PCR mix af, voeg SYBR Green PCR Master Mix tot een uiteindelijke concentratie van 1x en 0,5 uM van elke primer. Vullen tot 20 ul met DNase-vrij water. </li><li> Voer de qPCR reactie volgens de instructies van de SYBR Green PCR master mix fabrikant. </li></ol> 6. Data Analysis OPMERKING: Onder de existing methoden voor de analyse ChIP-data, worden twee meest gebruikte. De eerste daarvan is de vouw verrijking methode, ook genoemd als &quot;relatieve verrijking &#39;,&#39; signaal over achtergrond&quot; of &quot;ten opzichte van de niet-antilichaamcontrole. De tweede methode wordt genoemd als &quot;% van de invoer&quot;. <ol><li> Data-analyse door voudige verrijking methode. <ol><li> Maak een spreadsheet met samples namen en ruwe Ct-waarden die zijn verkregen na qPCR reactie. </li><li> Voor elk monster af te trekken van zijn ruwe Ct-waarde van de ruwe Ct-waarde verkregen voor de overeenkomstige No-Ab controle. NB: Na deze wiskundige bewerking, zal Ct waarde voor No-Ab sample gelijk aan 0. </li><li> Bereken voudige verrijking met machtsverheffing bediening met base 2 en exponent (power) gelijk aan de negatieve rest verkregen in stap 6.1.2 (tabel 2). voudige verrijking = 2 - (Ct (monster) - Ct (No-Ab)) LET OP: In deze method de overvloed van een specifiek DNA-fragment in de ChIP-ed monster wordt vergeleken met de overvloed van dit fragment in No-Ab controle. De aanname van deze methode is dat het niveau van achtergrondsignaal reproduceerbaar verschillende primer sets, monsters en repliceren experimenten. Echter, dit&#39;noise&#39; signaal niveaus variëren tussen de primer sets, monsters, en experimenten. </li></ol></li><li> Data-analyse door% van de input-methode. <ol><li> Maak een spreadsheet met samples namen en ruwe Ct-waarden die zijn verkregen voor hen na qPCR reactie. </li><li> Pas ruwe Ct-waarden voor ingangsmonsters door het aftrekken van een waarde van 2 logaritme van de fractie van het totaal geëxtraheerde chromatine dat werd genomen als input. NB: In dit protocol is gelijk aan de afgetrokken waarde 3,32, als 10% van de totale chromatine werd genomen als input in dit protocol. Log 2 (10) gelijk aan 3,32. </li><li> Bereken% van de input door vermenigvuldiging met 100 de waarde van machtsverheffing bediening met base 2 en exponent (power) gelijk aan resterende aangepaste invoerwaarden afgetrokken van ruwe Ct-waarden van de steekproef (Tabel 3). % Van de input = 100 * 2 (aangepaste ingang - Ct (monster)) OPMERKING: Bij deze procedure wordt de relatie tussen specifieke DNA overvloed in het ChIP-ed monster op de totale geïsoleerde chromatine (ingangsmonster) berekend. Aanvullende informatie over ChIP gegevensanalyse u naar Haring et al. 8. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Andres, F., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+flowering+responses+to+seasonal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of flowering responses to seasonal cues.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).</li>
<li>Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+flowering+by+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Control of flowering by ambient temperature.</a> J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).</li>
<li>Jarillo, J. A., Piñeiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+is+everything+in+plant+development.+The+central+role+of+floral+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors.</a> Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).</li>
<li>Pajoro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%28r%29evolution+of+gene+regulatory+networks+controlling+Arabidopsis+plant+reproduction%3A+a+two-decade+history%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history.</a> J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).</li>
<li>He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+regulation+of+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromatin regulation of flowering.</a> Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).</li>
<li>Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling in plant development.</a> International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).</li>
<li>Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+protocol+for+studying+histone+modifications+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3, 11(2007).</li>
<li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+of+plant+transcription+factors+followed+by+sequencing+%28ChIP-SEQ%29+or+hybridization+to+whole+genome+arrays+%28ChIP-CHIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP).</a> Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).</li>
<li>Gomez-Mena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((early+bolting+in+short+days%3A+An+Arabidopsis+mutation+that+causes+early+flowering+and+partially+suppresses+the+floral+phenotype+of+leafy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy.</a> Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).</li>
<li>Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EARLY+BOLTING+IN+SHORT+DAYS+is+related+to+chromatin+remodeling+factors+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis+by+repressing+FT%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT.</a> Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).</li>
<li>Lopez-Gonzalez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-dependent+repression+of+the+Arabidopsis+floral+integrator+genes+involves+plant+specific+PHD-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins.</a> Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. , e3998(2012).</li>
<li>Wong, M. L., Medrano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+for+mRNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR for mRNA quantitation.</a> Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).</li>
<li>Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+formaldehyde+fixation+and+immunoprecipitation+technique+for+studying+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions.</a> Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).</li>
<li>Yu, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISTONE+DEACETYLASE6+interacts+with+FLOWERING+LOCUS+D+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+histone+H3+lysine+9+acetylation+and+dimethylation+in+Arabidopsis+reveals+correlation+between+multiple+histone+marks+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression.</a> Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).</li>
<li>Lafos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+H3K27+trimethylation+during+Arabidopsis+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation.</a> PLoS Genet. 7 (4), e1002040(2011).</li>
<li>Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+cells+and+isolation+of+high-quality+RNA+after+cryosectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning.</a> Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+genes+of+the+MADS+transcription+factor+SEPALLATA3%3A+integration+of+developmental+and+hormonal+pathways+in+the+Arabidopsis+flower%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower.</a> PLoS Biol. 7 (4), e1000090(2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De ChIP protocol beschreven is een reproduceerbare en krachtige techniek interacties tussen eiwitten en specifieke DNA-sequenties in vivo analyse in Arabidopsis planten. Een succesvolle identificatie van bindingsplaatsen voor de eiwitten van belang vereist een adequate selectie van plantaardige organen of ontwikkelingsstadia waar de relevante interacties daadwerkelijk plaatsvinden. Bovendien is het essentieel om de juiste fixatie van het plantenmateriaal en een optimale afschuiving van het chromatine door sonic...

De laatste jaren uiteenlopende genetische, moleculaire en genomische instrumenten ontwikkeld in het model species Arabidopsis thaliana. Deze technologie is enorm vergemakkelijkt de vooruitgang in het begrijpen van hoe de ontwikkeling van de plant wordt geregeld. Onder de ontwikkelingsprocessen bestudeerd met behulp van Arabidopsis als een model, heeft de genetische controle van de bloeitijd is uitvoerig geanalyseerd. Deze studies hebben aangetoond dat planten moduleren zeer nauwkeurig het tijdstip van bloei in reactie op endogene signalen zoals hormonen en de leeftijd van de plant, en ook voor het milieu signalen zoals fotoperiode en temperatuur die synchroniseren bloeitijd met de natuurlijke cyclus van de seizoenen 1, 2. De isolatie en karakterisering van Arabidopsis mutanten met veranderingen in de tijd van de bloei is in de onthulling van een complex netwerk van genen die de bloeitijd te regelen in reactie op endogene en omgevingsfactoren bepalend geweest. Deze genetische circuitsgeïntegreerd op het niveau van een paar meester genen die fungeren als schakelaars van de bloei, en de exacte timing van de bloemen initiatie is afhankelijk van het saldo van de bloei bevorderen en het onderdrukken van activiteiten die stroomopwaarts van de bloemen integrator genen 1,3 werken. De functionele karakterisering van genen die voor hun rol in de controle van de bloei initiatie, geholpen door het recente gebruik van genomische benaderingen gebleken de centrale rol van transcriptionele regulatie bij de modulering van de bloeitijd. In feite zijn veel van de meester genen bloeiende coderen transcriptiefactoren 4. Daarnaast is een aantal chromatine hermodellering eiwitcomplexen invloed op de expressie van genen meester van de bloei. Een aantal van de Arabidopsis mutanten die veranderde hun bloeitijd bleek mutaties in genen die coderen voor verschillende chromatine modifiers dragen. Verschillende chromatine remodelers die posttranslationele modificaties in histon introducerene staarten, herpositioneren nucleosomen ten opzichte van het DNA of wisselen canonieke histonen door histone varianten nodig voor de goede regulering van de bloei in Arabidopsis 5,6. Sommige chromatine hermodellering activiteiten katalyseren de afzetting of verwijdering van covalente modificaties zoals acetylering of methylatie specifieke histon residuen. Deze histon markeringen worden specifiek herkend door gespecialiseerde effectoren dat andere chromatine remodeling complexen, transcriptiefactoren of onderdelen van de transcriptie machinerie te werven om de transcriptionele activiteit van bloeiende genen reguleren. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) mogelijk maken om in vivo DNA-bindingsplaatsen voor eiwitten van belang (figuur 1). Deze procedure maakt gebruik van het vermogen van bepaalde chemische stoffen te verknopen de eiwitten aan het DNA. De resulterende DNA-eiwitcomplexen kan vervolgens worden geïmmunoprecipiteerd met specifieke antilichamen against transcriptiefactoren, chromatine-bindende eiwitten, of specifieke modificaties en heterologe epitopen (gewoonlijk aangeduid als &quot;markeringen&quot;) bevestigd aan het eiwit van keuze. Het DNA gezuiverd uit deze immunologische neerslagen kunnen worden gebruikt als een matrijs in kwantitatieve PCR (qPCR) reacties beoordelen voor verrijking van specifieke sequenties van belang. Zo kunnen de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren of de verdeling van histon merken bepaalde genen worden vastgesteld 7,8. Bovendien, in combinatie met Next Generation Sequencing (NGS) dat massieve parallelle sequentiebepaling mogelijk maakt chiptechnologie is mogelijk genoom-brede identificatie van de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren en onthulling epigenomisch landschappen van histon wijzigingen. Verder is de gelijktijdige analyse van genexpressie voor het bewaken hoe de binding van transcriptiefactoren of de depositie van specifieke histon markeringen gecorreleerd met transcriptionele activity van genen 9. Het gebruik van ChIP protocollen Arabidopsis is toegestaan ​​evaluatie van het effect dat verschillende transcriptionele regulatoren hebben voor de organisatie van de chromatinestructuur meester genen van bloei en hoe deze structurele veranderingen beïnvloeden genexpressie 5,6. Eerdere resultaten toonden aan dat de Arabidopsis locus EARLY builen IN korte dagen (EBS) fungeert als een repressor van bloei en mutanten in dit gen tonen een versnelling van bloei en opregulatie van de meester-gen van de bloei FT. Verder verlies-van-functie mutaties in FT volledig onderdrukken van de vroege bloei fenotype van de EBS mutante planten, wat aangeeft dat FT nodig is voor de voortijdige ontplooiing van EBS mutanten en dat EBS is voor de onderdrukking van deze meester gen van de bloei 10 , 11. EBS codeert voor een PHD-bevattend eiwit dat specifiek kan binden histon H3 di- en trigemethyleerd in the 4 lysine residu (H3K4me2 / 3), suggereert een rol voor EBS in de chromatine-gemedieerde repressie van FT 12. Het gebruik van de ChIP aanpak aangetoond dat de Arabidopsis-PHD bevattend eiwit EBS 10,11 bindt regulerende gebieden van de florale integrator gen FT haar uitspraken 12 onderdrukken. Aanvullende gegevens verkregen door toepassing van chiptechnologie toonde aan dat dit eiwit vereist is om lage niveaus van histone acetylering, een kenmerk van actieve transcriptie in het chromatine van deze meester gen van bloeiende behouden tijdens de initiële stadia van ontwikkeling Arabidopsis. Deze waarnemingen tezamen met genetische en genexpressie data aantonen dat Arabidopsis PHD-bevattende eiwit een centrale rol in de fijnafstelling van bloeitijd door het moduleren van de expressie van het gen floral integrator 12 FT. De hier gepresenteerde werk geeft een geoptimaliseerde werkwijze niet alleen bruikbaar voor de analyse van histonen, maar ook voor anderechromatine-geassocieerde eiwitten, en met een verhoogde efficiëntie en minder experimenteel tijd. Voorts is dit verslag illustreert hoe het gebruik van ChIP protocols nieuwe inzichten voorziet in de relatie tussen veranderingen in chromatine modificaties en transcriptionele toestanden van plantengenen, en hoe deze chromatine-gemedieerde controlemechanismen effect genexpressie op het begin van de bloei in Arabidopsis.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 37%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775-25</td><td>Gebruik onder de afzuigkap</td></tr><tr><td>Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-vrij, EASYpack</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Standard sonicatieapparaat</td><td>Diagenode</td><td>B01010002 (UCD200TO)</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads magnetische kralen gekoppeld met proteïne A of proteïne G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D/10001D</td><td>Controleer de handleiding van de fabrikant voor de affiniteit van het antilichaam</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution</td><td>Life Technologies</td><td>85112</td><td></td></tr><tr><td>(muis, rat, konijn&hellip;)-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15400001, C15420001, C15410206</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische houder - DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>H3K9/14ac polyklonaal antilichaam - Premium&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C15410200-10</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Resin</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life Technologies</td><td>17916</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc Tag Antilichaam, clone 4A6</td><td>Millipore</td><td>05-724</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van arabidopsis eiwit-dna interacties<em&gt; in vivo</em

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Ingewikkelde gen-regulerende netwerken orkestreren biologische processen en ontwikkelingsovergangen in planten. Selectieve transcriptionele activering en silencing van genen bemiddelen de respons van planten op omgevingssignalen en ontwikkelingssignalen. Daarom zijn inzichten in de mechanismen die de genexpressie van planten regelen essentieel om een diepgaand begrip te krijgen van hoe biologische processen in planten worden gereguleerd. De hier beschreven chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) techniek is een procedure om de DNA-bindende sites van eiwitten in genen of genomische regio's van de model-soort Arabidopsis thaliana te identificeren. De interacties met DNA van eiwitten van belang zoals transcriptiefactoren, chromatine-eiwitten of post-translationeel gemodificeerde versies van histonen kunnen efficiënt worden geanalyseerd met het ChIP-protocol. Deze methode is gebaseerd op de fixatie van eiwit-DNA interacties in vivo, willekeurige fragmentatie van chromatine, immunoprecipitatie van eiwit-DNA complexen met specifieke antilichamen, en kwantificering van het DNA geassocieerd met het eiwit van belang door PCR-technieken. Het gebruik van deze methodologie in Arabidopsis heeft significant bijgedragen aan het onthullen van transcriptionele regulatoire mechanismen die een verscheidenheid aan biologische plantenprocessen regelen. Deze aanpak maakte de identificatie mogelijk van de bindingsplaatsen van het Arabidopsis chromatine-eiwit EBS naar regulatoire regio's van het master-gen van bloei FT. De impact van dit eiwit op de accumulatie van specifieke histonmarkeringen in de genomische regio van FT werd ook onthuld door middel van ChIP-analyse.

Acht belangrijke stappen kunnen uitgevoerd worden uitgekozen in dit ChIP protocol voor het identificeren van in vivo eiwit-DNA-interacties, waaronder kweken en oogsten van plantenmateriaal, verknoping van chromatine, chromatine isolatie, chromatine fragmentatie, selectieve isolatie van de complexen tussen DNA en het eiwit van belang door immunoprecipitatie, eiwitvertering, DNA-zuivering, en qPCR analyse (Figuur 1). Een cruciale stap in de ChIP protocol is de fixatie van DNA-eiwit interacties in...

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Het algemene doel van deze procedure is om interacties tussen eiwitten en DNA in het chromatine van arabidopsiscellen te onthullen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de plantbiologie, zoals welke genen worden gereguleerd door een bepaalde transcriptiefactor, of welke systeemmodificaties geassocieerd zijn met een transcriptionele status van genen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het, door de cross-linkingstap, mogelijk is om veranderingen in de chromatinestructuur die optreden tijdens de plantontwikkeling te fixeren en vast te leggen.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in eiwitinteracties in arabidopsis thaliana, kan deze ook worden toegepast op verschillende plantenordes en worden aangepast aan andere plantensoorten. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dorota Komar en Alfonso Mouriz, twee promovendi in ons laboratorium. Nadat de arabidopsis volgens het tekstprotocol is gekweekt, verzamelt u 1,5 gram plantmateriaal in 50 milliliter buizen en houdt u deze op ijs tijdens het cross-linken.Gebruik vervolgens een met een laboratoriumbrander verhitte naald om kleine gaatjes in de doppen van de buisjes te maken. Voeg 40 milliliters 1x pbs en 1,08 milliliters formaldehyde toe aan de buisjes. Draai de doppen op de buisjes en plaats de buisjes in een exsiccator.Vacuumeer gedurende 10 minuten en laat vervolgens voorzichtig het vacuüm lossen om te voorkomen dat de oplossing wordt opgeklopt. Herhaal de vacuüm- en mengstappen na het mengen van het monster. Controleer na infiltratie het plantmateriaal en bevestig dat het licht doorschijnend wordt en naar de bodem van de buis zinkt.Voeg 2,5 milliliters van twee molar glycine toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,125 molar en pas gedurende vijf minuten vacuüm toe. Gooi na het opheffen van het vacuüm de oplossing weg door de buisjes om te keren en de vloeistof door de gaatjes in de doppen te laten druppelen. Gebruik pbs om de plantlets twee keer te spoelen en spoel daarna één keer met water.Droog vervolgens de plantlets op een papieren handdoek voordat ze met vloeibare stikstof worden ingevroren. Bereid per immunoprecipitatie 15 µL magnetische beads voor in een 1,5 ml microcentrifugebuisje. Voeg één ml chromatin immunoprecipitatie- of ChIP-verdunningsbuffer toe aan de beads, meng door middel van rotatie en plaats het 1,5 ml microcentrifugebuisje in een magnetisch rek.Laat de beads ongeveer een minuut aan de magneet hechten en gebruik vervolgens een pipetman om het supernatant te verwijderen voordat de wasstap wordt herhaald. Resuspendeer de beads in 200 µL chip dilution buffer. Voeg voor immunoprecipitatie de vereiste hoeveelheid van het specifieke antilichaam toe aan één van de twee buisjes die voor elke plantblind zijn klaargezet.Een cruciale factor voor een succesvol chip-experiment is het gekozen antilichaam voor de immunoprecipitatie van het eiwit van belang. Antilichamen die tegen plantentranscriptiefactoren zijn ontwikkeld, kunnen nuttig zijn voor chip-experimenten, maar het serum moet grondig worden getest. Antilichamen die bijvoorbeeld alleen zijn gecontroleerd via Western blot-analyse, zijn niet noodzakelijkerwijs geschikt voor chip.Voeg als negatieve controle dezelfde hoeveelheid niet-specifieke IGG toe aan de tweede buis. Incubeer de buisjes een nacht bij vier graden Celsius op een draaiwheel om de antilichamen aan de beads te laten binden. Maal het bevroren plantmateriaal met een vijzel en stamper grondig in vloeibare stikstof totdat het poeder homogeen en lichtgroen is.Breng het poeder over naar een nieuwe buis van 50 milliliter. Voeg onder een zuurkast 30 milliliter extractiebuffer één toe en meng goed om het weefselpoeder te weken. Houd de monsters vanaf deze stap te allen tijde op vier graden Celsius en zorg ervoor dat het weefsel volledig is ontdooid voordat u verdergaat.Klaar de slurry door deze door een filtratieweefsel met een poriegrootte van 22 tot 25 micrometers in een nieuwe buis van 50 milliliter te filteren. Centrifugeer vervolgens bij 1.000 ×g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Decanteer voorzichtig het supernatant van de pellet, die een volume van ongeveer twee milliliter moet hebben.Resuspendeer het pellet met vijf milliliter extractiebuffer twee. Centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 1.000 ×g en vier graden Celsius. Giet het supernatant af en resuspendeer het pellet in 300 microliter extractiebuffer drie.Voeg in een aparte buis 600 µL extractiebuffer drie toe en breng het resuspendeerde pellet vervolgens voorzichtig aan bovenop de schone buffer. Centrifugeer de buis gedurende één uur bij 16.000 ×g bij 4 °C, waarna het supernatant met een pipet wordt afgezogen. Gebruik vervolgens 300 µL sonicatiebuffer om het nucleair pellet langzaam te resuspenderen, waarbij beluchtingsvorming moet worden vermeden, aangezien dit de efficiëntie van de sonicatie kan beïnvloeden.Breng de suspensie zorgvuldig over naar een schone buis van 1,5 milliliter. Sonicate de suspensie om de kernen te lyseren en het chromatine willekeurig op te delen in fragmenten van 200 tot 600 baseparen. Verifieer de grootte van de DNA-fragmenten op een agarosegel en centrifugeer de oplossing vervolgens 10 minuten bij 12.000 ×g en vier graden Celsius.Breng het supernatant over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter en verwijder de pellet. Verdeel een tiende van het supernatant over een nieuwe buis en label deze als 'input' vóór het invriezen bij min 20 graden Celsius. Maak tot slot een tienvoudige verdunning van het chromatine in chip-verdunningsbuffer om een uiteindelijke SDS-concentratie van 0,1 procent te bereiken.Monsters kunnen vervolgens worden ingevroren en gedurende enkele weken bij min 20 graden Celsius worden bewaard. Nadat de beads een nacht met antilichamen zijn geïncubeerd, wordt één milliliter chip-dilutiebuffer gebruikt om de beads drie keer te wassen; resuspendeer de beads vervolgens in één milliliter van het verdunde chromatine en incubeer de buis een nacht op een roteerwiel bij vier graden Celsius. Plaats de beads de volgende dag op het magnetische rek bij vier graden Celsius en gebruik, na het verwijderen van de vloeistof, één milliliter laag-zout wasbuffer om de beads twee keer te wassen, gevolgd door één keer wassen met hoog-zout wasbuffer.Nadat de beads één keer zijn gewassen met één milliliter lithiumchloride-wasbuffer, worden de beads twee keer gewassen met één milliliter TE-buffer. Aspireer om de TE-wasbuffer grondig te verwijderen. Zodra de inputmonsters zijn ontdooid, brengt u vijf microliters van elk over in nieuwe 1,5 milliliter buisjes en behandelt u deze vanaf dit punt op dezelfde wijze als de chipmonsters.Keer de cross-linking om door 200 µL vijf procent chelerend ionenuitwisselingshars toe te voegen en incubeer dit gedurende 10 minuten bij 95 °C, waarbij elke twee tot drie minuten wordt geschud. Centrifugeer 30 seconden bij 16.000 ×g en breng het supernatant voorzichtig over in nieuwe microcentrifugebuisjes. Voeg 2 µL protonase K (10 mg/mL) toe en incubeer 30 minuten bij 37 °C om eiwitten te verteren en het DNA vrij te maken.Om de reactie te stoppen, wordt het mengsel 10 minuten geïncubeerd bij 95 °C. Centrifugeer vervolgens kort bij 16 000 ×g gedurende 30 seconden en breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Na het zuiveren van het DNA volgens het tekstprotocol, wordt dit 1:10 verdund met water. Gebruik vijf µL per reactie om de abundantie van bindingsplaatsen via qPCR te meten. Analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol.Bladeren van Aribidopsis zijn bedekt met waslagen en trichomen bevorderen de vorming van luchtbellen, waardoor het voor cross-linking reagentia moeilijk is om het plantenweefsel te penetreren. Hier worden cross-linked zaailing-monsters getoond die via vacuüm-cross-linking zijn behandeld om de fixatie-efficiëntie te verhogen. Deze figuur demonstreert dat een toenemend aantal sonicatiecycli de gemiddelde grootte van het DNA in chip-monsters geleidelijk vermindert, waarbij de optimale verrijking in het bereik van 200 tot 600 basenparen wordt bereikt na 20 tot 30 cycli, zoals hier wordt aangetoond.Zoals in deze figuur te zien is, zijn vier regio's die belangrijk zijn voor de transcriptionele regulatie van de FT-locus, een mastergen voor bloei, gekozen voor de analyse. Chip-resultaten tonen aan dat het EBS-eiwit bond aan een van de vier geteste regio's, een regulerende sequentie dicht bij de transcriptionele startplaats van FT. Ten slotte onthulden chip-assays, uitgevoerd met een antilichaam gericht tegen histon h3 geacetyleerd op lysines negen en 14, wat correleert met transcriptioneel actief chromatine, een hogere abundantie van H3K9/14ac in DBS-mutanten vergeleken met wildtype planten in alle vier de geteste genomische fragmenten van FT, wat consistent is met de waargenomen upregulatie van dit mastergen voor bloei in deze mutant. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in twee dagen worden voltooid mits correct uitgevoerd.Het volgen van deze procedure, samen met andere maatregelen zoals genexpressieanalyse, kan bijdragen aan het beantwoorden van andere vragen, zoals: Wat is de biologische rol van de binding van het eiwit aan DNA? Vindt dit plaats bij transcriptionele activatie of repressie? En welke histonmodificaties zijn hiermee geassocieerd?Na de ontwikkeling heeft deze techniek onderzoekers op het gebied van plantepigenetica de weg vrijgemaakt om chromatinetoestanden in onze reductieve cellen te onderzoeken. Dit kan worden uitgebreid naar andere plantensoorten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de binding van uw arabidopsis-eiwit van belang aan DNA in vivo kunt analyseren.Vergeet niet dat het werken met 2-methoxyethanol, formaldehyde of sonicatiereagentia, pathogenen en stammutaties extreem gevaarlijk kan zijn, en dat voorzorgsmaatregelen zoals beschermende kleding, handschoenen of gehoorbescherming altijd moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-identification-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Imprinting is een fenomeen in plant en zoogdier reproductie. DNA-methylatie speelt een belangrijke rol in de mechanismen van imprinting. Isoleren endosperm en het bepalen van methylatie status van de ingeprente genen...

Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm

Een betrouwbare en bruikbare benadering van de histon-modificaties op specifieke plantengenen te detecteren is beschreven. De aanpak combineert chromatine immunoprecipitatie (chip) en real-time kwantitatieve PCR. Het maakt de ontdekking van histon-modificaties op specifieke genen met een rol spelen in verschillende fysiologische processen.

Detectie van histon Wijzigingen in bladeren

We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

This video describes protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, which is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions.This technique is used to identify target genes in human chronic lymphocytic leukemia cells.

Chromatin Immunoprecipitation Assay: A Technique to Study Protein-DNA Interactions in Cells

In this video, we demonstrate the chromatin immunoprecipitation technique to identify protein binding sites on specific regions of the genomic DNA of oligodendrocyte precursor cells via the selective immunoprecipitation of protein-bound chromatin fragments. This method helps to study the interaction of several regulatory proteins, including transcription factors involved in gene regulation.

Chromatin Immunoprecipitation to Identify Target Protein Binding Sites on Genomic DNA

Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling...

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van het proximity-labeling (PL)-experiment in komkommer (Cucumis sativus L.) met behulp van AT4G18020 (APRR2)-AirID-eiwit als model. De methode beschrijft de constructie van een vector, de transformatie van een construct door agro-infiltratie, biotine-infiltratie, eiwitextractie en zuivering van biotine-gelabelde eiwitten door middel van affiniteitszuiveringstechniek.

AirID-gebaseerde nabijheidsetikettering voor eiwit-eiwitinteractie in planten

Leer chromatine immunoprecipitatie voor het identificeren van eiwit-DNA interacties in Arabidopsis. Deze methode onthult genregulatiemechanismen en kan worden aangepast voor andere plantensoorten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties

Meer video's verkennen