Protocollen voor het analyseren van de rol van Paneth Cellen in het regenereren van de muizen darm met behulp van voorwaardelijke Cre-lox Mouse Modellen

Het algemene doel van deze dissectieprocedure is om aan te tonen hoe het darmweefsel van een muis geïsoleerd en voorbereid kan worden voor latere karakteriseringstechnieken. Deze methode kan worden gebruikt om het vermogen van de darmstamcellen te onderzoeken om de darm te herbevolken na een experimentele procedure. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt na elke techniek of procedure of na genmanipulatie. Gebruik cray locks-technologie. Begin door een geëuthaniseerde volwassen muis in de rugligging te plaatsen en het haar nat te maken met 70%ethanol.

Open vervolgens met schaars de intraperitoneale holte longitudinaal langs de middenlijn en zet de maag vast met een pincet. Snijd vervolgens de verbinding met de slokdarm door en trek voorzichtig aan de maag om de dunne darm tot aan de appendix te verwijderen. Trek vervolgens voorzichtig aan de appendix om de dikke darm tot aan de anus te verwijderen.

Zodra de darmen zijn geïsoleerd, verwijdert u de maag in de appendix en gebruikt u een spuit uitgerust met een stompe pipettip om de darmen onmiddellijk na het spoelen met PBS te spoelen. Snijd vervolgens de darm in drie gelijke delen, proximale, middelste en distale delen. Snijd vervolgens elk deel in stukken van één centimeter en plaats drie tot vijf fragmenten van het weefsel op het midden van een stuk chirurgisch plakband van twee bij twee centimeter. In een piramidevorm, wanneer alle weefsels zijn bevestigd, verzegelt u het plakband rond de stukken longitudinaal en creëert u een log bos.

Plaats vervolgens het plakband in een platte bodem die minstens 10 keer het volume van neutraal, gebufferd, formaal en fixatief bevat in verhouding tot het volume weefsel, en bewaar de monsters op vier graden Celsius voordat u ze inbedt en doorsnijdt. Na fixatie brengt u het weefsel over naar een platte bodem die minstens 10 keer het volume van 70% ethanol bevat in verhouding tot het weefselvolume om het weefsel onmiddellijk na het spoelen in Metcon te fixeren. Snijd de darm in drie gelijke delen zoals zojuist is aangetoond.

Plaats vervolgens elk stuk naast elkaar op een stuk filterpapier van 15 bij 15 centimeter en gebruik spring bow schaars om de delen te openen op FOSS wanneer alle delen zijn gesplitst. Breng het filterpapier over in een glazen schaal met vers bereid Metcon gedurende drie tot 24 uur bij kamertemperatuur aan het einde van de fixatie, gebruik een pincet om het uiteinde van elk van de darmstukken een voor een op te pakken en wikkel de weefsels rond het pincet om individuele Zwitserse rollen te vormen. Zet elke rol vast door het pincet lichtjes te openen en een naald van 25 gauge door het weefsel te steken.

Plaats vervolgens de gerolde weefsels in een platte bodem die minstens 10 keer het volume van neutraal gebufferd formaat en fixatief bevat in verhouding tot het weefsel gedurende ten minste een uur voordat u doorgaat met de hele Mount laxy visualisatie van de weefseluitbarsting. Giet gesmolten rauwe was gemengd met minerale olie in 15 centimeter petrischalen. Spoel de weefsels onmiddellijk na het spoelen van de darmen met ijskoud PBS met 25 milliliter ijskoud ex cal fixatief.

Na fixatie snijdt u de darmen in drie tot vijf gelijke delen en plaatst u elk deel op een van de afgekoelde wasplaten. Speld elk uiteinde vast zodat de delen lichtjes zijn uitgerekt met de mesenterische lijnen aan de bovenkant van de platen. Knip eventueel overtollig mesenterium weg.

Gebruik vervolgens spring bow schaars om de ingewanden longitudinaal te snijden en ze vast te pinnen terwijl ze worden geopend wanneer alle delen zijn vastgepind. Overspoel de platen met voldoende xal-fixatief om alle weefsels te bedekken na minimaal een uur bij vier graden Celsius. Gebruik een pipet van 25 milliliter of een spuit om het fixatief te verwijderen en was de weefsels eenmaal met 30 milliliter PBS.

Bedek vervolgens de delen met 30 milliliter DTTD-eenvormige oplossing voor een incubatie van 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur met schudden. Aan het einde van de incubatie verwijdert u de deifying-oplossing met een pipet of spuit van 25 milliliter en spoelt u de weefsels met nog eens 30 milliliter PBS. Gebruik vervolgens een achterste pipet om het slijm met het PBS na de was te verwijderen.

Vervang de PBS door 30 milliliter xal voor een nachtelijke kleuring bij kamertemperatuur in het donker met zachte agitatie op een schuivend platform de volgende ochtend. Als de delen een blauwgroene kleuring hebben ontwikkeld, vervangt u de xal door 30 milliliter PBS. Na drie minuten zachte agitatie, maakt u Zwitserse rollen zoals zojuist is aangetoond en plaatst u de weefsels in een wijd geopende platte bodem die minstens 10 keer het volume van geschikt fixatief bevat in verhouding tot het volume weefsel op vier graden Celsius gedurende ten minste 24 uur voordat u doorgaat met inbedden en doorsnijden.

Met behulp van de ROSA 26 R Laxy conditionele reporter kan 100% recombinatie drie dagen na inductie worden waargenomen in de dunne darm met behulp van DNA dat is geëxtraheerd uit de gecombineerde cribs. QPCR voor de gecombineerde allelen toonde een niet-significante toename van recombinatie binnen het VI crease-systeem, mogelijk vanwege de recombinatie in paneth-cellen die niet werd waargenomen. Met behulp van het ah crease-systeem met behulp van de laxy-reporter, vertoonden beide systemen ook een volledige verlies van gecombineerde cellen drie dagen na inductie.

EM vier. In tegenstelling tot de crypten in ah cre muizen ondergingen PTH-cellen apoptose na Caden b-deletie alleen binnen het VI Cree-systeem. Als u deze techniek eenmaal onder de knie hebt, kan deze in ongeveer 10 minuten worden voltooid.

Het is belangrijk om vertragingen te minimaliseren om weefseldegradatie te voorkomen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de darm van een muis kunt verwijderen voor downstream-analyse.