Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

Het algemene doel van deze procedure is om de beweging van fluorescent gelabelde eiwitten op plantceloppervlakken te observeren met behulp van epi-fluorescentiemicroscopie met variabele hoek. Deze methode kan ons helpen vooruitgang te boeken in het veld van de plantcelbiologie, zoals het inzicht in hoe eiwitten functioneren op plantceloppervlakken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de real-time dynamiek van fluorescent gelabelde eiwitten te visualiseren voordat de procedure wordt gestart.

Kalibreer de lasercentrering en focussering van de microscoop volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik vervolgens een objectieflens met een vrije lichtweg om het midden van het plafond van de microscopieruimte te lokaliseren en markeer deze positie met een gekleurde zegel. Verlicht vervolgens het plafond met een objectieflens en verplaats het verlichte gebied naar de middenpositie.

Focus vervolgens de laser en stem de positie van de laser nauwkeurig af op het midden van het plafond. Het centreren en focussen van de laser is essentieel voor een succesvolle observatie met een variabele hoek epi-scent microscoop (VAEM). Gebruikers dienen door een professionele medewerker van het microscopenbedrijf te worden geïnstrueerd voordat zij met een experiment beginnen.

Wanneer de microscoop gereed is, breng dan 30 µL basale buffer aan in het centrum van een glazen objectglas van 76 bij 26 mm. Gebruik vervolgens een dissectieschaar om een cotyledon van een zeven dagen oude zaailing te verwijderen en laat de cotyledon met de observatiezijde naar boven drijven op de druppel basale buffer. Voeg daarna 30 µL basale buffer toe aan het centrum van een dekglas van 18 bij 18 mm.

Plaats het dekglas en keer het dekglas om. De oppervlaktespanning zal voorkomen dat de druppel valt terwijl u het dekglas met een pincet aan één rand vasthoudt. Plaats de tegenovergestelde rand op het objectglas zodat de buffer over de co lead-in ligt.

Houd vervolgens de rand van het dekglas op het objectglas. Pas de positie van de druppel aan zodat deze zich direct boven het oleïne-monster bevindt en laat het dekglas zakken. Als er geen luchtbellen aanwezig zijn, gebruik dan pluisvrije tissues om het overtollige buffer weg te vegen en plaats de preparatie onmiddellijk onder de microscoop.

Select de cellen voor observatie met behulp van brightfield-verlichting. Bevestig vervolgens of het fluorescerende eiwit waarneembaar is en gebruik epifluorescentieverlichting om de Z-aspositie op het celoppervlak in te stellen. Om VAEM uit te voeren, gebruikt u de controllerbox om de invalshoek van de laserstraal aan te passen.

Geleidelijk, terwijl het live-beeld zorgvuldig wordt gecontroleerd. In het begin zal het beeld wazig lijken. Naarmate de laserhoek toeneemt, zal het VAEM-beeld minder wazig worden en uiteindelijk een helder beeld produceren.

Stop op dit punt met het verhogen van de laserhoek. Stem nu de invalshoek van de laser nauwkeurig af om een beter beeld te verkrijgen, waarbij indien nodig de optische parameters en de parameters van de beeldsensor worden aangepast.

Neem vervolgens met de commerciële microscopesoftware een film op als een multi-page TIFF-afbeeldingsbestand. Hier toont de film GFP-gelabelde stippen die knipperen op het oppervlak van STA-modelcellen. Om de verblijftijd van de GFP-gelabelde DOTs te kwantificeren met Fiji, gaat u naar het menu bestand openen en opent u het opgenomen multi-page TIFF-bestand.

Gebruik de selectietool voor rechte lijnen om een lijn op het gebied van interesse te plaatsen. Gebruik vervolgens de plug-in 'image stacks dynamic res slice' om een grafiekbeeld te genereren. Terwijl de lijn wordt verplaatst, zal het grafiekbeeld dynamisch veranderen.

Sla de afbeelding op als een TIFF-bestand via het menu 'bestand', 'opslaan als tiff'. Ga vervolgens naar het menu 'procesfilters', 'Gaussiaanse vervaging' om een ruisonderdrukking uit te voeren, en pas een Gaussiaans filter toe op de chronografische beelden. De parameter voor de sigma-straal moet naar behoefte worden afgesteld.

Segmenteer de signaalgebieden door drempelwaarden in te stellen met de tool 'image adjust threshold' en open het menu 'analyze set measurements'. Vink vervolgens 'bounding rectangle' aan in het venster 'set measurements' en selecteer het minimum aantal mogelijke pixels. Ga daarna naar het menu 'analyze, analyze particles'.

Meet de tijd van de betreffende stip ten opzichte van de Y-as, controleer de weergegeven resultaten en voeg deze toe aan de beheerboxen om de datawaarden te bekijken. Selecteer vervolgens in het menu van de resultatentabel 'bestand', 'opslaan als' en verwerk de dataset van de duur van de stip-beelden met de geschikte analysesoftware. Hier worden de verblijftijden van 185 GFP patrol one stippen uit 12 onafhankelijke dochtercellen in eighth edin, gemeten via chm-grafiekanalyse, weergegeven zoals geïllustreerd in de grafiek.

De gefitte dichtheidsfunctie onthulde dat de meeste GFP patrol one-stippen tussen de twee en 10 seconden in een bijcel verbleven, met een piek rond 3,5 seconden. Dit suggereert een snelle exocytose-endocytose van de protonpompen op het oppervlak van de bijcel. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dynamiek van eiwitten van dit type op het plantenceloppervlak kunt visualiseren en kwantificeren met behulp van variabele hoek epi-fluorescentiemicroscopie.