Ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen Myoglobin

Het algemene doel van deze colloïdale goud immunochromatografische teststrip is om het myoglobine van walvisachtigen te onderscheiden van dat van zeehonden en andere dieren. Deze methode kan snel en ter plaatse screening bieden voor walvisachtig vlees, waardoor de illegale handel en consumptie ervan wordt beperkt. Het grote voordeel van deze techniek is dat een succesvol resultaat direct kan worden waargenomen in vijf tot tien minuten na het homogeniseren van 03 gram spierweefsel, met uitstekende specificiteit en gevoeligheid.

Deze methode kan dus snelle detectie van walvisachtig vlees in het veld bieden. Het kan ook worden toegepast op ander vlees zoals paardenvlees of varkensvlees. Om synthetische peptiden te ontwerpen voor het kweken van monoklonale antilichamen met reactiviteit naar het myoglobine van walvisachtigen, worden de aminozuursequenties van myoglobine antigene reactieve regio's van verschillende dieren geanalyseerd.

Begin door de aminozuursequenties van myoglobine van tonijn, kip, struisvogel, gedomesticeerde zoogdieren, zeehond en 18 soorten walvisachtigen te halen uit GenBank. Vervolgens worden de sequenties uitgelijnd met behulp van de juiste software. Start de Alignment Explorer door de optie Align Edit/Build Alignment te selecteren op de startbalk.

Selecteer Nieuwe uitlijning maken en klik op OK. Er verschijnt een dialoogvenster waarin wordt gevraagd of u een DNA- of eiwitsequentie-uitlijning maakt. Klik op de knop Eiwit, selecteer Data Open Retrieve sequences from File en selecteer het sequentiebestand. Selecteer de menuopdracht Bewerken Selecteer Alles om alle sites voor elke sequentie in de dataset te selecteren voor het maken van een uitlijning met meerdere sequenties.

Selecteer Uitlijning Uitlijnen door ClustalW vanuit het hoofdmenu. Selecteer BLOSUM als de eiwitgewichtsmatrix en klik vervolgens op de OK-knop. De derde stap is het analyseren van de sequentie-uitlijning.

Concentreer u op vijf antigene reactieve sites en zoek het fragment dat behouden is onder walvisachtigen. Een asterisk symboliseert consensus in de uitlijning en geeft een positie aan die een enkele, volledig bewaarde rest heeft. Er werden twee bewaarde fragmenten in walvisachtigen gevonden.

Kandidaatsequentiefragmenten worden vervolgens gesynthetiseerd en gebruikt om monoklonale antilichamen te kweken. Begin deze procedure door de optimale pH voor de colloïdale goud-oplossing te bepalen, gedefinieerd als de minimale pH die de monoklonale antilichaam- en colloïdale goudoplossingsmixtuur twee uur lang rood van kleur houdt. Voeg 0,15 microgram gezuiverd detecterend monoklonaal antilichaam toe aan 100 microliter colloïdale goudoplossing met pH-waarden variërend van vijf tot negen.

Voor de doeleinden van deze demonstratie worden pH zes en pH acht getest. pH acht werd beschouwd als de optimale pH bij deze optimalisatie-stap. Bepaal vervolgens de optimale concentratie van het monoklonale antilichaam door verschillende hoeveelheden gezuiverd detecterend monoklonaal antilichaam toe te voegen aan 100 microliter colloïdale goudoplossing bij pH acht.

De optimale concentratie, die in deze studie zes microgram per milliliter is, zal de kleur van het mengsel rood houden zonder zwarte neerslag. Op basis van de resultaten van de optimalisatie-stappen, voegt u 60 microgram gezuiverd detecterend monoklonaal antilichaam druppelsgewijs toe aan 10mL colloïdale goudoplossing. Emulgeer het mengsel zachtjes gedurende tien minuten op kamertemperatuur.

Voeg twee milliliter van een 5%BSA-oplossing in PBS toe aan het mengsel en emulgeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur om achtergrondinterferentie te verminderen. Centrifugeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 10.000 keer g bij vier graden Celsius. Verwijder na centrifugatie voorzichtig de supernatant met ongeconjugeerd antilichaam en suspendeer het resulterende pellet in 4mL PBS-T met 1%BSA en 0,1%Tween-20.

Herhaal de centrifugatie en suspensie een of twee keer. Suspendeer de uiteindelijke neerslagen in 1mL PBS-T en bewaar bij vier graden Celsius tot gebruik. Een afbeelding van het ontwerp van de immuunstrip wordt hier getoond.

De afmetingen van de kartonnen basis, pads en nitrocellulosemembraan staan in de protocoltekst vermeld. Om de opslagduur te verlengen, moeten de immuunstrips worden bereid en geassembleerd in een laboratoriumomgeving met een lage luchtvochtigheid. Gebruik een micropipet om de oplossing van het met colloïdaal goud gelabelde monoklonale antilichaam toe te voegen aan de conjugaatpad om deze te verzadigen en droog de pad vervolgens bij 37 graden Celsius gedurende een uur voordat u gaat assembleren.

Zodra de conjugaatpad droog is, gebruik dubbelzijdig plakband om de nitrocellulosemembraan eerst op de kartonnen basis te plakken. Gebruik een immunostripprinter om het specifieke antigeen opvangende monoklonale antilichaam en het snelle anti-muis IGG op respectievelijk de testzone en de controlezone op de nitrocellulosemembraan te verdelen. Houd een afstand van meer dan vijf millimeter tussen de twee zones.

Plak vervolgens de conjugaatpad aan één kant van de nitrocellulosemembraan en de absorberende pad aan de andere kant, waarbij de pads aan elke kant ongeveer twee millimeter overlappen. Plaats de monsterspad met twee millimeter over de conjugaatpad en plak deze op de kartonnen basis. Gebruik een papiersnijder om stroken van zes millimeter breed te maken.

Verpak de stroken in een aluminiumfoliezak met droogmiddel en bewaar bij vier graden Celsius tot gebruik. Om een monster voor te bereiden voor de kruisreactiviteitstest, voegt u 1 mL PBS met 0,1%BSA toe aan 0,03 gram rauw spierweefsel. En gebruik een bamboe stok of een maalstaaf om het monster te homogeniseren.

Houd de immuunstrip bij het uiteinde dat tegenover het testgebied ligt en dompel het monsterstukgedeelte vijf tot tien minuten in het specimen. Observeer het resultaat direct. Test verschillende spiermonsters in drievoudig.

De T-testlijn is ontworpen om een positief signaal te tonen wanneer beide monoklonale antilichamen walvisachtig myoglobine detecteren. Omdat het myoglobine van niet-walvisachtige dieren alleen kan worden gedetecteerd door een van deze twee monoklonale antilichamen,