Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

Het algemene doel van deze procedure is om de beweging van fluorescent gelabelde eiwitten op plantenceloppervlakken te observeren met epi-fluorescentiemicroscopie met variabele hoek. Dit vat kan ons helpen om vooruitgang te boeken op het gebied van plantencelbiologie, zoals hoe eiwitten werken op platencelbladen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de dynamische real-time van fluorescente aanvalseiwitten te visualiseren voordat we beginnen met de procedure.

Calibreer de lasercenterring en focus van de microscoop volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik vervolgens een objectieflens met vrije lichtgang om het centrum van het plafond van de microscoopruimte te lokaliseren en markeer de positie met een gekleurde afdichting. Vervolgens verlicht u het plafond met een objectieflens en beweegt u het verlichte gebied naar de centrale positie.

Focus vervolgens de laser en stem de positie van de laser fijn af op het centrum van het plafond. Het centeren en focussen van de laser is erg belangrijk voor een succesvolle variabele hoek epi-geurmicroscoop of VAEM-observatie. Gebruikers moeten worden getraind door een professioneel personeelslid van de microscoopfirma voordat ze een experiment beginnen.

Wanneer de microscoop klaar is, doseert u 30 microliter basisbuffer op het midden van een 76 bij 26 millimeter glazen plaatje. Gebruik vervolgens dissectiescharen om een co leadin te verwijderen van een zeven dagen oude zaailing en laat de co leadin met de observatiezijde omhoog drijven op de druppel basisbuffer. Voeg vervolgens 30 microliter basisbuffer toe op het midden van een 18 bij 18 millimeter.

Dek het glas af en draai het dekglas ondersteboven. De oppervlaktespanning zal voorkomen dat de druppel valt, houd het dekglas met pincetten aan een rand vast. Plaats de tegenovergestelde rand op het glazen plaatje zodat de buffer over de co lead-in komt.

Houd vervolgens de rand van het dekglas op de plaat vast. Pas de positie van de druppel aan zodat deze direct boven het oleïne-monster staat en laat het dekglas vallen. Als er geen luchtbellen zijn, gebruikt u pluisvrij papier om de overtollige buffer weg te vegen en brengt u de voorbereiding onmiddellijk over naar de microscoop.

Gebruik helderveldverlichting om de cellen voor observatie te selecteren. Bevestig vervolgens dat het fluorescente eiwit kan worden waargenomen en gebruik epi-fluorescentieverlichting om de Z-aspositie op het celoppervlak in te stellen. Om VAEM uit te voeren, gebruikt u de controllerbox om de invalshoek van de laserstraal te kantelen.

Geleidelijk, terwijl u het livebeeld zorgvuldig in de gaten houdt. Aanvankelijk zal het beeld wazig lijken. Naarmate de laserhoek toeneemt, zal het VAEM-beeld minder wazig worden en uiteindelijk een helder beeld produceren.

Op dit punt stopt u met het verhogen van de laserhoek. Nu fijn. Stem de laserinvalshoek af om een beter beeld te krijgen, waarbij de optische en beeldsensorparameters indien nodig worden aangepast.

Vervolgens, met behulp van de commerciële microscoopsoftware, verwerft u een film als een TIFF-bestand met meerdere pagina's. Hier toont de film GFP-gelabelde stippen die op het oppervlak van STA-modelcellen knipperen. Om de GFP-gelabelde DOT-verblijftijd te kwantificeren met behulp van Fiji, gaat u naar het menu Bestand openen en opent u het verworven TIFF-bestand met meerdere pagina's.

Gebruik het gereedschap voor rechte lijnselectie om een lijn op de gewenste zijde te plaatsen. Gebruik vervolgens de dynamische res-slice-plug-in voor beeldstapels om een grafiekbeeld te genereren. Naarmate de lijn verandert, verandert het grafiekbeeld dynamisch.

Sla het beeld op als een TIFF-bestand onder het menu Bestand, opslaan als tiff. Ga vervolgens naar het menu Procesfilters Gaussiaanse vervaging om een ruisonderdrukking uit te voeren en pas een Gaussiaanse filter toe op de chronograafbeelden. De sigma-straalparameter moet zo nodig worden afgesteld.

Gebruik het gereedschap voor het aanpassen van de drempelwaarde van het beeld om de signaalgebieden te segmenteren door middel van drempelwaarden en open het analyseset-meetmenu. Controleer vervolgens de omtrek van de rechthoek in het venster met metingen en selecteer het minimale aantal pixels dat mogelijk is. Ga vervolgens naar het menu Analyseren, analyseer deeltjes.

Meet de tijd van de geïnteresseerde stip tegen de Y-as en controleer de weergaveresultaten en voeg toe aan managervakken om de gegevenswaarden te bekijken. Ten slotte selecteert u onder het menu Resultatentabel het bestand, sla op als en verwerkt u de dataset van duur van de stipbeelden met de geschikte analysesoftware. Hier worden de verblijfstijden van 185 GFP-patrouille een stippen uit 12 onafhankelijke bijkomende cellen in de achtste editie, gemeten door chm-grafiekanalyse, weergegeven zoals geïllustreerd in de grafiek.

De aangepaste dichtheidsfunctie toonde aan dat de meeste van de GFP-patrouille een stippen resident waren in een bijkomende cel gedurende twee tot tien seconden met een piek van ongeveer 3,5 seconden. Dit suggereert een snelle exocytose-endocytose van de protonpompen op het oppervlak van de bijkomende cel. Na het werken met deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dynamische eiwitten van elk type kunt visualiseren en kwantificeren op het oppervlak van plantencellen met behulp van epi-fluorescentiemicroscopie met variabele hoek.