Verbeterde Generatie van geïnduceerde Cardiomyocytes Met behulp van een polycistronisch Construct uitdrukken optimale verhouding van GATA4, MEF2C en Tbx5

Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe geïnduceerde cardiomyocyten efficiënt kunnen worden gegenereerd uit cardiale fibroblasten met een polycionisch MGT-construct, dat een optimale ratio van gata vier, F twee C en TBX vijf tot expressie brengt. Deze methode biedt een waardevol platform voor onderzoek naar geïnduceerde cardiomyocyten en zal high-throughput screening en mechanistische studies naar de programmering van geïnduceerde cardiomyocyten faciliteren, terwijl het het vakgebied richting klinische toepassingen beweegt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat cardiale fibroblasten efficiënt kunnen worden omgezet in cardiomyocyten met behulp van slechts één enkel retroviraal construct.

Reinig de neonatale alfa-myosine zware keten GFP-transgene muis met 75% volume/volume ethanol en voer de euthanasie uit. Open vervolgens de lichaamsholte door met steriele, stompe en gebogen pincetten een horizontale incisie te maken van de ene oksel naar de andere.

Dissekeer het hart en plaats het in een well van een 24-well plaat met ijs. Observeer de GFP-expressie in het hele hart met fluorescentiemicroscopie in koud PBS. Plaats drie tot vier GFP-positieve harten met een steriele pincet en schaar in een 60 millimeter culture dish met center well en hak de harten in kleine stukjes van minder dan één kubieke millimeter.

Breng de fijngehakte harten over naar een schaal van 10 centimeter en bedek deze met twee milliliters fiberblast- of FB-medium. Laat de platen gedurende ten minste drie uur ongestoord in een incubator van 37 degrees Celsius. Voeg na de incubatie langzaam acht milliliters voorverwarmd FB-medium toe aan de schaal met het fijngehakte hartweefsel.

Incubeer het weefsel vervolgens zonder verstoring, behalve om het medium elke drie dagen te verversen. Aspireer op dag zeven het kweekmedium en was de cellen met DPBS. Voeg drie milliliters 0,05% tripsin in EDTA toe aan elke plaat en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C.

Voeg vijf milliliter FB-medium toe om de trypsine te inactiveren en laat de cellen vervolgens voorzichtig los met een celschraper. Verzamel daarna de cellen en filter deze door 40 micron celzeven om contaminatie met fragmenten van hartweefsel te voorkomen. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij 200 ×g gedurende vijf minuten, beginnend met geïsoleerde neonatale muizenharten.

Snijd elk hart in vier stukken die nog losjes met elkaar verbonden zijn. Overbreng de harten naar een conische buis van 15 milliliter met acht milliliter warme 0,05% tripsin EDTA en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Gooi na incubatie de tripsin EDTA weg en voeg vijf milliliter warme collagenaase type twee toe; vortex gedurende één minuut op gemiddelde snelheid en incubeer de buis vervolgens gedurende drie tot vijf minuten in een waterbad van 37 graden Celsius.

Vortex de buis vervolgens opnieuw gedurende één minuut. Laat de weefselstukjes bezinken en verzamel het supernatant in een nieuwe buis met vijf milliliters koud FB-medium. Voeg vijf milliliters verse type twee collagenase toe aan de weefselstukjes en herhaal de vortex- en incubatiestappen.

Combineer alle celbevattende supernatanten door ze te filteren door een 40 micron celzeef. Centrifugeer deze cellen bij 200 ×g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Volg vervolgens een van de methoden voor de isolatie van cardiale fibroblasten.

Was het uiteindelijke celpellet één keer in 10 milliliters magnetische geactiveerde cel sortering of max buffer. Neem 10 microliters af voor het tellen van levende cellen en centrifugeer de resterende cellen bij 200 times G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius voor minder dan 1 times 10 to the seventh cellen. Resuspendeer het celpellet met 10 microliters thigh 1.2 geconjugeerde magnetische microbeads in 90 microliters gekoelde max buffer en meng.

Incubeer de kraaltjes gedurende 30 minuten bij 4 °C. Voeg 10 mL Max Buffer toe om de cellen te pelletteren en centrifugeer de monsters 5 minuten bij 200 ×g. Was één keer met 10 mL Max Buffer en resuspendeer de celpellet in een totaalvolume van 2 mL in een celcultuurkap.

Stel een max-separator in en voeg een LS-kolom toe. Equilibreer de kolom met drie milliliters max-buffer. Laat de cel-suspensie door de LS-kolom lopen en was drie keer met twee milliliters max-buffer.

Verwijder vervolgens de LS-kolom uit de separator en elueer drie keer met twee milliliter max buffer. Verzamel de EIT in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer de EIT bij 200 ×g gedurende vijf minuten.

Resuspendeer de geïsoleerde fibroblasten in 10 milliliters FB-medium en tel de cellen; zaai de cellen in kweekschalen uit op geschikte dichtheden in een met gelatine gecoate 24-wellplaat om cardiale fibroblasten te herprogrammeren. Voeg 500 microliters geïnduceerd cardiomyocyten- of ICM-medium met poly-brein toe aan elke well van de 24-wellplaten waarin de cellen zijn gezaaid. Voeg 10 microliters van het retrovirus toe aan elke well met geïsoleerde fibroblasten.

Incubeer de plaat met retrovirale partikels gedurende 24 tot 48 uur in een celkweekincubator. Vervang vervolgens het virusbevattende medium door 500 µL vers ICM-medium, waarbij het medium elke twee tot drie dagen wordt ververst. Begin de positieve selectie van viraal getransduceerde cellen door het ICM-medium aan te vullen met 2 µg/mL puromycine.

Na drie dagen selectie wordt het medium vervangen door een onderhoudsdosis van 1 µg/mL puromycine om de conversie van cardiale fibroblasten naar cardiomyocyten te visualiseren. Controleer de met puromycine geselecteerde platen op GFP-expressie met behulp van een omgekeerde microscoop. Vervang tot slot, 14 dagen na de virale behandeling, het ICM-medium door B 27.

Loci met spontaan kloppende cellen in het medium kunnen verschijnen drie tot vier weken na virale transductie-expressie van cardiale markers, waaronder cardiaal troponine T en alfa-actinine. Alfa-actinine kan via immunochemie worden aangetoond tussen dag 10 en 14. Hier is de expressie van cardiaal troponine T zichtbaar in de iCMS die zijn geconverteerd uit fibroblasten, welke GFP tot expressie brengen; de expressie van alfa-actinine in de iCMS is hier te zien.

Analyse via flowcytometrie laat vergelijkbare stijgingen zien in de expressie van cardiaal troponine T, met name na purmycine-selectie van geïnduceerde cardiomyocyten. De hier beschreven methodologie maakt een efficiënte generatie van geïnduceerde cardiomyocyten mogelijk op basis van retrovirale levering van NGT-transcriptiefactoren in een enkel construct.