Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis

Het algemene doel van deze extracellulaire fluxanalyse is om de metabole kenmerken van naïeve, M1- en M2-gepolariseerde macrofagen uit het beenmerg te beoordelen. Deze methode kan dienen als kader voor het onderzoeken van hoe specifieke cytokinen, verbindingen of genocodes het metabole fenotype van macrofagen beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er slechts een kleine hoeveelheid macrofagen nodig is.

Bovendien meet het alle relevante glycolyse- en mitochondriële parameters in één enkele assay. Hoewel deze methode inzicht biedt in het metabole fenotype van uit beenmerg afgeleide macrofagen, kan deze ook worden toegepast op alle typen macrofagen of immuuncellen. We hadden het idee om deze methode in J te publiceren, aangezien we regelmatig verzoeken ontvangen van andere wetenschappers om hen te helpen bij hun cellulaire flux-assays voor metabole toegang. Controleer op dag acht van de cultuur de aanwezigheid van volwassen macrofagen door visuele inspectie en incubeer de volwassen uit beenmerg afgeleide macrofagen gedurende vijf minuten in 10 milliliters citraatsaline.

Incubeer bij 37 °C totdat de cellen zijn losgekomen. Was de cultuur met 10 milliliters PBS en tel het aantal levensvatbare cellen. Zaai vervolgens 5 × 10⁴ cellen per well.

In een XFE 96 celkweekmicroplaat in 100 µL kweekmedium per putje, waarbij de pipet in een hoek ongeveer halverwege de wand van elk putje wordt gehouden. Voeg voor het dispenseren van de cellen alleen medium toe aan de putjes voor achtergrondcorrectie A1, A12, H1 en H12. Laat de cellen vervolgens één uur lang bezinken bij kamertemperatuur in een steriele celkweekkap.

Na het bevestigen van de adhesiecultuur worden de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide geplaatst. Drie uur na het uitplaten worden, afhankelijk van de behoefte, tussen de vier en zes putjes met cellen per conditie gedurende 24 uur gestimuleerd. Om de uit het beenmerg afgeleide macrofagen te polariseren op de dag vóór de extracellular flux assay, wordt de sensorkartridge ondersteboven naast de hulptray geplaatst en wordt elk putje van de tray gevuld met 200 µL crin-oplossing.

Laat vervolgens de sensorkit op de hulp plaat zakken om de sensoren in de Cain-oplossing onder te dompelen en controleer of het niveau van de Cain-oplossing hoog genoeg is om de sensor ondergedompeld te houden. Plaats de kit vervolgens gedurende de nacht in een incubator van 37 degrees Celsius zonder kooldioxide. Verwijder de volgende dag voorzichtig het supernatant van de gepolariseerde macrofagen en was de cellen met 100 microliters vers bereide assay.

Medium per putje. Voeg 180 µL assay-medium toe aan elk putje en gebruik de microscoop om te controleren of de cellen niet zijn weggespoeld. Als de cellen nog vastzitten, plaats dan de plaat een uur voor het uitvoeren van de assay in de incubator van 37 °C zonder CO₂ terwijl de cellen incuberen.

Bereid 10 x mengsels van injectieverbindingen voor zoals aangegeven in de tabel en verwarm de mengsels tot 37 °C. Laad vervolgens de sensorkartridges met de juiste volumes van de verbinding en poorten A, B, C en D met behulp van de meegeleverde laadhandleidingen om de bio-energie van de gepolariseerde macrofagen te karakteriseren via een extracellulaire flux-assay. Gebruik de assay-wizard om een assay-sjabloon te maken met mengtijden van twee minuten en meettijden van drie minuten, en ten minste drie meng- en snelheidsmetingscycli vóór elke van de vier injecties en na de laatste injectie.

Start vervolgens de analyse en volg de instructies van het apparaat. Plaats de cassetteplaat met de gehydrateerde probes om kalibratie door het apparaat en de celplaat mogelijk te maken. Gooi aan het einde van de analyse, wanneer u hiertoe wordt aangespoord, voorzichtig al het analysemedium weg en bewaar de geanalyseerde celcultuur-microplaat bij minus 20 °C tot de normalisatie.

Om de cellen te normaliseren met behulp van de celproliferatie-assaykit, ontdooi de plaat en incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in 200 µL vers bereide cellysisbuffer per putje. Meet vervolgens de fluorescentie bij excitatiemaxima van ongeveer 480 nm en emissiemaxima van ongeveer 520 nm. Gebruik de verkregen fluorescentiemetingen om de ratio te berekenen waarbij het gemiddelde celgetal van alle naive macrofaagputjes op één wordt gesteld, en exporteer deze ratio's vervolgens naar de Seahorse Wave-analysesoftware.

Om de gegevens te normaliseren, zal een extracellulaire flux-assay doorgaans plots van de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en de zuurstofconsumptiesnelheid (OCR) opleveren; zoals gedemonstreerd in deze representatieve figuur vertegenwoordigt de waargenomen stijging in ECAR na de injectie van glucose de glycolysesnelheid. De aanvullende stijging waargenomen in de ECAR na inhibitie van de ATP-synthase met oligomycine verschaft verdere informatie over de glycolytische reserve en capaciteit. Bij de analyse van de OCR-waarden faciliteert de injectie van CIN de berekening van het zuurstofverbruik dat wordt gebruikt voor mitochondriële ATP-synthese, terwijl FCCP de mitochondriële respiratie ontkoppelt.

De overeenkomstige OCR-metingen leveren gegevens op over de maximale en reserve respiratoire capaciteit; rotaconon en antimycine a-injectie blokkeren echter de mitochondriale complexen één en drie, waarbij de resterende OCR de niet-mitochondriale zuurstofconsumptie vertegenwoordigt. Macrofagactivatie met LPS induceert een verhoogd glycolytisch metabolisme. De verschillen tussen met LPS en IL-4 behandelde macrofagen worden nog duidelijker wanneer de zuurstofconsumptiesnelheden worden waargenomen.

Inderdaad, terwijl het maximale oxidatieve metabolisme sterk onderdrukt is in LPS-behandelde macrofagen, induceert IL-4 een robuuste respiratie in M2-macrofagen. Zodra de techniek beheerst is, kan de extracellulaire flux-assay in twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat vet samen met FCCP moet worden geïnjecteerd om de maximale respiratie bij ontkoppeling te stimuleren.

Na deze techniek kunnen aanvullende assays, zoals Eliza, worden uitgevoerd om de efficiëntie van de macrofaagpolarisatie te beoordelen. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers uit het veld van de immunologie om de metabole kenmerken van een breed scala aan immuuncellen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van extracellulaire fluxanalyse om het metabole fenotype van macrofagen te beoordelen.