Ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen Myoglobin

Het algemene doel van deze immunochromatografische teststrip met collodaal goud is om het myoglobine van walvisachtigen te onderscheiden van dat van zeehonden en andere dieren. Deze methode kan een snelle screening ter plaatse mogelijk maken voor vlees van walvisachtigen, waardoor de illegale handel en consumptie ervan kunnen worden beperkt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een succesvol resultaat direct kan worden waargenomen vijf tot tien minuten na het homogeniseren van 0,3 gram spierweefsel, met een uitstekende specificiteit en gevoeligheid.

Deze methode kan dus zorgen voor een snelle detectie van walvisachtigenvlees in het veld. De methode kan ook worden toegepast op ander vlees, zoals paardenvlees of varkensvlees. Om synthetische peptiden te ontwerpen voor het opwekken van monoklonale antilichamen met reactiviteit tegenover het myoglobine van walvisachtigen, worden de aminozuursequenties van myoglobine-antigene reactieve regio's van verschillende dieren geanalyseerd.

Begin met het ophalen uit GenBank van de aminozuursequenties van myoglobine van tonijn, kip, struisvogel, gedomesticeerde zoogdieren, zeehond en 18 soorten cetaceeën. Lijn vervolgens de sequenties uit met behulp van de juiste software. Start de Alignment Explorer door op Align Edit/Build Alignment in de startbalk te klikken.

Selecteer Create New Alignment en klik op OK. Er verschijnt een dialoogvenster met de vraag of u een DNA- of eiwitsequentie-alignment bouwt. Klik op de knop met het label Protein, selecteer Data Open Retrieve sequences from File en selecteer het sequentiebestand. Selecteer het menucommando Edit Select All om alle posities voor elke sequentie in de dataset te selecteren voor het maken van een multiple sequence alignment.

Selecteer Alignment Align by ClustalW in het hoofdmenu. Selecteer BLOSUM als de eiwitgewichtsmatrix en klik vervolgens op de OK-knop. De derde stap is het analyseren van de sequentie-uitlijning.

Focus op vijf antigene reactieve plaatsen en zoek het fragment dat geconserveerd is bij cetaceen. Een asterisk symboliseert consensus in de alignment en geeft een positie aan met een enkel, volledig geconserveerd residu. Er zijn twee geconserveerde fragmenten bij cetaceen gevonden.

Kandidaat-sequentiefragmenten worden vervolgens gesynthetiseerd en gebruikt om monoclonale antilichamen op te wekken. Begin deze procedure door de optimale pH voor de colloïdaal goudoplossing te bepalen, gedefinieerd als de minimale pH die het mengsel van het monoclonale antilichaam en de colloïdaal goudoplossing gedurende twee uur rood van kleur houdt. Voeg 0,15 µg gezuiverd detectie-monoclonaal antilichaam toe aan 100 µL colloïdaal goudoplossing met pH-waarden variërend van vijf tot negen.

Voor de doeleinden van deze demonstratie worden pH 6 en pH 8 getest. pH 8 werd door deze optimalisatiestap als de optimale pH beschouwd. Bepaal vervolgens de optimale concentratie van het monoklonale antilichaam door verschillende hoeveelheden gezuiverd detecterend monoklonaal antilichaam toe te voegen aan 100 µL colloïdaal goudoplossing bij pH 8.

De optimale concentratie, die in deze studie zes microgram per milliliter bedraagt, zorgt ervoor dat de kleur van het mengsel rood blijft zonder zwarte neerslag. Voeg op basis van de resultaten uit de optimalisatiestappen 60 microgram gezuiverde detecterende monoklonale antilichamen druppelsgewijs toe aan 10 mL colloïdaal goudoplossing. Emulgeer het mengsel voorzichtig gedurende tien minuten bij kamertemperatuur.

Voeg twee milliliters van een 5% BSA-oplossing in PBS toe aan het mengsel en emulgeer dit voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten om achtergrondinterferentie te verminderen. Centrifugeer het mengsel bij 10, 000 ×g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het supernatant met niet-geconjugeerde antilichamen en resuspendeer de resulterende pellet in 4 mL PBS-T met 1% BSA en 0,1% Tween-20.

Herhaal de centrifugatie en suspensie een of twee keer. Suspendeer de uiteindelijke precipitatten in 1mL PBS-T en bewaar deze bij vier graden Celsius tot gebruik. Een grafische weergave van het ontwerp van de immuunstrip wordt hier getoond.

De afmetingen van het karton, de pads en het nitrocellulosemembraan zijn vermeld in de protocoltekst. Om de bewaartermijn te verlengen, moeten de immuunstrips worden klaargemaakt en geassembleerd onder laboratoriumomstandigheden met een lage luchtvochtigheid. Gebruik een micropipet om de met colloïdaal goud gelabelde monoklonale antilichaamoplossing aan de conjugaatpad toe te voegen om deze te verzadigen, en droog de pad vervolgens één uur bij 37 °C vóór de assemblage.

Zodra het conjugaatpad droog is, gebruik dan dubbelzijdige tape om eerst het nitrocellulosemembraan op het karton te plakken. Breng met een immunostrip-printer het specifieke monoklonale antilichaam voor antigeenvangst en het snelle anti-muis IGG respectievelijk aan op de testzone en de controlezone van het nitrocellulosemembraan. Houd een afstand van meer dan vijf millimeter tussen de twee zones aan.

Plak vervolgens de conjugaatpad aan één zijde van het nitrocellulosemembraan en de absorptiepad aan de andere zijde, waarbij de pads aan elke kant ongeveer twee millimeter overlappen. Plaats de monsterpad over de conjugaatpad met een overlap van twee millimeter en plak deze op het karton. Gebruik een papiersnijder om stroken van zes millimeter breed te maken.

Verpak de strips in een aluminiumfoliezak met droogmiddel en bewaar deze bij vier graden Celsius tot gebruik. Om een monster voor de kruisreactiviteitstest voor te bereiden, voegt u 1mL PBS met 0,1%BSA toe aan 0,03 gram rauw spierweefsel. Gebruik vervolgens een bamboestokje of een maalstaaf om het monster te homogeniseren.

Houd de immunostrip vast aan het uiteinde tegenover het testgebied en dompel het monsterpadgedeelte vijf tot tien minuten in het monster. Observeer het resultaat direct. Test diverse spiermonsters in triplicaat.

De T-testlijn is ontworpen om een positief signaal te geven wanneer beide monoclonale antilichamen cetaceen myoglobine detecteren. Omdat myoglobine van niet-cetaceen dieren slechts door een van deze twee monoclonale antilichamen kan worden gedetecteerd, vertoont de testlijn een negatief resultaat wanneer spiermonsters van andere dieren worden getest. De C-controllijn moet altijd een positief resultaat geven, omdat snel anti-muis IGG bindt aan het met colloïdaal goud gelabelde detectieantilichaam.

Een negatief resultaat in decontrollijn geeft aan dat de kwaliteit van de materialen op de strip onvoldoende is. Western blot-analyse van bloed met gebruik van hybridoma-supernatanten laat zien dat het CGF5H9 monoklonale antilichaam cetacea en andere zoogdieren detecteert als een enkele gekleurde band bij een voorspeld molecuulgewicht van ongeveer 17kDa. De gewone dwergvinvis vertoont een relatief zwakkere band dan de banden van andere cetacea.

Bandjes ontbreken voor tonijn, zeehond en kip. Daarentegen is een bandje van ongeveer 50kDa waarneembaar voor varken. Identieke resultaten worden verkregen via dot blood-analyse.

Hoewel Western blot-bloedanalyse met het monoklonale antilichaam CSF1H13 meerdere aspecifieke banden vertoont voor varken en tonijn, is CSF1H13 zeer specifiek omdat het uitsluitend reageert met cetacea. Bovendien vertoont de zeehond een band bij een voorspeld molecuulgewicht van ongeveer 17kDa. Identieke resultaten worden verkregen via dot blot-bloedanalyse.

Resultaten van een indirecte ELISA van spierextracten van verschillende soorten met behulp van gezuiverd CGF5H9 tonen positieve signalen voor koe, geit, hond, konijn en cetacea, een zwak positief signaal voor varken, en negatieve signalen voor tonijn, kip en zeehond. CSF1H13 vertoont een hoge affiniteit voor cetacea en zeehonden. Beide monoklonale antilichamen kunnen sterk reageren met alle vier de cetacea-soorten uit verschillende families, wat wijst op hun brede reactiviteit ten opzichte van diverse cetacea-soorten.

De specificiteit van de immuun-colloïdaal goudstrip wordt aangetoond door deze representatieve resultaten. Het gebruik van spiermonsters van niet-cetacea resulteert in slechts één enkele band bij de controllijn. Wanneer echter spiermonsters van cetacea worden gebruikt, zijn de signaalbanden aanwezig bij zowel de testlijn als de controllijn.

Zodra de techniek onder de knie is, kan de preparatie van gelabelde antilichamen en de constructie van de strips in vier uur worden voltooid indien dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het peptide zorgvuldig te ontwerpen. Gebruik verschillende methoden voor het screenen van geschikte monoklonale antilichamen.

En gebruik colloïdaal goud van hoge kwaliteit om gelabelde antilichamen voor te bereiden. Na deze procedures kunnen andere methoden, zoals PCR-gebaseerde DNA-analyse, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de cetacee-soort en de herkomst ervan. Het CSF1H13 monoklonale antilichaam, dat sterk is en een affiniteit vertoont voor uitsluitend zeezoogdieren, kan worden ingezet in verschillende ELISA-formaten, die tal van andere mogelijkheden bieden voor het bestuderen van de biologische, fysiologische en chemische aspecten van myoglobine bij zeezoogdieren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe specifieke monoklonale antilichamen worden ontwikkeld en hoe deze vervolgens kunnen worden toegepast op een quickteststrip.