Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis
28 november 2015
Metabolische herprogrammering is een kenmerkend en vereist kenmerk voor M1 en M2 macrofaagpolarisatie. Dit manuscript beschrijft een test voor de meting van fundamentele parameters van glycolyse en mitochondriale functie in muis-beenmerg-afgeleide macrofagen. Deze tool kan worden toegepast om te onderzoeken hoe bepaalde factoren het metabolisme en fenotype van macrofagen beïnvloeden.
Het algemene doel van deze extracellulaire fluxanalyse is om de metabole kenmerken van naieve M1 en M twee gepolariseerde beenmerg-afgeleide macrofagen te beoordelen. Deze methode kan dienen als een raamwerk voor het onderzoeken hoe bepaalde cytokinen, verbindingen of gencodes het metabole fenotype van macrofagen beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het slechts een kleine hoeveelheid macrofagen vereist.
Bovendien meet het alle relevante glycolyse- en mitochondriale parameters in één enkele test. Hoewel deze methode inzicht biedt in het metabole fenotype van beenmerg-afgeleide macrofagen, kan deze ook worden toegepast op alle soorten macrofaag- of immuuncellen. We hadden het idee om deze methode in J te publiceren omdat we regelmatig verzoeken ontvangen van andere wetenschappers om hen te helpen met hun metabolische toegang tot cellulaire flux-assays Op dag acht van de cultuur, controleer de aanwezigheid van volwassen macrofagen door visuele inspectie en incubeer de volwassen beenmerg-afgeleide macrofagen in 10 milliliter citraat-zoutoplossing gedurende vijf minuten.
Bij 37 graden Celsius wanneer de cellen zijn losgelaten. Was de cultuur met 10 milliliter PBS en tel het aantal levensvatbare cellen. Zaai vervolgens vijf keer 10 tot de vierde cellen per put.
In een XFE 96 celcultuur, microplaat in 100 microliters cultuurmedium per put, houd de pipette ongeveer halverwege de zijkant van elke put. Om de cellen te doseren, voegt u alleen medium toe aan de achtergrondcorrectieputten A een, A 12, H een en H 12. Laat de cellen vervolgens een uur bij kamertemperatuur bezinken in een celcultuurkap.
Na bevestiging van de aanhechting, de cellen in een 37 graden Celsius 5% koolstofdioxide incubator. Drie uur na het plateren, stimuleer tussen vier tot zes putten cellen per conditie zoals geschikt voor 24 uur. Om de beenmerg-afgeleide macrofagen de dag voor de extracellulaire flux-assay te polariseren, plaatst u de sensorcartridge ondersteboven naast de hulpplaat en vult u elke put van de plaat met 200 microliters crin-oplossing.
Vervolgens laat u de sensorcartridge op de hulpplaat zakken om de sensoren in de Cain-oplossing te laten onderdompelen en controleert u of het niveau van de Cain-oplossing hoog genoeg is om de sensor ondergedompeld te houden. Plaats de cartridge vervolgens in een niet-koolstofdioxide 37 graden Celsius incubator voor een nacht. De volgende dag, verwijdert u voorzichtig het supernatant van de gepolariseerde macrofagen en was de cellen met 100 microliters vers bereide assay.
Medium per put. Voeg 180 microliters assaymedium toe aan elke put en gebruik de microscoop om te controleren of de cellen niet zijn weggespoeld. Als de cellen nog steeds gehecht zijn, plaatst u de plaat in de 37 graden Celsius niet-koolstofdioxide incubator gedurende één uur voorafgaand aan de assay-run terwijl de cellen worden geïncubeerd.
Bereid 10 x injectie-verbindingsmengsels zoals aangegeven in de tabel en verwarm de mengsels tot 37 graden Celsius. Laad vervolgens de sensorcartridge met de juiste volumes van verbinding en poorten A, B, C en D met behulp van de meegeleverde laadgidsen om de bio-energie van de gepolariseerde macrofagen te karakteriseren door middel van extracellulaire flux-assay. Gebruik de assay wizard om een assay-sjabloon te maken met twee minuten mixen en drie minuten meettijden, en ten minste drie mix- en snelheidsmeetlussen voorafgaand aan elk van de vier injecties en na de laatste injectie.
Start vervolgens de assay en volg de instructies zoals aangegeven door het apparaat. Laad de cartridgeplaat met de gehydrateerde sondes om kalibratie door het apparaat en de celplaat mogelijk te maken. Wanneer geïnstrueerd, gooi op het einde van de assay voorzichtig al het assaymedium weg en bewaar de geanalyseerde celcultuurmicroplaat bij min 20 graden Celsius tot normalisatie.
Om de cellen te normaliseren met behulp van de celproliferatie-assaykit, ontdooi de plaat en incubeer de cellen in 200 microliters vers bereid cel-lysebuffer per put gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Meet tenslotte de fluorescentie met ongeveer 480 nanometer excitatie en ongeveer 520 nanometer emissiemaxima. Gebruik de verkregen fluorescentiemetingen om de verhouding te berekenen waarin het gemiddelde aantal cellen van alle naieve macrofagenputten op één is ingesteld, exporteer vervolgens deze verhoudingen naar de seahorse-golfanalysesoftware.
Om de gegevens te normaliseren, zal een extracellulaire flux-assay doorgaans de extracellulaire acidificatiesnelheid of ECAR en de zuurstofconsumptiesnelheid of OCR plots opleveren, zoals gedemonstreerd in deze representatieve figuur na de injectie van glucose, vertegenwoordigt de waargenomen toename in ECAR de glycolysesnelheid. De aanvullende toename waargenomen in de ECAR na een TP-synthase-remming met all liga mycine biedt verdere informatie over de glycolytische reserve en capaciteit. Bij het analyseren van de OCR-waarden, vergemakkelijkt CIN-injectie de berekening van de zuurstofconsumptie die wordt gebruikt voor mitochondriale ATP-synthese, FCCP ontkoppelt mitochondriale ademhaling.
De bijbehorende OCR-metingen leveren gegevens op over de maximale en reserve-ademhalingscapaciteit die bekend is en de antimycine a-injectie blokkeert echter mitochondriale complexen een en drie met de resterende OCR die de niet-mitochondriale zuurstofconsumptie vertegenwoordigt. Macrofaagactivering met LPS induceert een verhoogde glycolytische stofwisseling. Met de verschillen tussen LPS en IL vier behandelde macrofagen worden nog duidelijker wanneer de zuurstofconsumptie-snelheden worden waargenomen.
Inderdaad, terwijl de maximale oxidatieve stofwisseling sterk onderdrukt is in LPS-behandelde macrofagen, induceert IL vier een robuuste ademhaling in M twee macrofagen. Eenmaal beheerst, kan de extracellulaire flux-assay in twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om vet samen met FCCP te injecteren om maximale ademhaling bij ontkoppeling te bevorderen.
Na deze techniek kunnen aanvullende tests zoals Eliza worden uitgevoerd om de efficiënte macrofaag
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het beoordelen van de metabole kenmerken van M1- en M2-gepolariseerde macrofagen afgeleid van beenmerg via extracellulaire fluxanalyse. De techniek stelt onderzoekers in staat om te onderzoeken hoe verschillende factoren het metabolisme en het fenotype van macrofagen beïnvloeden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Celmetabolisme
- Macrofagenbiologie
Achtergrond
- Macrofagepolarisatie is cruciaal voor de immuunrespons.
- Metabole herprogrammering is essentieel voor de functies van M1- en M2-macrofagen.
- Inzicht in het metabolisme van macrofagen kan therapeutische strategieën informeren.
- Deze methode beantwoordt aan de behoefte aan efficiënte metabole assays in onderzoek.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare assay te ontwikkelen voor het meten van de glycolyse en de mitochondriale functie in macrofagen.
- Om een kader te bieden voor het bestuderen van de effecten van cytokinen en verbindingen op het metabolisme van macrofagen.
- Om verder onderzoek naar de metabole kenmerken van immuuncellen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Extracellulaire fluxanalyse om glycolyse- en mitochondriale parameters te meten.
- Kweek en polarisatie van uit het beenmerg afgeleide macrofagen.
- Gebruik van Seahorse-technologie voor real-time metabolische metingen.
- Fluorescentie-gebaseerde normalisatie van gegevens na de assay.
Belangrijkste resultaten
- De metabole verschillen tussen M1- en M2-macrofagen zijn aangetoond.
- Er is vastgesteld hoe behandelingen met LPS en IL-4 het metabolisme van macrofagen beïnvloeden.
- Er zijn inzichten verschaft in de glycolytische reserve en de mitochondriële functie.
- Er is een protocol vastgesteld dat efficiënt binnen twee uur kan worden voltooid.
Conclusies
- Deze methode vergroot het begrip van het metabolisme van macrofagen.
- Het dient als een waardevolle tool voor immunologisch onderzoek.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit kader om diverse immuuncellen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Metabole herprogrammering is een kritieke determinant van de functionele toestanden van macrofagen en beïnvloedt direct ontstekingings- en resolutiepaden in ziektemodellen. Real-time extracellulaire fluxanalyse maakt een snelle, kwantitatieve beoordeling mogelijk van de glycolytische en mitochondriële activiteit in gepolariseerde macrofagen, wat mechanistische risicoreductie biedt voor de validatie van immunomodulerende targets. Deze aanpak ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid in de vroege ontdekkingsfase door cytokine-gedreven fenotypes te koppelen aan metabole afhankelijkheden, wat bijdraagt aan portfoliobeslissingen over anti-inflammatoire of immunometabole therapieën.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door LPS- of IL-4-stimulatie te koppelen aan gedefinieerde metabole verschuivingen in glycolyse en OXPHOS.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via real-time meting van ECAR en OCR als fenotypische read-outs van de activatiestatus van macrofagen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicovermindering door metabole afhankelijkheden te identificeren die correleren met pro-inflammatoire of herstelde macrofaagfuncties.
Screening en assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve ECAR- en OCR-outputs die geschikt zijn voor high-content screening van immunomodulerende verbindingen.
- Reproduceerbaarheid: Normalisatie via fluorescentie-gebaseerde celtelling waarborgt de consistentie van de assay tussen wells en experimenten, wat een crossfunctionele gegevensvergelijking ondersteunt.
- Schaalbaarheid: Compatibel met het 96-well microplate-formaat, waardoor parallelle tests van meerdere condities of concentraties van verbindingen in één run mogelijk zijn.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Legt een verband tussen metabole fenotypes van macrofagen en ontstekingsmodellen van ziekten waarbij de M1/M2-balans de pathologie en resolutie beïnvloedt.
- Translationele continuïteit: Biedt een functionele brug van in vitro polarisatie naar preklinische evaluatie van metabole interventies bij immuun-gemedieerde aandoeningen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Metingen van de reserve-respiratoire capaciteit (SRC) en de glycolytische reserve helpen bij het beoordelen van de conditie van macrofagen en hun responsiviteit op metabole modulatoren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelwit-hypotheses tot lead-optimalisatie, waarbij metabole fenotypering bijdraagt aan de zekerheid over het doelwit en de effecten van verbindingen op de immuuncelfunctie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door aan te tonen hoe polarisatiestimuli de belangrijkste energiepaden in macrofagen herstructureren.
- Screening: Levert realtime glycolytische en mitochondriale read-outs die het screenen van verbindingen voor metabole immunomodulatie mogelijk maken.
- Analytics: ECAR- en OCR-metingen bieden kwantitatieve, dynamische read-outs voor het vergelijken van de metabole flux over verschillende condities en tijdspunten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt het in vitro metabolisme van macrofagen met in vivo relevantie via geconserveerde metabole kenmerken van activatietoestanden.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd platform voor metabole profilering dat toepasbaar is in onderzoeksprogramma's voor immunologie, oncologie en fibrose.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door ambiguïteit bij de toewijzing van het macrofaagfenotype te verminderen via objectieve metabole profilering.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare metabole gegevens met een minimale celinput, waardoor de efficiëntie en doorvoer van de assay worden verbeterd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig mechanisch inzicht te bieden in de effecten van verbindingen op het metabolisme van immuuncellen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende kandidaten mogelijk op basis van metabole target-engagement en fenotypische correctie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire immuuncelcultuur, polarisatie en instrumentatie voor extracellulaire flux.
- Afhankelijk van een Seahorse XF-analyzer en compatibele sensorkartridges voor real-time meting van ECAR en OCR.
- Vereist standaardisatie van de zaaidichtheid van macrofagen, de polarisatieduur en de samenstelling van het assaymedium over verschillende runs.
- Aanpassing aan menselijke of uit weefsel afgeleide macrofagen kan optimalisatie van polarisatiestimuli en assaycondities vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de gevoeligheid van de assayduur voor de gezondheid van de cellen en de noodzaak van zorgvuldige normalisatie om variabiliteit in celaantal of levensvatbaarheid te compenseren.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Bone Marrow-derived Macrophage Polarization
2:17
Extracellular Flux Assay Preparation
3:46
Bioenergetic Characterization of Polarized M1 and M2 Macrophages
5:17
Results: Metabolic Characteristics of Control M0 and M1- and M2-polarized Macrophages
6:49
Conclusion
