Name: Ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen Myoglobin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Leer een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatografische teststrip ontwikkelen voor snelle detectie van walvisachtigen myoglobine ter voorkoming van illegale handel. Deze methode biedt resultaten binnen 5 tot 10 minuten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We waarderen de medewerkers van de Taiwan Cetacean Society, het Marine Biology and Cetacean Research Center van de National Cheng Kung Universiteit, Farglory Ocean Park en het Animal Disease Diagnostic Center van de National Chiayi Universiteit voor het verzamelen van monsters. Dit project werd gefinancierd door een subsidie aan WCY van de Raad voor Landbouw van Taiwan (100AS-02.1-FB99).

Ethiek Verklaring: De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met internationale richtlijnen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van National Chiayi University, goedkeuring ID: 99022. De walvisachtige steekproef gebruik werd toegestaan ​​door de Raad van Landbouw van Taiwan (Research Permit 100M-02.1-C-99). 1. Muscle Monstervoorbereiding en SDS-PAGE Opmerking: Muscle-monsters van 23 soorten, waaronder 16 soorten zeezoogdieren, 5 soorten landzoogdieren, tonijn en kip werden gebruikt in deze studie (tabel 1). De walvisachtige spier monsters werden verkregen van gestrande personen, visserij bijvangst, en confiscatie. Konijn, ratten, honden en kippen spierweefsel werden verkregen uit Animal Disease Diagnostisch Centrum van de Nationale Chiayi University. Monsters van rundvlees, varkensvlees, lamsvlees, tonijn en werden gekocht bij een supermarkt. De spier steekproef van gewone zeehond (Phoca vitulina </em&gt;) werd verstrekt door Farglory Ocean Park. Natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) werd toegepast voor oplosbare eiwitten scheiden met verschillende molecuulgewichten in de spieren monsters. <ol><li> Bewaar alle monsters bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> Pre-cool mortel bij -20 ° C. Dan zet 3 g bevroren spier monster in. </li><li> Homogeniseer het monster met 10 ml koud fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een weefselhomogenisator. </li><li> Centrifugeer het gehomogeniseerde monster bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof en het op -20 ° C tot gebruik. </li><li> Bereid 5 ml van 5% stacking gel (3,07 ml gedestilleerd water, 1,25 ml van 4x bovenste gel buffer van pH 6,8, 625 ui 40% acrylamide, 50 ui 10% ammoniumpersulfaat (APS) en 5 gl tetramethylethyleendiamine ( TEMED)) en 10 ml 15% scheiden gel (3,65 ml gedestilleerd water, 2,5 ml van 4x lagere gel buffer van pH 8,8, 3,75 ml 40% acrylamide, 100 pl 10% APS,en 4 pl TEMED). <ol><li> In de elektroforesecel, pour stapelgel (5% acrylamide) bovenop de scheidende gel (15% acrylamide) nadat dit gestold. Plaats een gel kam in het stapelen gel. </li></ol></li><li> Voer PAGE volgens de volgende voorwaarden: eerste run conditie: 100 volt, 20 min en laatste voorwaarde: 120 volt, 40 min. </li><li> Vlekken op de gel met Coomassie brilliant blauw bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten totdat de gel gelijkmatig blauwe kleur. Opmerking: Kleuring is voltooid wanneer de gel niet meer zichtbaar is in de kleurstofoplossing. </li><li> Ontkleuring met azijnzuuroplossing (10%) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Bands zullen beginnen te verschijnen. Doorgaan ontkleuren wordt uitgevoerd bij 4 ° C gedurende de nacht, totdat de achtergrond is duidelijk. </li></ol> 2. Peptide Synthese en productie van monoklonale antistoffen <ol><li> Haal de aminozuursequenties van Mb van GenBank waaronder tonijn, kip, struisvogel, gedomesticeerde zoogdieren, afdichting en 18 soortenvan walvisachtigen (tabel 2). </li><li> Lijn de sequenties met de juiste software 16: <ol><li> Start de Alignment Explorer door de optie Align: Bewerken / Build Alignment op de startbalk; selecteer Create New Alignment en klik op OK. Er verschijnt een dialoogvenster de vraag &quot;Bent u het bouwen van een DNA of proteïne sequence alignment? &#39; </li><li> Klik op de knop &quot;Protein&quot;; kies Data: Open: Ophalen sequenties uit bestand en selecteer volgorde file; selecteer de Edit: Kies Alle menu-opdracht om alle sites voor elke rij in de voor het creëren van een multiple sequence alignment gegevens te selecteren. </li><li> Kies Alignment: Lijn door ClustalW in het hoofdmenu om de geselecteerde sequenties gegevens met behulp van de ClustalW algoritme af te stemmen; selecteer &quot;BLOSUM&quot; als de Protein Weight Matrix en klik op de knop OK. </li></ol></li><li> Analyseer de sequence alignment: <ol><li> Focus op 5 antigene reactieve sites 17: plaats 1 (AKVEADVA, 15-22), site 2 (KASEDLK, 56-62), plaats 3 (ATKHKI, 94-99), plaats 4 (HVLHSRH, 113-119) en plaats 5 (KYKELGY, 145- 151) en vind het fragment geconserveerd onder walvisachtigen. Een * (asterisk; consensus symbool in de uitlijning (Protocol 2.2.3)) geeft aan posities die een enkele, volledig geconserveerde resten te hebben. De volgende geconserveerde fragmenten in walvisachtigen werden gevonden: opeenvolging KASEDLKKHG (welke site 2 bevat) en de volgorde HVLHSRHP (welke site 4 bevat). </li></ol></li><li> Synthetiseren kandidaat sequentiefragmenten volgens de sequentieanalyse en conjugaat met ovalbumine eiwit (OVA) als dragereiwit via andere voorzieningen. <ol><li> Voeg hydrofobe aminozuren (bijvoorbeeld methionine) aan de N-terminus van antigene reactieve plaats te voorkomen dat het peptide van ontleding (bijvoorbeeld M-KASEDLKKHG). </li><li> Verleng de C-terminus van antigene reactieve plaats voor het belichten van de belangrijkste antigene plaats op de immunocyt. Bovendien conjupoort het peptide OVA door toevoeging van een cysteïne (Cys, C) aan de C-terminale (bijvoorbeeld M-KASEDLKKHG-NTVL-C). </li></ol></li><li> Emulgeren compleet Freund&#39;s adjuvans immunogeen voor 1 of incompleet Freund&#39;s adjuvans immunogeen voor 2 met een gelijk volume van elk synthetisch peptide in PBS (3 ml, eindconcentratie 30-50 ug / 100 pl). </li><li> Inoculeren immunogeen 1 (0,1 mg) subcutaan in elk van 5 BALB / c muizen. </li><li> Voer subcutane booster injecties vijfmaal behulp immunogeen 2 bij tussenpozen van twee weken en laat testsera door staart clip bemonstering van de muizen voor elke booster. </li><li> Bepaal sera titer voor de eerste screening. <ol><li> Oplossen 100 ug vrij peptide in 25 ml reactiebuffer en aliquot 50 ul van de oplossing in elk putje van een 96-wells plaat. Voeg 10 ul koppelingsreagens oplossing in elk putje en meng de plaat. Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Verwijder de inhoud van de put,wassen elk putje 3 keer met gedestilleerd water, en blokkeert de plaat door toevoeging van 200 ul van blokkeeroplossing. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Verwijder de inhoud en was elk putje 3 keer met gedestilleerd water. </li><li> Voer indirecte ELISA (Protocol 5,1-5,7) voor het bepalen sera titer voor de eerste screening. Kies de muis met de hoogste titer (hoogste optische dichtheid) voor de milt collectie. </li></ol></li><li> Drie dagen vóór de milt verzamelen, enten 0,1 mg immunogeen 1 subcutaan in de muis met het hoogste titer. </li><li> Verzamel de miltcellen van de geïmmuniseerde muizen en geselecteerde zekering murine myeloomcellen F0 (SP2 / 0-Ag14) om hybridoma cellen te verkrijgen voor mAb productie 18. </li><li> 14 dagen na de fusie, selecteert u de positieve klonen door het screenen van de reactiviteit van hybridomasupernatanten in de richting van vrije synthetisch peptide met behulp van indirecte ELISA (Protocol 5,1-5,7). </li><li> Verdun de cellen om een ​​geschikt aantal per goed voor maximizing het aantal putjes dat slechts één enkele kloon (verdunning klonering) bevatten. <ol><li> Voeg 100 pi celkweekmedium alle putjes in 96-well plaat, behalve goed A1 die leeg wordt gelaten. </li><li> Voeg 200 ul van de celsuspensie goed A1. Vervolgens snel 100 ui overbrengen van A1 naar B1 en meng door voorzichtig pipetteren. Herhaal deze 1: 2 verdunningen over de gehele kolom, en verwijder vervolgens 100 pl van H1 zodat het eindigt met hetzelfde volume als de putjes erboven. </li><li> Een extra 100 ul medium naar kolom 1 met een 8-kanaals micropipet. Vervolgens snel overbrengen 100 gl van elk van de wells in kolom 1 die in kolom 2 met dezelfde pipet en meng door voorzichtig pipetteren. </li><li> Met behulp van dezelfde tips, herhaalt u deze 1: 2 verdunningen over de gehele plaat. Gooi 100 gl van elk van de putten in de laatste kolom. </li><li> Breng het uiteindelijke volume van 200 pl putten door toevoegen van 100 ul medium in elk putje. Incubate plate ongestoord bij 37 ° C in een bevochtigde CO2 incubator. </li><li> Controleer elke goed en markeer alle putten die slechts een enkele kolonie bevatten. Voer twee of meer kloneringen totdat&gt; 90% van de putjes die enkelvoudige klonen positief antilichaamproductie zijn. </li></ol></li><li> Zeef de klonen door western blot en dot blot (protocol 3,1-4,6). Vervolgens subcultuur kolonies van de putjes in grotere vaten cellen voor het verkrijgen mAb breiden. Meestal elke kloon overgebracht naar een enkel putje in een 12- of 24-well plaat. </li><li> Meet de verwantschap tussen de mAb&#39;s en de spier uittreksels van koe, geit, varken, hond, konijn, tonijn, kip, seal, en vier representatieve soorten walvisachtigen door western blot en dot blot (protocol 3,1-4,6). </li><li> Inoculeren geselecteerde hybridoma cellen (maximaal 3 x 10 6) intraperitoneaal in muizen om ascites te induceren. Zwelling van de buik is meestal duidelijk binnen 7-10 dagen na hybridoma injectie. Verzamel vloeistof met behulp van een injectienaald(Minder dan 20 gauge). </li><li> Centrifuge ascitesvloeistof (10.000 g gedurende 10 min) om cellen en resten te verwijderen. Filtreer door een 0,45 pm filter. Voeg 1 tot 20 ml monster, 15 ml bindingsbuffer, en 3-5 ml elutiebuffer in het proteïne G Sepharose-kolom. Verzamel de elutie fractie die gezuiverd antilichaam uit muizen ascitesvloeistof. </li><li> Bepaal het antilichaam isotype van antilichaam Isotypering Kit middels instructies van de fabrikant. </li></ol> 3. Western Blot <ol><li> Bereid 2x laadbuffer bevattende β-mercaptoethanol (BME) door mengen van 950 ui van 2 x Laemmli monsterbuffer met 50 pl BME. Verdun de spier supernatanten (protocol 1,1-1,4) bij het laden buffer met geschikte verhouding voor het verkrijgen van een goede signalen: 01:50 (walvisachtigen en seal) en 1: 5 (huisdieren en tonijn) bij het gebruik van polyklonaal konijn anti-humaan antilichaam Mb, en 1: 1 (varken, konijn, kip en tonijn), 1: 5 (koe, geit en hond) en 01:25 (walvisachtigen en seal) wanneer eenntibody is van hybridoma supernatant. </li><li> Warmte monster bij 95 ° C gedurende 5 minuten. samples in de putjes van SDS-PAGE gel (4% acrylamide stapelen en 12% acrylamide scheidende) met molecuulgewicht merkers. Voer de elektroforese gedurende 5 minuten bij 50 V verhogen dan de spanning tot 150 V aan de punt af in ongeveer 1 uur. </li><li> Plaats de gel in 1x overdracht buffer gedurende 15 min. Breng de gescheiden eiwitten naar nitrocellulose (NC) membranen nadat ze zijn gescheiden door PAGE. Transfer kan worden gedaan bij 100 V gedurende 60-90 min. </li><li> Bereid blokkeeroplossing: 1x PBS met 0,1% Tween 20 met 5% magere melkpoeder. Blokkeer de NC membraan in 25 ml blokkeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was driemaal gedurende 5 minuten elk met 15 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing met Tween 20 (PBST). </li><li> Incubeer het membraan en primaire antilichaam (ascitesvloeistof of hybridoma supernatant) in 10 ml antilichaam verdunningsbuffer verdund met 5% blokkeeroplossing bij 4 ° C overnacht. </li><li> Was de membraame driemaal opnieuw met PBST schoon te maken uit overmatige antilichaam. </li><li> Incubeer het membraan met alkalische fosfatase geconjugeerd geit anti-muis IgG 1: 1250 in blokkerende oplossing onder zacht schudden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Was het membraan opnieuw en incubeer in het 5-broom-4-chloor-3-indolyl fosfaat / p-nitroblauwtetrazolium chloride (BCIP / NBT) fosfatase substraat mengsel gedurende 10 tot 20 minuten tot kleurontwikkeling. </li><li> Stop de reactie door het wassen van het membraan verscheidene veranderingen gedestilleerd water. </li></ol> 4. Dot Blot <ol><li> Verdun de spier supernatanten (protocol 1.1-1.4) in 5% runderserumalbumine (BSA) in PBST met geschikte verhouding voor het verkrijgen van goede signalen: 1: 5 voor huisdieren en tonijn en 1:25 voor walvissen en afdichting. Spot 5 pl van de monsters op het membraan. Minimaliseren het gebied dat de oplossing doordringt (gewoonlijk 3-4 mm diameter) door langzaam toe te passen. </li><li> Droog de ​​membraan bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld &lt;/ Em&gt; in een laminaire stroom gedurende 30-60 min), blokkeren met blokkeeroplossing petrischaal gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en wassen met PBST. </li><li> Incubeer het membraan met primair antilichaam (mAb van hybridoma supernatant bij 1: 10.000 of ascitesvloeistof op 1: 100.000 verdund in 5% blokkeeroplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Gebruik PBST het membraan drie keer wassen gedurende 5 minuten elk om overmaat antilichaam te verwijderen en daarna geïncubeerd met secundair antilichaam (aan alkalische fosfatase geconjugeerd geit anti-muis IgG 1: 1250 in 5% blokkeeroplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd . </li><li> Was het membraan opnieuw en incubeer in de BCIP / NBT fosfatase substraatmengsel binnen 10 tot 20 minuten tot kleurontwikkeling. </li><li> Stop de reactie door het wassen van het membraan verscheidene veranderingen gedestilleerd water. </li></ol> 5. Indirecte ELISA <ol><li> Bereid wasbuffer (0,002 M imidazool gebufferde zoutoplossing met 0,02% Tween 20). Was de plaat 3 keer met het wassenbuffer tussen elke volgende stap (protocol 5,2-5,5). </li><li> Bereid 1:25 verdunning van de spier supernatanten (protocol 1,1-1,4) in coating buffer. Coat een 96-well ELISA-plaat met 100 gl verdunde supernatant bij 4 ° C gedurende de nacht en geblokkeerd met blokkeerbuffer (1% BSA in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Bereid 1: 2000 verdunning van het gezuiverde mAb met verdunde buffer en voeg 100 pl verdund mAb aan elk putje. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Add geit anti-muis IgG geconjugeerd met mierikswortel peroxidase (1: 200 verdunning in buffer verdund) voor verdere incubatie. </li><li> Voeg peroxidase substraat aan elke well (100 ul / well) en geïncubeerd gedurende 10-15 min. </li><li> Stop de reactie door het enzym peroxidase stopoplossing (100 gl / putje) bij kleurontwikkeling waargenomen. </li><li> Lees de optische dichtheid bij 450 nm met behulp van een microplaat spectrofotometer. </li></ol> 6. Bereiding van colloïdaal goud-gelabelde mAb </p&gt; Opmerking: De kleur van colloïdaal goud oplossing en het mengsel altijd rood. Stel de pH, concentratie van mAb, centrifuge snelheid bij het zwarte neerslag wordt opgemerkt. 6.1 en 6.2 zijn optimalisatie stappen. <ol><li> Voeg detecteren gezuiverde mAb (50 ug / ml, 3 ui) aan 100 ui colloïdaal goud oplossing met een pH variërend van 5-9. De minimale pH dat de kleur rood blijft gedurende twee uur wordt beschouwd als de optimale pH. Opmerking: In deze studie werd 0,1 M kaliumcarbonaat gebruikt colloïd goud (40 nm) tot pH 8,0 (optimale pH) passen. </li><li> Voeg verschillende hoeveelheid gezuiverde mAb detecteren (500 ug / ml, 1-20 ul) aan 100 ui colloïdaal goud oplossing bij pH 8,0. Opmerking: De optimale concentratie in deze studie is 6 ug / ml (geen zwarte neerslag). </li><li> Volgens de bovenstaande resultaten, voeg 60 ug gezuiverd detecteren mAb druppelsgewijs aan 10 ml colloïdale goudoplossing. Emulgeren van het mengsel langzaam bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Advertentied 2 ml 5% BSA-oplossing in PBS (pH 7,4) aan het mengsel en emulgeren voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 15 min achtergrondinterferentie verminderen. </li><li> Centrifugeer het mengsel bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant met ongeconjugeerde antilichaam zorgvuldig en schorten de verkregen pellets in 4 ml PBST dat 1% BSA en 0,1% Tween 20, en herhaal centrifugeren en suspensie meerdere malen. </li><li> Schorsen de laatste neerslag in 1 ml PBST en het op 4 ° C tot gebruik. </li></ol> 7. Bouw van Immune Strip Opmerking: Figuur 1 toont het immuunsysteem strip ontwerp. Voorbereiden en monteren van de strips in een lage luchtvochtigheid laboratorium milieuconditie (&lt;20% relatieve vochtigheid) voor langere houdbaarheid (&gt; 1 jaar). De afmetingen van de pads en het membraan zijn: conjugaatpad 300 mm x 10 mm, absorberend kussen 300 mm x 24 mm, sample pad 300 mm x 24 mm, NC membraan 300 mm x 25 mm, plakbord 300mm x 80 mm. <ol><li> Add colloïdaal goud gelabelde mAb oplossing van stap 6.6 met een micropipet op het conjugatiekussentje verzadigen en vervolgens drogen bij 37 ° C gedurende 1 uur vóór montage. </li><li> Verdeel het specifieke antigeen vangen mAb (500 ug / ml) op de testzone, en konijn anti-muis IgG (500 ug / ml) op de controlezone voor het detecteren van mAb op het NC-membraan met behulp van een pipet of immunostrip printer. Afstand bewaren (&gt; 5 mm) tussen de twee zones om interferentie te voorkomen. </li><li> Plak de geconjugeerde pad, absorberend en NC membraan op het plakbord met dubbelzijdig tape. Opmerking: Overlap de elektroden aan weerszijden van het NC-membraan met ongeveer 2 mm. Ongepaste strip bouw zal leiden tot een onvolledige proef. </li><li> Het monster pad over het conjugaat pad (2 mm) en plak het op het plakbord. </li><li> Maak 6 mm brede stroken met een papieren cutter. Verpak de stroken in de aluminium folie zak met droogmiddel en bewaar ze bij 4 ° C tot gebruik. </li></ol> 8. Cross-reactiviteit Test <ol><li> Homogeniseren 0,03 g ruwe spier monster met 1 ml PBS (met 0,1% BSA) in een 1,5 ml centrifugebuis met een bamboestok of malen staaf. </li><li> Houd de strip aan het eind tegenover de testgebieden en dompel de sample pad gedeelte in het model voor 5-10 min en direct waar te nemen van het resultaat. <ol><li> Optioneel: Verzamel 500 ul supernatant en overbrengen naar een nieuwe centrifugebuis. Opmerking: Deze stap wordt voorgesteld als het signaal niet duidelijk wanneer de strook direct geweekt in de supernatant. </li></ol></li><li> Test verschillende spier monsters in drievoud. Opmerking: Hier hebben we getest tonijn, kip, seal, 15 soorten walvisachtigen en 5 soorten landzoogdieren. </li><li> Hebben vijf onafhankelijke inspecteurs herhalen 8.3 voor vijf keer, dat wil zeggen, gebruik maken van 575 strips in totaal. </li></ol>

<ol><li>Robards, M. D., Reeves, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+extent+and+character+of+marine+mammal+consumption+by+humans%3A+1970-2009%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Conserv%22%5BJournal%5D)">The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009.</a> Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).</li>
<li>Booth, S., Zeller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mercury%2C+food+webs%2C+and+marine+mammals%3A+implications+of+diet+and+climate+change+for+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health.</a> Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).</li>
<li>Endo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+mercury%2C+methyl+mercury%2C+and+selenium+levels+in+the+red+meat+of+small+cetaceans+sold+for+human+consumption+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan.</a> Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).</li>
<li>Tryland, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pathogens+in+marine+mammal+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Norwegian+Scientific+Committee+for+Food+Safety+%28VKM%29%22%5BJournal%5D)">Human pathogens in marine mammal meat.</a> Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).</li>
<li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+simple+method+for+the+identification+of+meat+species+and+meat+products+by+PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay.</a> Meat Sci. 51, 143-148 (1999).</li>
<li>Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+identification+of+southern+hemisphere+beaked+whales+%28Cetacea%3A+Ziphiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae).</a> Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).</li>
<li>Dalmasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR+assay+for+the+identification+of+animal+species+in+feedstuffs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs.</a> Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).</li>
<li>Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+assay+for+the+identification+of+animal+species+in+cooked+sausages%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages.</a> Meat Sci. 77, 649-653 (2007).</li>
<li>Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Monoclonal+Antibody-based+Sandwich+ELISA+for+the+Detection+of+Porcine+Skeletal+Muscle+in+Meat+and+Feed+Products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products.</a> J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).</li>
<li>Kotoura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sandwich+ELISA+for+the+Determination+of+Beef+Meat+Content+in+Processed+Foods%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Sci.+Techno.+Res%22%5BJournal%5D)">A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods.</a> Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).</li>
<li>Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+reliable+identification+of+imported+Pangasius+catfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Sci%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish.</a> J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).</li>
<li>Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoss%2C+HA+%22J.Hered%22">J.Hered</a>. 94, 111-114 (2003).</li>
<li>Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+lateral+flow+test+strip+technology+for+detection+of+infectious+agents+and+chemical+contaminants%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).</li>
<li>Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targets+and+methods+for+the+detection+of+processed+animal+proteins+in+animal+feedstuffs%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs.</a> Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).</li>
<li>Rao, Q., Hsieh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+commercial+lateral+flow+feed+test+for+rapid+detection+of+beef+and+sheep+content+in+raw+and+cooked+meats%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats.</a> Meat Sci. 76, 489-494 (2007).</li>
<li>Tamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA5%3A+molecular+evolutionary+genetics+analysis+using+maximum+likelihood%2C+evolutionary+distance%2C+and+maximum+parsimony+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.</a> Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).</li>
<li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+structure+of+myoglobin%3A+the+complete+immunochemical+anatomy+of+a+protein+and+conclusions+relating+to+antigenic+structures+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins.</a> Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).</li>
<li>Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridoma+technology+for+the+generation+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies.</a> Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).</li>
<li>Kao, D. J., Hodges, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+a+synthetic+peptide+immunogen+over+a+protein+immunogen+in+the+development+of+an+anti-pilus+vaccine+for+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa.</a> Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).</li>
<li>Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoglobin+in+pelagic+small+cetaceans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myoglobin in pelagic small cetaceans.</a> J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).</li>
<li>Lo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immune+colloidal+gold+strip+for+cetacean+meat+restraining+illegal+trade+and+consumption%3A+implications+for+conservation+and+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health.</a> PLoS ONE. 8, e60704(2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Met behulp van een synthetisch peptide geconjugeerd aan dragereiwit opmerkelijk effectiever vergeleken met de verwante eiwit. Voor een sandwich gebaseerde techniek, omdat het mAb wordt ontwikkeld met behulp van epitopen met bekende relatieve locaties, beide mAbs in dit onderzoek waarschijnlijk niet interfereren met elkaar interactie met het doelantigeen epitoop. Bovendien kan de reactiviteit tussen het natieve eiwit en antilichaam van muizen geïmmuniseerd met het synthetische peptide-conjugaat sterker dan de reactivitei...

Histologisch gezien wordt walvissenvlees in veel delen van de wereld gegeten en deze consumptie gaat vandaag nog door1. Vanwege het trofische niveau van walvissen, is het bekend dat hun vlees hoge niveaus van kwik en andere toxines bevat2. Daarom kan de consumptie van walvissenvlees leiden tot gezondheidsproblemen, niet alleen voor risicogroepen zoals zwangere vrouwen, maar ook voor de algemene bevolking3. Bovendien kan de besmetting van walvissenvlees met zoönotische of potentieel zoönotische pathogenen ook optreden tijdens de verwerking en opslag4. Het is zelfs voor ervaren agenten moeilijk om walvissenvlees alleen aan zijn uiterlijk te identificeren. Daarom is een betrouwbare wetenschappelijke identificatiemethode vereist om walvissenvlees te onderscheiden van andere vleessoorten. Dit zou helpen om de consumptie van walvissenvlees te beperken.
Huidige methoden voor soortidentificatie omvatten moleculaire technieken en immunologische methoden. Moleculaire technieken, zoals polymerasekettingreactie (PCR) en DNA-sequencing, kunnen worden gebruikt om monsters te identificeren, niet alleen van rauw vlees5 en ontbonden monsters6, maar ook van verwerkte voedingsmiddelen zoals gekookte worst en voedermiddelen7,8. Immunologische methoden, zoals enzymgekoppelde immunosorbeertest (ELISA), worden vaak toegepast in de voedselproductie om het vleesgehalte te detecteren van bijvoorbeeld varkensvlees9, rundvlees10 en meerval11. PCR-gebaseerde DNA-analyse voor de identificatie van walvissenvlees is beschikbaar12 en heeft geholpen bij het voorkomen van de illegale internationale handel in walvissenvlees in Japan, Zuid-Korea, de Filippijnen, Taiwan, Hong Kong, Rusland, Noorwegen en de Verenigde Staten1. Deze methoden zijn effectief en betrouwbaar, maar ze kunnen uren of dagen duren om te voltooien en omvatten bewerkelijke stappen. De identificatie van walvissenvlees is meestal gebaseerd op moleculaire technieken en er is momenteel geen immunologische methode beschikbaar. Voor regelgevende instanties is het zeer wenselijk om een betrouwbare en snelle techniek te ontwikkelen die in het veld kan worden gebruikt om walvissenvlees te identificeren.
Immunochromaotgrafische strips worden gebruikt als detectiemiddelen met het voordeel dat ze snel resultaat produceren via een eenvoudig protocol dat geschikt is voor gebruik in het veld. De principes van de immunochromatografische strip en ELISA zijn zeer vergelijkbaar en omvatten antilichamen, antigenen en labels. Er zijn veel verschillende labels zoals colloïdaal goud, koolstof en latex gebruikt bij de ontwikkeling van immunochromatografische strips. Momenteel wordt deze methode veel gebruikt voor het detecteren van antibiotica, toxines, bacteriën en virussen13, maar het wordt zelden gebruikt voor het identificeren van eiwitten in vlees14,15. Hier stellen we een lateral-flow chromatografische enzymimmunoassay voor voor de snelle detectie van walvissenmyoglobine (Mb).

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>AMRESCO</td><td>J373</td><td></td></tr><tr><td>Protein G HP SpinTrap&nbsp;</td><td>GE&nbsp;Healthcare</td><td>28-9031-34</td><td>spin column bevattende Protein G Sepharose</td></tr><tr><td>IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit</td><td>Roche</td><td>11493027001</td><td>Isotype strips, voorgecoat met subklasse- en lichtketenuitspecifieke anti-muis-Ig antilichamen</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3935</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membraan</td><td>Whatman</td><td>Z613630</td><td></td></tr><tr><td>Antibody blocker oplossing&nbsp;</td><td>LTK BioLaboratories</td><td></td><td>Om niet-specifieke bindingsinteracties van niet-specifiek IgG in de monsters te minimaliseren</td></tr><tr><td>BCIP/NBT fosfatas substraat&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-81-00</td><td></td></tr><tr><td>Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Muis</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plaat</td><td>Thermo&nbsp;Fisher Scientific</td><td>EW-01928-08</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan&nbsp;EX ELISA lezer&nbsp;</td><td>Thermo&nbsp;Electron&nbsp;Corporation</td><td>51118170</td><td></td></tr><tr><td>Colloïdaal goud (40 nm) oplossing&nbsp;</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td></td><td>40-50 nm is geschikt voor immunostrip</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine</td><td>Gibco</td><td>15561-020</td><td></td></tr><tr><td>Rapid test immno-strip printer</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td>AGISMART RP-1000&nbsp;</td><td>Alleen geschikt voor kleinschalige productie van immunostrips voor onderzoeks- en ontwikkelingsdoeleinden</td></tr><tr><td>Strip componenten (NC membranen, monsterpads (#33 glas, S&amp;S), conjugaatpads (#16S, S&amp;S) en absorberende pads (CF6, Whatman))</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freund&rsquo;s adjuvant en incompleet Freund&rsquo;s adjuvant&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881, F5506</td><td>Wordt gebruikt om water-in-olie emulsies van immunogenen te produceren</td></tr><tr><td>Acrylamid, gel buffer, ammoniumpersulfaat (APS), tetramethyleendiamine (TEMED)&nbsp;</td><td>Protech</td><td></td><td>Gelvoorbereiding voor SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Coomassie briljante blauw R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610436</td><td>Eiwitkleuring in SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Laemmli monster buffer en &beta;-mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737, 1610710</td><td>Verdun eiwitmonsters voordat ze op SDS-PAGE gels worden geladen</td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen myoglobin

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een immunochromatografische teststrip van colloïdaal goud op basis van het sandwich-formaat dat kan worden gebruikt om het myoglobine (Mb) van cetaceën te onderscheiden van dat van zeehonden en andere dieren. De strip biedt snel en ter plaatse screening voor cetaceënvlees, waardoor de illegale handel en consumptie ervan wordt beperkt. Er werden twee monoklonale antilichamen (mAbs) ontwikkeld met reactiviteit naar de Mb van cetaceën. De aminozuursequenties van Mb-antigene reactieve regio's van verschillende dieren werden geanalyseerd om twee synthetische peptiden (een algemeen peptide en een specifiek peptide) te ontwerpen en vervolgens de mAbs (subklasse IgG1) te kweken. De mAbs werden geselecteerd uit hybridomen die werden gescreend door indirect ELISA, western blot en dot blot. CGF5H9 was specifiek voor de Mb's van konijnen, honden, varkens, koeien, geiten en cetaceën, terwijl het zwakke tot geen affiniteit vertoonde voor de Mb's van kippen, tonijn en zeehonden. CSF1H13 kan zich met sterke affiniteit binden aan zeehonden en cetaceën, maar vertoonde geen affiniteit voor andere dieren. Cetaceënmonsters uit vier families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae en Kogiidae) werden in dit onderzoek gebruikt, en de resultaten gaven aan dat deze twee mAbs een brede bindingscapaciteit hebben voor Mb's van verschillende cetaceën. Deze mAbs werden toegepast op een sandwich-type colloïdaal goud immunochromatografische teststrip. CGF5H9, dat veel soorten herkent, werd colloïdaal goud-gelabeld en gebruikt als detectie-antilichaam. CSF1H13, dat op de testzone werd gecoat, detecteerde de aanwezigheid van cetaceën en zeehonden Mb's. Spiermonsters van tonijn, kip, zeehond, vijf soorten landzoogdieren en 15 soorten cetaceën werden driemaal getest. Alle cetaceënmonsters vertoonden positieve resultaten en alle andere monsters vertoonden negatieve resultaten.

Monoklonaal antilichaam karakteristieken We ontwikkelden twee IgG 1 mAb&#39;s (CGF5H9 en CSF1H13) de erkenning van twee synthetische peptiden (MKASEDLKKHGNTVLC en AIIHVLHSRHPAEFGC), respectievelijk van walvisachtigen Mb, en deze werden gebruikt om een sandwich-type colloïdaal goud immunochromatographic teststrip te construeren voor de snelle opsporing van walvisachtigen Mb. figuur 2 toont dat CGF5H9 detecteert walvissen en andere zoogdieren een be...

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van twee IgG-klasse monoklonale antilichamen (mAbs) die sterk reageren op myoglobine van cetacean. Deze mAbs worden toegepast op een colloïdaal goud immunochromatografische teststrip op basis van het sandwich-formaat om het Mb van cetacean te onderscheiden van zeehond en andere dieren.

Ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Het algemene doel van deze immunochromatografische teststrip met collodaal goud is om het myoglobine van walvisachtigen te onderscheiden van dat van zeehonden en andere dieren. Deze methode kan een snelle screening ter plaatse mogelijk maken voor vlees van walvisachtigen, waardoor de illegale handel en consumptie ervan kunnen worden beperkt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een succesvol resultaat direct kan worden waargenomen vijf tot tien minuten na het homogeniseren van 0,3 gram spierweefsel, met een uitstekende specificiteit en gevoeligheid.Deze methode kan dus zorgen voor een snelle detectie van walvisachtigenvlees in het veld. De methode kan ook worden toegepast op ander vlees, zoals paardenvlees of varkensvlees. Om synthetische peptiden te ontwerpen voor het opwekken van monoklonale antilichamen met reactiviteit tegenover het myoglobine van walvisachtigen, worden de aminozuursequenties van myoglobine-antigene reactieve regio's van verschillende dieren geanalyseerd.Begin met het ophalen uit GenBank van de aminozuursequenties van myoglobine van tonijn, kip, struisvogel, gedomesticeerde zoogdieren, zeehond en 18 soorten cetaceeën. Lijn vervolgens de sequenties uit met behulp van de juiste software. Start de Alignment Explorer door op Align Edit/Build Alignment in de startbalk te klikken.Selecteer Create New Alignment en klik op OK. Er verschijnt een dialoogvenster met de vraag of u een DNA- of eiwitsequentie-alignment bouwt. Klik op de knop met het label Protein, selecteer Data Open Retrieve sequences from File en selecteer het sequentiebestand. Selecteer het menucommando Edit Select All om alle posities voor elke sequentie in de dataset te selecteren voor het maken van een multiple sequence alignment.Selecteer Alignment Align by ClustalW in het hoofdmenu. Selecteer BLOSUM als de eiwitgewichtsmatrix en klik vervolgens op de OK-knop. De derde stap is het analyseren van de sequentie-uitlijning.Focus op vijf antigene reactieve plaatsen en zoek het fragment dat geconserveerd is bij cetaceen. Een asterisk symboliseert consensus in de alignment en geeft een positie aan met een enkel, volledig geconserveerd residu. Er zijn twee geconserveerde fragmenten bij cetaceen gevonden.Kandidaat-sequentiefragmenten worden vervolgens gesynthetiseerd en gebruikt om monoclonale antilichamen op te wekken. Begin deze procedure door de optimale pH voor de colloïdaal goudoplossing te bepalen, gedefinieerd als de minimale pH die het mengsel van het monoclonale antilichaam en de colloïdaal goudoplossing gedurende twee uur rood van kleur houdt. Voeg 0,15 µg gezuiverd detectie-monoclonaal antilichaam toe aan 100 µL colloïdaal goudoplossing met pH-waarden variërend van vijf tot negen.Voor de doeleinden van deze demonstratie worden pH 6 en pH 8 getest. pH 8 werd door deze optimalisatiestap als de optimale pH beschouwd. Bepaal vervolgens de optimale concentratie van het monoklonale antilichaam door verschillende hoeveelheden gezuiverd detecterend monoklonaal antilichaam toe te voegen aan 100 µL colloïdaal goudoplossing bij pH 8.De optimale concentratie, die in deze studie zes microgram per milliliter bedraagt, zorgt ervoor dat de kleur van het mengsel rood blijft zonder zwarte neerslag. Voeg op basis van de resultaten uit de optimalisatiestappen 60 microgram gezuiverde detecterende monoklonale antilichamen druppelsgewijs toe aan 10 mL colloïdaal goudoplossing. Emulgeer het mengsel voorzichtig gedurende tien minuten bij kamertemperatuur.Voeg twee milliliters van een 5% BSA-oplossing in PBS toe aan het mengsel en emulgeer dit voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten om achtergrondinterferentie te verminderen. Centrifugeer het mengsel bij 10, 000 ×g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het supernatant met niet-geconjugeerde antilichamen en resuspendeer de resulterende pellet in 4 mL PBS-T met 1% BSA en 0,1% Tween-20.Herhaal de centrifugatie en suspensie een of twee keer. Suspendeer de uiteindelijke precipitatten in 1mL PBS-T en bewaar deze bij vier graden Celsius tot gebruik. Een grafische weergave van het ontwerp van de immuunstrip wordt hier getoond.De afmetingen van het karton, de pads en het nitrocellulosemembraan zijn vermeld in de protocoltekst. Om de bewaartermijn te verlengen, moeten de immuunstrips worden klaargemaakt en geassembleerd onder laboratoriumomstandigheden met een lage luchtvochtigheid. Gebruik een micropipet om de met colloïdaal goud gelabelde monoklonale antilichaamoplossing aan de conjugaatpad toe te voegen om deze te verzadigen, en droog de pad vervolgens één uur bij 37 °C vóór de assemblage.Zodra het conjugaatpad droog is, gebruik dan dubbelzijdige tape om eerst het nitrocellulosemembraan op het karton te plakken. Breng met een immunostrip-printer het specifieke monoklonale antilichaam voor antigeenvangst en het snelle anti-muis IGG respectievelijk aan op de testzone en de controlezone van het nitrocellulosemembraan. Houd een afstand van meer dan vijf millimeter tussen de twee zones aan.Plak vervolgens de conjugaatpad aan één zijde van het nitrocellulosemembraan en de absorptiepad aan de andere zijde, waarbij de pads aan elke kant ongeveer twee millimeter overlappen. Plaats de monsterpad over de conjugaatpad met een overlap van twee millimeter en plak deze op het karton. Gebruik een papiersnijder om stroken van zes millimeter breed te maken.Verpak de strips in een aluminiumfoliezak met droogmiddel en bewaar deze bij vier graden Celsius tot gebruik. Om een monster voor de kruisreactiviteitstest voor te bereiden, voegt u 1mL PBS met 0,1%BSA toe aan 0,03 gram rauw spierweefsel. Gebruik vervolgens een bamboestokje of een maalstaaf om het monster te homogeniseren.Houd de immunostrip vast aan het uiteinde tegenover het testgebied en dompel het monsterpadgedeelte vijf tot tien minuten in het monster. Observeer het resultaat direct. Test diverse spiermonsters in triplicaat.De T-testlijn is ontworpen om een positief signaal te geven wanneer beide monoclonale antilichamen cetaceen myoglobine detecteren. Omdat myoglobine van niet-cetaceen dieren slechts door een van deze twee monoclonale antilichamen kan worden gedetecteerd, vertoont de testlijn een negatief resultaat wanneer spiermonsters van andere dieren worden getest. De C-controllijn moet altijd een positief resultaat geven, omdat snel anti-muis IGG bindt aan het met colloïdaal goud gelabelde detectieantilichaam.Een negatief resultaat in decontrollijn geeft aan dat de kwaliteit van de materialen op de strip onvoldoende is. Western blot-analyse van bloed met gebruik van hybridoma-supernatanten laat zien dat het CGF5H9 monoklonale antilichaam cetacea en andere zoogdieren detecteert als een enkele gekleurde band bij een voorspeld molecuulgewicht van ongeveer 17kDa. De gewone dwergvinvis vertoont een relatief zwakkere band dan de banden van andere cetacea.Bandjes ontbreken voor tonijn, zeehond en kip. Daarentegen is een bandje van ongeveer 50kDa waarneembaar voor varken. Identieke resultaten worden verkregen via dot blood-analyse.Hoewel Western blot-bloedanalyse met het monoklonale antilichaam CSF1H13 meerdere aspecifieke banden vertoont voor varken en tonijn, is CSF1H13 zeer specifiek omdat het uitsluitend reageert met cetacea. Bovendien vertoont de zeehond een band bij een voorspeld molecuulgewicht van ongeveer 17kDa. Identieke resultaten worden verkregen via dot blot-bloedanalyse.Resultaten van een indirecte ELISA van spierextracten van verschillende soorten met behulp van gezuiverd CGF5H9 tonen positieve signalen voor koe, geit, hond, konijn en cetacea, een zwak positief signaal voor varken, en negatieve signalen voor tonijn, kip en zeehond. CSF1H13 vertoont een hoge affiniteit voor cetacea en zeehonden. Beide monoklonale antilichamen kunnen sterk reageren met alle vier de cetacea-soorten uit verschillende families, wat wijst op hun brede reactiviteit ten opzichte van diverse cetacea-soorten.De specificiteit van de immuun-colloïdaal goudstrip wordt aangetoond door deze representatieve resultaten. Het gebruik van spiermonsters van niet-cetacea resulteert in slechts één enkele band bij de controllijn. Wanneer echter spiermonsters van cetacea worden gebruikt, zijn de signaalbanden aanwezig bij zowel de testlijn als de controllijn.Zodra de techniek onder de knie is, kan de preparatie van gelabelde antilichamen en de constructie van de strips in vier uur worden voltooid indien dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het peptide zorgvuldig te ontwerpen. Gebruik verschillende methoden voor het screenen van geschikte monoklonale antilichamen.En gebruik colloïdaal goud van hoge kwaliteit om gelabelde antilichamen voor te bereiden. Na deze procedures kunnen andere methoden, zoals PCR-gebaseerde DNA-analyse, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de cetacee-soort en de herkomst ervan. Het CSF1H13 monoklonale antilichaam, dat sterk is en een affiniteit vertoont voor uitsluitend zeezoogdieren, kan worden ingezet in verschillende ELISA-formaten, die tal van andere mogelijkheden bieden voor het bestuderen van de biologische, fysiologische en chemische aspecten van myoglobine bij zeezoogdieren.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe specifieke monoklonale antilichamen worden ontwikkeld en hoe deze vervolgens kunnen worden toegepast op een quickteststrip.

development-colloidal-gold-based-immunochromatographic-test-strip-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video zal populariseren een colloïdale Coomassie G-250 kleuringsprotocol volgens...

Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels

In this video, we demonstrate gold immunostaining of biomarkers localized within the lumen region of ultrathin exosomal sections. This technique enables early diagnosis of diseases by visualization of target molecules within the exosomes secreted by the diseased cells.

Gold Immunostaining of Exosomal Sections: A Technique to Visualize Diagnostic Markers in Exosomal Lumen

In this video, we describe the Raman spectroscopy-based direct immunoassay method for detecting specific target antigens. The antibodies, which are adsorbed onto the surface of gold nanoparticles attached to Raman probes, interact with target antigens and produce a specific Raman spectrum, which is subsequently detected.

A Raman Spectroscopy-Based Direct Immunoassay to Detect a Specific Antigen

This video demonstrates a capillary electrophoresis immunoassay protocol for detecting a protein biomarker associated with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human blood platelets. Confirmation of the presence of the ALS biomarker protein is achieved through size-based separation of the platelet proteins followed by chemiluminescent detection.

A Capillary Electrophoresis Immunoassay for Protein Biomarker Detection

Het meten van biomarkers in complexe biologische monsters wordt in toenemende mate leidend klinische besluitvorming. We beschrijven een zeer gevoelige methode voor het gelijktijdig meten cardiale myosine bindend eiwit C, creatine kinase MB, troponine I en in serummonsters van patiënten met myocardiaal infarct en gezonde controlepersonen.

Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Er wordt een protocol geboden om structure-switching aptameren voor kleine molecuuldoelen te selecteren op basis van een instelbare strengheid magneetparel selectiemethode. Aptameren geselecteerd met structure-switching eigenschappen zijn gunstig voor assays die een conformationele verandering vereisen om de aanwezigheid van een doel aan te geven, zoals de beschreven gouden nanodeeltjes assay.

Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay

Het ontwerpen en ontwikkelen van een aptameer-gouden nanodeeltjes colorimetrische assay voor de detectie van kleine moleculen in-het-veld toepassingen onderzocht. Bovendien, een smart-inrichting colorimetrische applicatie (app) werd gevalideerd en langdurige opslag van de test werd voor gebruik in het veld.

Design and Development van aptameer-gouden nanodeeltjes gebaseerde Colorimetrisch Testen voor In-the-field Applications

Nanodeeltje-gebaseerde optische sondes zijn ontworpen als een voertuig voor het detecteren van antigenen met behulp van Raman en UV-Vis spectroscopie. Hier beschrijven we een protocol voor het voorbereiden van dergelijke sondes voor een UV-Vis/Raman spectroscopie immunoassay op een manier die toekomstige multiplexing mogelijkheden kan integreren.

Het vervaardigen van een UV-Vis en Raman spectroscopie Immunoassay Platform

Een protocol wordt uitgereikt om te lokaliseren Ag in walvisachtigen weefsels van de lever en de nieren door autometallography. Bovendien is een nieuwe bepaling, genaamd de walvisachtigen histologische Ag assay (CHAA) ontwikkeld voor het inschatten van de concentraties van de Ag in deze weefsels.

Gebruik van Autometallography om te lokaliseren en semi-kwantificeren zilver in walvisachtigen weefsels

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Ontwikkeling van een laterale flow immunochromatografische strip voor snelle en kwantitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen

We beschrijven een recent ontwikkeld immunoassayplatform gebaseerd op de principes van celvrije synthetische biologie en de dot-blot-techniek voor aanpasbare detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera.

Celvrije dot blot als een praktisch en aanpasbaar immunoassayplatform voor de detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera

Leer een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatografische teststrip ontwikkelen voor snelle detectie van walvisachtigen myoglobine ter voorkoming van illegale handel. Deze methode biedt resultaten binnen 5 tot 10 minuten.

Ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen Myoglobin

Meer video's verkennen