Verbeterde Generatie van geïnduceerde Cardiomyocytes Met behulp van een polycistronisch Construct uitdrukken optimale verhouding van GATA4, MEF2C en Tbx5

Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe efficiënt geïnduceerde cardiomyocyten kunnen worden gegenereerd uit cardiale fibroblasten met een polycyonisch MGT-construct, dat een optimale verhouding van gata vier, F twee C en TBX vijf tot uitdrukking brengt. Deze methode biedt een waardevol platform voor onderzoek naar geïnduceerde cardiomyocyten en zal een hoge doorstromingsscreening en mechanistische studies van het programmeren van geïnduceerde cardiomyocyten vergemakkelijken, terwijl het veld ook naar klinische toepassingen wordt geleid. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door slechts een enkel retroviraal construct te gebruiken, cardio fibroblasten efficiënt kunnen worden omgezet in cardiomyocyten.

Reinig de neonatale alpha myosine zware ketting GFP transgene muis met 75% volume op volume. Ethanol voer euthanasie uit. Open vervolgens de lichaamsholte door een horizontale incisie te maken van onder de ene oksel tot de andere met steriele, stompe en gebogen pincetten.

Dissecteer het hart en plaats het in een put van een 24-wellplaat die ijs bevat. Koude PBS observeer GFP-expressie door het hele hart met behulp van fluorescentiemicroscopie. Plaats drie tot 4G FP positieve harten in een 60 millimeter centrale puttencultuurschaal met behulp van steriele pincetten en schaar, hak de harten in kleine stukjes van minder dan één kubieke millimeter.

Breng de gehakte harten over in een 10 centimeter schotel en bedek met twee milliliter fibroblast of FB-medium. Laat de schalen gedurende ten minste drie uur ongestoord in een 37 graden Celsius incubator. Voeg na de incubatie langzaam acht milliliter voorverwarmd FB-medium toe aan de schotel met het gehakte hartweefsel.

Vervolgens incubeert u het weefsel zonder verstoring, behalve om het medium om de drie dagen te verversen. Op dag zeven, aspireert u het kweekmedium en was de cellen met DPBS. Voeg drie milliliter 0,05% tripsine in EDTA toe aan elke schotel en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Voeg vijf milliliter FB-medium toe om de trypsine te deactiveren en scheid vervolgens voorzichtig de cellen met een cellscrapeer. Verzamel de cellen en filter ze door 40 micron celfilters om besmetting met hartweefselfragmenten te voorkomen. Pel de cellen door centrifugatie bij 200 keer G gedurende vijf minuten, te beginnen met geïsoleerde neonatale muizenharten.

Snijd elk hart in vier stukken die nog losjes met elkaar verbonden zijn. Breng de harten over in een 15 milliliter conische buis met acht milliliter warm 0,05% tripsine EDTA en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Na de incubatie, gooit u het tripsine EDTA weg en voegt u vijf milliliter warm type twee collageenase toe en mixt u gedurende één minuut op medium snelheid en incubeert u de buis in een 37 graden Celsius waterbad gedurende drie tot vijf minuten.

Vorm de buis vervolgens opnieuw gedurende één minuut. Laat de weefselstukken bezinken en verzamel het supernatant in een nieuwe buis met vijf milliliter koud FB-medium. Voeg vijf milliliter vers type twee collageenase toe aan de weefselstukken en herhaal de vortex- en incubatie stappen.

Combineer alle celbevattende supernatanten door ze door een 40 micron celfilter te filteren. Centrifugeer deze cellen bij 200 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Volgend op elke methode voor het isoleren van cardiale fibroblasten.

Was de uiteindelijke celpellet één keer in 10 milliliter magnetisch geactiveerde celsortering of max buffer. Verwijder 10 microliter voor live celtelling en centrifugeer de resterende cellen bij 200 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius voor minder dan één maal 10 tot de zevende cel. Resuspendeer de celpellet met 10 microliter dij 1,2 geconjugeerd magnetisch microbeads in 90 microliter gekoelde max buffer en meng.

Incubeer de parels gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Om de cellen te pellen, voegt u 10 milliliter max buffer toe en centrifugeert u de monsters bij 200 keer G gedurende vijf minuten. Was eenmaal met 10 milliliter max buffer en resuspendeer de celpellet in een totaal volume van twee milliliter in een cellencultuur kap.

Stel een max separator op en voeg een LS kolom toe. Breng de kolom in evenwicht met drie milliliter max buffer. Laat de celsuspensie door de LS kolom stromen en was drie keer met twee milliliter max buffer.

Verwijder vervolgens de LS kolom van de separator en elueer drie keer met twee milliliter max buffer. Verzamel de EIT in een 50 milliliter conische buis. Centrifugeer de EIT bij 200 keer G gedurende vijf minuten.

Resuspendeer de geïsoleerde fibroblasten in 10 milliliter FB-medium en tel de cellen, zaai de cellen in weefselkweekschotels met geschikte dichtheden in een gelatine voorgecodeerde 24-wellplaat om cardiale fibroblasten te herprogrammeren. Voeg 500 microliter geïnduceerd cardiomyocyt of ICM-medium met polybrein toe aan elke put van de 24-well platen gevuld met cellen. Voeg 10 microliter van het retrovirus toe aan elke put van geïsoleerde fibroblasten.

Incubeer de plaat met retrovirale deeltjes gedurende 24 tot 48 uur in een cellenkweekincubator. Vervang vervolgens het virusbevattende medium met 500 microliter vers ICM-medium, waarbij het medium om de twee tot drie dagen wordt ververst. Begin met positieve selectie van virologisch getransduceerde cellen door ICM-medium aan te vullen met twee microgram per milliliter pur mycine.

Na drie dagen selectie, verandert u het medium naar een onderhoudsdosis van één microgram per milliliter pur mycine om cardiale fibroblastconversie naar cardiomyocyten te visualiseren. Observeer pur mycine geselecteerde platen op GFP-expressie met behulp van een omgekeerde microscoop. Ten slotte, 14 dagen na virale behandeling, vervangt u ICM-medium met B 27.

Medium spontaan kloppende celloci kunnen drie tot vier weken na virale transductie optreden, expressie van cardiale markers, waaronder cardiale troponine t en alfa. Actinine kan worden gedetecteerd door immunochemie vanaf dag 10 tot 14. Hier wordt cardiale troponine T-expressie gezien in de I CMS die zijn omgezet uit fibroblasten, die GFP expressie van alfa actinine in de ICM'