Name: Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Leer hoe je GFP-gelabelde PATROL1-eiwitten in Arabidopsis thaliana stomata visualiseert met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt real-time observatie van membraantransportdynamiek in plantencellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ik ben Dr. Masaru Fujimoto dankbaar voor zijn technische suggesties voor VAEM. Ik ben ook dankbaar aan Prof. Koh Iba en Dr. Mimi Hashimoto-Sugimoto voor het verstrekken van GFP-PATROL1 transgene planten, en discussies over PATROL1. Ik dank Prof. Seiichiro Hasezawa voor zijn voortdurende steun van mijn werk. Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-subsidie nummer 25711017.

1. Bereiding van Zaailingen <ol><li> Steriliseren van de zaden. <ol><li> Bereid de sterilisatie door toevoeging van 500 pi NaClO (chloor: 5,0%) en 1 ui 10% Triton X-100 om 500 pi steriel water. </li><li> Plaats ca. 10 transgene A. thaliana zaden dragen GFP-PATROL1 8 in een 1,5 ml buis. </li><li> Voeg 1 ml 70% ethanol-oplossing en meng goed door het omkeren vijfmaal. Laat gedurende 1 min. </li><li> Observeer de zaden zinken naar de bodem van de buis. In een schone laminaire stroming kast, verwijder voorzichtig de 70% ethanol met behulp van een micropipet, en voeg 1 ml sterilisatie oplossing. Meng goed door omkeren vijfmaal en laat gedurende 5 min. </li><li> Was de zaden. Nog steeds onder aseptische omstandigheden op een schone bank, verwijder voorzichtig de oplossing met behulp van een micropipet, en voeg 1 ml steriel water. Herhaal dit vijf keer. De gesteriliseerde zaden worden bewaard in steriel water bij 4 ° C gedurende 2 dagen. </li></ol></li><li> Zow de gesteriliseerde zaden op een 0,5% gellan-gom gestold 1/2 Murashige en Skoog medium plaat (pH 5,8) 9. Tape het deksel op de plaat met behulp van twee lagen van chirurgische tape. </li><li> Incubeer de plaat in het donker bij 4 ° C met een koude opslagkamer, O / N. </li><li> Breng de plaat in een groeikamer ingesteld op 23,5 ° C met een 12-uur / 12-uur licht-donker cyclus met 100 umol m -2 s -1 witte lichten, en incubeer gedurende 7 dagen. Zaailingen met zaadlobben van ongeveer 1 mm lang kan vervolgens worden geoogst. </li></ol> 2. Sky Drop Montage van Cotyledon Specimens LET OP: Een belangrijke factor bij het prepareren voor VAEM observatie is het vermijden van het opnemen van luchtbellen tussen het model en het deksel glas. Bubbles sterk verminderen van de beeldkwaliteit van VAEM door het veroorzaken verschillen in de brekingsindex. Een eenvoudige methode die wij &quot;sky drop &#39;hebben genoemd montage, kan worden gebruikt om luchtbellen te vermijdentussen A. thaliana zaadlobben en het deksel glas. Dit moet gebeuren onmiddellijk voor observatie. <ol><li> Plaats 30 gl buffer basale [5 mM 2- (N -morpholino) -ethanesulfonic acid-Tris (MES-Tris) bij pH 6,5, 50 mM KCl, 100 pM CaCl2] in het midden van een glasplaatje (size: 76 x 26 mm, dikte: 1,0-1,2 mm). </li><li> Verwijderen van een zaadlob van een 7-dagen oude zaailing met het ontleden van een schaar. Float de zaadlob met de waarneming naar boven op de basale buffer druppel (Figuur 1, stap 1). </li><li> Plaats 30 gl basale buffer in het midden van een dekglas (grootte: 18 x 18 mm, dikte: 0,12-0,17 mm) (Figuur 1, stap 2). Draai het deksel glas ondersteboven voorzichtig. Oppervlaktespanning de buffer daling kunnen vallen te voorkomen. Houd het deksel glas met een pincet op een rand. Plaats de tegenoverliggende rand van het glaasje zodat de buffer druppel is ongeveer boven de zaadlob. </li><li>Met de rand van het deksel glas nog steeds op de glijbaan, en nog steeds de tegenoverliggende rand met een pincet, stel de positie van de buffer vallen onder de dekking van glas, zodat het direct boven de zaadlob monster (Figuur 1, stap 3). Loslaten van het deksel glas. Monteer een druppel op het monster resulteert in een preparaat zonder luchtbellen. </li><li> Veeg overtollige buffer met behulp van niet-pluizende weefsels. Onmiddellijk houden aan de voorbereiding (zie stap 3). Opmerking: Het is niet nodig om de monsters te verzegelen. </li></ol> 3. VAEM observatie en Movie Acquisition Opmerking: Een omgekeerde microscoop is uitgerust met een TIRF eenheid en TIRF objectieflens met een numerieke apertuur van 1,49: The TIRF microscoopsysteem 9 toegepast in dit onderzoek wordt als volgt beschreven. Voor geautomatiseerde regeling van de laser inloophoek is een schakelkast gebruikt. Groen fluorescent eiwit (GFP) wordt geëxciteerd met een 488 nm optisch gepompte halfgeleiderlaser en thij fluorescentie wordt gedetecteerd door een 510-550 nm banddoorlaatfilter om autofluorescentie voorkomen chloroplasten. De gemeten maximale waarde van vezels uitgangsvermogen is 13,0-13,5 mW. Voor de detectie, een elektron te vermenigvuldigen charge-coupled device (EM-CCD) camera hoofd-systeem en een C-mount camera vergroting verandering unit worden gebruikt. <ol><li> Kalibreer de laser centreren en richten volgens de instructies van de fabrikant. OPMERKING: Deze stap is cruciaal voor nauwkeurige VAEM waarnemingen. Het wordt sterk aanbevolen dat de periodieke controles van de aanpassing procedures laser pad, afhankelijk van uw microscoop, worden uitgevoerd. <ol><li> Bepaal de centrale positie verlicht met een objectief-lens vrije lichtpad op het plafond van de microscopie kamer. Naar de centrale positie te markeren, zet een gekleurde cirkel zegel op het plafond (afbeelding 2, stap 1, 2). </li><li> Verlichten het plafond met een objectieflens (figuur 2, stap 3, 4). Verplaats de illuminated regio in de middelste stand (figuur 2, stap 5). Concentreer de laser (figuur 2, stap 6). Fijn afstellen van de positie van de gefocusseerde laser naar het midden (figuur 2, stap 7). </li></ol></li><li> Stel een exemplaar op het podium van de microscoop en selecteer cellen voor observatie met behulp van helderveld verlichting. </li><li> Controleer of de fluorescerende eiwit kan worden waargenomen in de cellen, en de ingestelde positie van de z-as op het celoppervlak via epifluorescentie belichting (Figuur 3A). </li><li> Voeren VAEM waarnemingen. <ol><li> Neig de ingang hoek van de laserstraal geleidelijk met de doos controller. Op hetzelfde moment, het toezicht op de livebeeld zorgvuldig. In eerste instantie zal het beeld wazig zijn (Figuur 3B). </li><li> Als de laser hoek toeneemt, zal het beeld op de VAEM minder vervaagd, een helder beeld (Figuur 3C en D) uiteindelijk produceren. Op dit punt, stop increazingen de laser hoek. Als de fluorescentie signaal verloren, afnemen tot een ondieper hoek. </li><li> Fine-tunen van de laser ingang hoek om een ​​beter beeld te krijgen. Fine-tuning van de positie van de z-as kan ook het verbeteren van het beeld. Indien nodig, de optische parameters (laservermogen, golflengte en filter set) en de beeldsensor parameters [beeldgrootte, belichtingstijd, winst, digitizer en elektron te vermenigvuldigen (EM) winst]. OPMERKING: Bij de TIRF microscoop uitrusting hierboven beschreven representatieve parameters als volgt. Vergroting van de lens vlak voor de camera: 2X; Laser-uitgang: 1,0 mW; Beeldformaat: 512 × 512 pixels; Belichtingstijd: 100 msec; Gain: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; en EM winst: 100. </li></ol></li><li> Verwerven van een film als een multi-page TIFF image-bestand met de commerciële microscoop software. Hier is de film van met GFP gemerkte dots knippert op het oppervlak van stomatale cellen. OPMERKING: representatief beeld acquisitie voorwaarden zijn foldieptepunten. Acquisitie modus: Stroom naar RAM; Aantal beelden: 600; en multi-page TIFF bestandsgrootte: ~ 302 MB. </li></ol> 4. kymograaf Analyse voor kwantificatie van GFP-gelabelde Dot Residence tijd met behulp van Fiji Software <ol><li> Installeer Fiji (Fiji is slechts ImageJ &#39;) software 10 met behulp van de instructies van de auteurs (http://fiji.sc/Fiji). </li><li> Run Fiji en open de verworven multi-page TIFF-bestand met behulp van de Fiji-menu &quot;Bestand-Open&quot;. </li><li> Plaats een lijn op de plaats van belang, met behulp van de Fiji-werkbalk menu &quot;Rechte Lijn Selection Tool&quot;. Optioneel gebruik maken van de &quot;gesegmenteerde Line Selection Tool&quot; of &quot;Freehand Line Selection Tool&quot;. In de hier gepresenteerde resultaten is een rechte lijn van 100 pixels (overeenkomend met 8,0 um) subsidiair cellen (Figuur 4A) geplaatst. </li><li> Maak kymograaf beeld met behulp van de Fiji-menu &quot;Beeld-Stacks-Dynamic Reslice een </em&gt; &#39;(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Figuur 4B). Eventueel &quot;Flip verticaal&quot; en &quot;Rotate 90 graden&quot; in een vakje raam zijn ook (niet gebruikt in de hier gepresenteerde resultaten). De x- en y-as beeld kymograaf geven de lijn positie (overeenkomend met 100 pixels 8,0 micrometer) en observatie tijd (600 pixels dat overeenkomt met 60 sec), respectievelijk. Als het beeld kymograaf niet bevredigend is, de positie en het type (rechte, gesegmenteerd en uit de vrije hand) van de lijn op het meerdere pagina&#39;s kan worden gewijzigd. Als de lijn verandert, beeld kymograaf dynamisch verandert. Sla beeld kymograaf als een TIFF-bestand met behulp van de Fiji-menu &quot;Bestand-Save As-Tiff&quot;. </li><li> Meet de lengte van de blob in de richting van de tijdas. <ol><li> Om geluidsreductie te voeren, breng dan een Gauss-filter om de kymograaf beelden met behulp van de Fiji-menu &quot;-Filters-Gaussian Blur&quot;. De &quot;Sigma (Radius) &quot;parameter instelbaar is (1 pixel radius wordt gebruikt voor de gepresenteerde resultaten). </li><li> Segment het signaal regios drempelen, met behulp van de Fiji-menu &quot;Beeld-Adjust-drempel&quot;. NB: Er zijn verschillende drempelwaarden algoritmen om uit te kiezen. In gepresenteerde resultaten, werd de &quot;Yen&quot; algoritme gekozen (Figuur 4C). </li><li> Bereid je voor om de tijd (y) te meten -as lengte van de blob met het menu &quot;Analyseren-Set Metingen&quot;. Controleer de &quot;begrenzende rechthoek&quot; in het venster &quot;Set Metingen&quot;. Uitstek het gebied set moet zo klein mogelijk zijn, om ruis uit te sluiten. Hier werd de minimale oppervlakte vastgesteld op 50 pixels. Meet de tijd (y) -as lengte van de blob met het menu &quot;Analyze-Analyseer Deeltjes&quot;. Om het resultaat te verkrijgen waarden en bewijzen dat de geloofwaardigheid van de meting regio&#39;s, controleer de &quot;Toon resultaten&quot; en &quot;toevoegen aan Manager &lt;/ em&gt; &quot;dozen. </li><li> Waarden in de &quot;hoogte&quot; kolom zijn de tijd (y) -as lengtes voor de gemeten blob (Figuur 4D). Sla de waarden met behulp van het menu Results tafel &quot;Bestand-opslaan als&quot; en bereken en verwerken van de dataset van het beeld blob duur met behulp van een statistisch pakket en / of spreadsheet-software (Figuur 4E). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+dynamics+and+functional+redundancy+of+the+Arabidopsis+dynamin-related+isoforms+DRP1A+and+DRP1C+during+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development.</a> Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).</li>
<li>Fujimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+dynamin-related+proteins+DRP2B+and+DRP1A+participate+together+in+clathrin-coated+vesicle+formation+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).</li>
<li>Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+microfilament+dynamics+and+actin+side-binding+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).</li>
<li>Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtFH1+formin+mutation+affects+actin+filament+and+microtubule+dynamics+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).</li>
<li>Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable-angle+epifluorescence+microscopy%3A+a+new+way+to+look+at+protein+dynamics+in+the+plant+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex.</a> Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).</li>
<li>Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+of+intact+cells+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 7 (27), (2011).</li>
<li>Hashimoto-Sugimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Munc13-like+protein+in+Arabidopsis+mediates+H%2B-ATPase+translocation+that+is+essential+for+stomatal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses.</a> Nat. Commun. 4, 2215(2013).</li>
<li>Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+environmental+responses+of+PATROL1+in+Arabidopsis+subsidiary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells.</a> Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+wall+of+the+Arabidopsis+pollen+tube-spatial+distribution%2C+recycling%2C+and+network+formation+of+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides.</a> Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).</li>
<li>Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+3-kinase+and+4-kinase+have+distinct+roles+in+intracellular+trafficking+of+cellulose+synthase+complexes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).</li>
<li>Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+PIP2%3B+1+dynamics+and+partitioning+reveals+multiple+modes+of+Arabidopsis+plasma+membrane+aquaporin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation.</a> Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).</li>
<li>Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+membrane+microdomain-associated+protein%2C+Arabidopsis+Flot1%2C+is+involved+in+a+clathrin-independent+endocytic+pathway+and+is+required+for+seedling+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development.</a> Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).</li>
<li>Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filament+dynamics+are+dominated+by+rapid+growth+and+severing+activity+in+the+Arabidopsis+cortical+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array.</a> J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).</li>
<li>Ueda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+endoplasmic+reticulum+motility+and+F-actin+organization+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

In deze video artikel, zijn protocollen gegeven voor het bewaken en meten van het dynamische gedrag van GFP-PATROL1 stippen op de stomatale complex van Arabidopsis thaliana. Zoals hier getoond, VAEM observatie is een krachtig hulpmiddel voor live-beeldvorming van plantencel oppervlakken. Onder dezelfde omstandigheden hier voor GFP-PATROL1 controle, was er zeer weinig fluorescentie fotobleken in de voor 1 min video capture monster, omdat de zeer gevoelige EM-CCD maakt het gebruik van een relatief zwakke laser VA...

Het oppervlak van de plantencel, inclusief het plasmamembraan en het direct aangrenzende cytoplasma, is het belangrijkste gebied van een plantencel voor het waarnemen en integreren van biotische en abiotische signalen uit de extracellulaire omgeving. In reactie op deze signalen ondergaan componenten van het celoppervlak, inclusief plasmamembraaneiwitten en het corticale cytoskelet, dynamische veranderingen, op een tijdschaal van seconden tot minuten1-4. Dus, real-time en hoog-resolutie beeldvorming van fluorescente eiwitten op het celoppervlak kan de reacties van een plant op omgevingssignalen op moleculair niveau verduidelijken.
Confocale laser scanning microscopie is een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van de lokalisatie van fluorescent gelabelde eiwitten3, maar het is vaak moeilijk om de dynamische eiwitreacties in real-time te monitoren vanwege de relatief lange opnametijden. Een opkomende techniek voor real-time monitoring van eiwitten in de plantencel is variabele hoek epifluorescentie microscopie (VAEM), een aanpassing van apparatuur die meestal wordt gebruikt voor totaal interne reflectie fluoresceren (TIRF) microscopie. In TIRF microscopie is de fluoresceren-excitatieverlichtingsbron een evanescent lichtveld dat wordt gegenereerd wanneer de invalshoek van de laser ondiep genoeg is om licht volledig intern te reflecteren op het glas-water grensvlak. De penetratiediepte van het evanescente lichtveld is ongeveer 100 nm. TIRF microscopie is een uitstekend hulpmiddel voor single molecuul beeldvorming, zoals de detectie van exocytose in dierlijke cellen5. Evanescent licht kan echter geen plasmamembranen of het corticale cytoplasma in plantencellen bereiken, omdat ze dikke celwanden hebben. Recentelijk is TIRF microscopie apparatuur aangepast door plantencel biologen, die observeerden dat een laser, als deze iets dieper wordt ingezet dan wanneer het wordt gebruikt om totale interne reflectie fenomenen te induceren, het oppervlak van plantencel monsters kan exciteren, resulterend in hoogwaardige plantencel beeldvorming6,7. De excitatie verlichtingsdiepte wordt gevarieerd door de invalshoek van de laser aan te passen; daarom wordt deze techniek beschreven als VAEM. Dit optisch systeem wordt ook wel variabele hoek TIRF microscopie (VA-TIRFM) genoemd omdat er een mogelijkheid is dat totale reflectie plaatsvindt op het celwand-periplasma grensvlak7, maar de term VAEM wordt in dit artikel gebruikt, zoals in het eerste rapport in planten6.
Het doel van dit protocol is om praktische procedures te demonstreren voor het gebruik van VAEM om fluorescent gelabelde eiwitdynamiek op plantenceloppervlakken te visualiseren. Daarnaast wordt een beeldanalyse protocol beschreven om de verblijfstijd (duur van aanwezigheid) van moleculen te kwantificeren voor VAEM filmanalyse. GFP-PATROL1 stippen knipperen op stomata complex cellen in Arabidopsis thaliana cotyledonen wordt gebruikt als voorbeeld. PATROL1 werd geïdentificeerd door forward genetische benaderingen als een oorzakelijk gen van een stomata respons defect mutant in A. thaliana8. PATROL1 is een plantenhomoloog van MUNC-13, dat een priming factor is in synapsische blaasjes exocytose8. In reactie op omgevingssignalen, zoals licht of vochtigheid, wordt gedacht dat PATROL1 reversibel de levering van een protonenpomp aan plasmamembranen in het stomata complex reguleert. Stomatal complexen bestaan elk uit een paar begeleidende cellen8 en bijbehorende cellen9, en ze hebben een protonenpomp nodig voor stomata beweging. In deze cellen lokaliseert GFP-gelabeld PATROL1 naar stippen-achtige structuren die minder dan 1 minuut op het plasmamembraan blijven9.

<table><tbody><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>TIRF unit</td><td>Olympus</td><td>IX3-RFAEVAW</td><td></td></tr><tr><td>TIRF objectieflens&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100 &times; OTIRF&nbsp;</td><td>NA = 1.49</td></tr><tr><td>Laser hoekbesturingsbox</td><td>Chuo Seiki</td><td>QT-AK</td><td></td></tr><tr><td>Optisch gepompte halfgeleiderlaser</td><td>Coherent</td><td>SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser</td><td></td></tr><tr><td>510&ndash;550 nm bandpassfilter</td><td>Olympus</td><td>U-FBNA</td><td></td></tr><tr><td>EM CCD-camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ImagEM C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>C-mount cameravergrotingswisselingseenheid&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph-software</td><td>Molecular Devices</td><td>MetaMorph versie 7.7.11.0</td><td></td></tr><tr><td>TIRF-microscopiehandleiding</td><td>Olympus</td><td>AX7385</td><td>Instructies: Total Internal Reflection Illumination System (Gedrukt in Japan op 24 augustus 2012)</td></tr><tr><td>Dompelolie</td><td>Olympus</td><td>Immersion Oil Typr-F</td><td>ne = 1.518 (23 graden)</td></tr></tbody></table>

real-time beeldvorming van plant cell surface dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Het celoppervlak van een plant is zijn interface voor het waarnemen van omgevingssignalen; het reageert met cellulaire biologische veranderingen zoals membraantransport en herschikking van het cytoskelet. Real-time en hoogwaardige beeldanalyse van dergelijke intracellulaire gebeurtenissen zal het begrip van de plantencelbiologie op moleculair niveau vergroten. Variabele hoek epifluorescentiemicroscopie (VAEM) is een opkomende techniek die hoogwaardige, time-lapse beelden levert van fluorescentie-gelabelde eiwitten op het oppervlak van plantencellen. In dit artikel worden praktische procedures beschreven voor VAEM monstervoorbereiding, aanpassing van het VAEM optische systeem, het vastleggen van films en beeldanalyse. Als voorbeeld van VAEM observatie, worden representatieve resultaten gepresenteerd over de dynamiek van PATROL1. Dit is een eiwit dat essentieel is voor stomatale beweging, waarvan wordt gedacht dat het betrokken is bij de levering van protonpompen aan plasmamembranen in het stomatale complex van Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observatie van begeleidende cellen en hulpcellen in A. thaliana cotyledonen toonde aan dat fluorescentie-gelabeld PATROL1 verscheen als puntvormige structuren op plasmamembranen voor enkele seconden en vervolgens verdween. Kymograafanalyse van VAEM filmgegevens bepaalde de tijdsverdeling van de aanwezigheid (genoemd'verblijfstijd') van de puntvormige structuren. Het gebruik van VAEM wordt besproken in de context van dit voorbeeld.

In deze video artikel, de protocollen voor VAEM observatie van GFP-PATROL1 in A. thaliana zaadlob stomatale complex cellen zijn aanwezig. Hemel druppel montage is een eenvoudige bereidingswijze die kunnen helpen bij het ​​verminderen van het optreden van luchtbellen in VAEM voorbereidingen van A. thaliana zaadlobben (figuur 1). Overtilting van de invoer laser en / of z-positionering specimens VAEM zal een onduidelijk beeld te krijgen. Als dat gebeurt, is het raadzaam om opnieuw te star...

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe fluorescent-gelabelde eiwit dynamiek op plantencel oppervlakken met een variabele hoek epifluorescentiemicroscopie, waaruit blijkt knipperende stippen van GFP-gelabeld PATROL1, een membraan mensenhandel eiwit te controleren, in de cel cortex van de stomatale complex in Arabidopsis thaliana.

Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Het algemene doel van deze procedure is om de beweging van fluorescent gelabelde eiwitten op plantceloppervlakken te observeren met behulp van epi-fluorescentiemicroscopie met variabele hoek. Deze methode kan ons helpen vooruitgang te boeken in het veld van de plantcelbiologie, zoals het inzicht in hoe eiwitten functioneren op plantceloppervlakken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de real-time dynamiek van fluorescent gelabelde eiwitten te visualiseren voordat de procedure wordt gestart.Kalibreer de lasercentrering en focussering van de microscoop volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik vervolgens een objectieflens met een vrije lichtweg om het midden van het plafond van de microscopieruimte te lokaliseren en markeer deze positie met een gekleurde zegel. Verlicht vervolgens het plafond met een objectieflens en verplaats het verlichte gebied naar de middenpositie.Focus vervolgens de laser en stem de positie van de laser nauwkeurig af op het midden van het plafond. Het centreren en focussen van de laser is essentieel voor een succesvolle observatie met een variabele hoek epi-scent microscoop (VAEM). Gebruikers dienen door een prof

real-time-imaging-plant-cell-surface-dynamics-with-variable-angle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We brengen verslag uit een methode voor de introductie, tracking en kwantitatieve analyse van de GFP expressie in plantencellen. Deze methode maakt gebruik van een speciaal ontworpen robotica systeem voor semi-continue foto collectie van grote aantallen monsters, in de tijd. We tonen ook aan het gebruik van ImageJ en ImageReady voor de analyse van foto-serie.

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

We beschrijven het gebruik van perfluorodecalin als een infiltratieve montage medium. Dit is een eenvoudige methode voor het verbeteren van de diepte van beeldvorming...

Een eenvoudige methode voor de Imaging Arabidopsis Met behulp van Leaves Perfluorodecalin als een Infiltratieve Imaging Medium

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie is een krachtige aanpak van de structuren te observeren in de buurt van het celoppervlak bij hoge contrast en temporele resolutie. We laten zien hoe TIRF kan worden gebruikt om eiwitten dynamiek te studeren aan de cortex van de celwand-ingesloten bacteriën en schimmels cellen.

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Dit artikel geeft een protocol voor de teelt van Arabidopsis zaailingen in de RootChip, een microfluïdische imaging platform dat automatisch besturen van de voorwaarden voor groei combineert met microscopische wortel monitoring en FRET-gebaseerde meting van intracellulaire metaboliet niveaus.

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Dit protocol toont een methode voor de bereiding van plantenmonsters voor lichtbladmicroscopie. De opstelling wordt gekenmerkt door het verticaal monteren van de plant op het oppervlak van een gel en het laten groeien in gecontroleerde lichte omstandigheden. Dit maakt langdurige observatie van de ontwikkeling van plantenorganen mogelijk in gestandaardiseerde omstandigheden.

Lichtwaaier fluorescentiemicroscopie van plantenwortels Kweken op het oppervlak van een gel

Live confocale imaging biedt biologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de live confocale beeldvorming van de ontwikkeling van Arabidopsis bloemen.

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

Plant defensinen spelen een belangrijke rol in de verdediging van de plant tegen ziekteverwekkers. Voor effectief gebruik van deze antischimmel peptiden als antischimmel gemachtigden, begrijpen hun vervoerswijzen actie (MOA) is van cruciaal belang. Hier, wordt een live-cel beeldvorming beschreven om te bestuderen van kritieke aspecten van de MOA van deze peptiden.

Live-cel beeldvorming van schimmel cellen om modi van binnenkomst en Subcellular Localisatie van antischimmel Plant defensinen te onderzoeken

Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.

Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol om de 3D-celwanddynamiek van levend mosweefsel in beeld te brengen, waardoor de onthechting van celwanden in ggb-mutanten en verdikking van celwandpatronen in het wilde type tijdens de ontwikkeling gedurende een lange periode mogelijk wordt.

3-D Time-Lapse Beeldvorming van celwanddynamica met behulp van calcofluor in de Moss Physcomitrium patens

Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.

Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen

Leer hoe je GFP-gelabelde PATROL1-eiwitten in Arabidopsis thaliana stomata visualiseert met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt real-time observatie van membraantransportdynamiek in plantencellen mogelijk.

Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

Meer video's verkennen