-Air bemonsterd Filter Analyse voor endotoxinen en DNA Content

Het algemene doel van deze procedure is om te beschrijven hoe endotoxine- en DNA-gehaltes in geëxtraheerde luchtdeeltjes die op filters zijn verzameld, nauwkeurig kunnen worden geanalyseerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar biologische aerosolen binnenshuis en buitenshuis, zoals het begrijpen van gezondheidsaspecten. De filterbemonsteringsprocedure zal worden gedemonstreerd door Yinon Mazar, een promovendus uit mijn laboratorium.

Gebruik voor bemonstering met een hoog volume filters van kwartsvezel. Of kies het specifieke type filter en een filterafsnijgrootte die het beste aansluiten bij de behoeften van het onderzoek. Voorbehandel de filters die bedoeld zijn voor de bemonstering van organische en biologische verbindingen door ze eerst individueel in aluminiumfolie te wikkelen.

Bak ze vervolgens in een laboratoriumoven bij 450 °C gedurende ten minste vijf uur. Hiermee worden alle reeds aanwezige organische residuen vernietigd. Bewaar de gebakken filters bij 20 °C tot ze worden gebruikt voor bemonstering.

Reinig en desinfecteer vervolgens de high volume sampler, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats daarna het voorgebakken filter in de filtercassette en gebruik de sampler volgens de instructies van de fabrikant om een representatief monster te verzamelen. Snijd in een biosafety cabinet klasse II 22 cirkelvormige stukjes schoon, voorgebakken filtermateriaal met een schone kurkenborer met een diameter van 1,12 centimeter.

Gebruik deze stukken om een reeks met endotoxine gespikeerde filters te bereiden om als controles te gebruiken. Snijd vervolgens de filters die het verzamelde monster bevatten uit met een schone kurkboreur van 1,12 centimeter diameter en plaats elk monster in een eigen pyrogeenvrije buis van twee milliliter. Breng daarnaast de gedroogde endotoxine gespikeerde filters over in afzonderlijke pyrogeenvrije buizen van twee milliliter.

Voeg één milliliter pyrogeenvrij water toe aan elke buis. Schud deze vervolgens gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met een laboratoriumschudmachine. Centrifugeer de monsterbuisjes daarna in een microcentrifuge bij 375 ×g gedurende 10 minuten.

Breng vervolgens de supernatant die de endotoxinen bevat over naar een nieuwe pyrogeenvrije buis van twee milliliter. Bereid een pyrogeenvrije 96-well microplaat met een platte bodem en een deksel voor de endotoxinentest, door eerst de monsterlocaties uit te zetten.

Zet vervolgens de microplaatlezer aan en programmeer deze voor een kinetische reactie bij 37 °C met schudden elke vijf minuten. Volg dit met metingen bij 405 nm. Herhaal het schudden van vijf minuten en het uitlezen van de plaat 18 keer.

Laad de monsters in de plaat door 50 µL van de standaard endotoxine-oplossingen, die eerder zijn gebruikt om de filters te spiken, in de rijen A1 tot en met A10 en B1 tot en met B10 aan te brengen. Plaats de blanco's in A11, A12, B11 en B12. Voeg vervolgens het supernatant van het gecentrifugeerde extract van de gespikede filters en de bijbehorende blanco's toe aan de rijen C en D. Voeg daarna de supernatanten van de experimentele monsters en blanco's toe aan de overige wells naar behoefte.

Om de test te activeren, voegt u snel 50 µL van de limulus amebocyte glycate-oplossing toe aan elke put. Schud de plaat voorzichtig horizontaal voordat u deze in de platenlezer plaatst en de experimentele run start.

Verwijder na voltooiing de plaat uit de plaatlezer. Bepaal het endotoxinegehalte in elke monster met behulp van de standaardcurve en bereken daarnaast de efficiëntie waarmee de endotoxinen uit de monsterfilters worden geëxtraheerd. Bereid eerst de filters die zijn gespiked met DNA voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Bereid voor elk filtermonster een mengsel voor van zuurgewassen glasparels in steriele buisjes van 0,5 milliliter, bestaande uit 0,1 gram parels met een diameter van 425 tot 600 micrometers en 0,3 gram parels met een diameter van minder dan of gelijk aan 106 micrometers. Snijd vervolgens drie ronde stukjes uit willekeurig geselecteerde locaties op elk filtermonster met een gedesinfecteerde kurkenborer met een diameter van 1,12 centimeter. Plaats de filtermonsters in individuele schroefdopbuisjes van twee milliliter.

Voeg vervolgens het mengsel van glaskralen toe aan elke buis, samen met 60 µL van de cellysebuffer die bij de DNA-extractiekit is geleverd. Sluit de buizen en plaats de monsters in de beadbeater. Gebruik de beadbeater om de gefilterde cellen gedurende één minuut mechanisch te lyseren en koel de monsters vervolgens een minuut lang op ijs.

Herhaal deze cyclus vijf keer. Volg vervolgens het protocol van de kitleverancier en extraheer het DNA uit de gelyseerde cellen. Laad na elutie het geëlueerde monster voor een tweede maal in de extractiekolom om de DNA-opbrengst te verbeteren.

Schakel het quantitative PCR-instrument vooraf in om het apparaat de tijd te geven om op te warmen. Voer in een nieuw programmaprofiel de details voor de quantitative PCR-run in de besturingssoftware van het instrument in. Desinfecteer vervolgens het werkoppervlak met een DNA-oppervlaktendecontaminant en werk uitsluitend met steriele buisjes, tips en reagentia.

Plaats daarnaast een emmer ijs naast de werkbank en zet het tac polemoraris-mengsel in de emmer. Bereid het kwantitatieve PCR-reactiemengsel voor zoals beschreven in tabel vier van het bijbehorende tekstprotocol. Bewaar het reactiemengsel in het donker en op ijs tot gebruik.

Plaats vervolgens een schone microplaat in een platenhouder om te voorkomen dat deze het werkoppervlak raakt en om deze schoon te houden. Voeg één microliter standaard-DNA, monster-DNA of nucleasevrij water in triplikaat toe aan de wells van de kwantitatieve PCR-microplaat. Voeg daarna negen microliters van de master reaction mix toe aan elke reactiewell.

Bedek de plaat na voltooiing met optische adhesiefilm en verzegel deze stevig aan alle zijden. Centrifugeer de plaat gedurende één minuut bij 1000 ×g in een centrifuge die is uitgerust met plaatbakjes, voordat u deze in de thermocycler plaatst. Activeer tot slot het voorbereide kwantitatieve PCR-programma en start de run.

Tijdens de endotoxine-extractie worden filtermonsters gecentrifugeerd om de endotoxine uit het filter te extraheren. Verschillende centrifugatiesnelheden leiden tot verschillende extractie-efficiënties, vooral bij hogere endotoxineconcentraties.

Er moet een voorlopige test voor de extractie-efficiëntie worden uitgevoerd voor het gekozen specifieke filter en het toegepaste protocol. Hogere extractie-efficiënties worden behaald bij het toevoegen van standaarden aan schone filters in vergelijking met bemonsterde kwartsfilters, en beide efficiënties zijn lager dan die welke wordt bereikt via directe detectie van de standaardoplossing. Wanneer de methode onder controle is, kan de endotoxine-analyse in drie en een halve uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals DNA-sequencing, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over het transport van organismen in de atmosfeer. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe endotoxinen en DNA efficiënt uit luchtmonsterfilters kunnen worden geëxtraheerd en nauwkeurig kunnen worden geanalyseerd.