Name: -Air bemonsterd Filter Analyse voor endotoxinen en DNA Content (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer endotoxine- en DNA-analyse van luchtbevochtigde filters voor biologisch aerosolonderzoek. Deze methode helpt onderzoekers gezondheidsvragen in binnen- en buitenomgevingen te beantwoorden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Dr. Yoav Barak van de Faculteit Scheikunde, Weizmann Instituut, voor ondersteuning en advies. Dit onderzoek werd ondersteund door de Israel Science Foundation (subsidie # 913/12), en door de Minerva Foundation met financiering van het Federale Duitse Ministerie voor Onderwijs en Onderzoek.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+of+Air+Sampling+and+Analysis%22">Methods of Air Sampling and Analysis</a>. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).</li>
<li>Costa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+carbonaceous+aerosols+in+Emilia-Romagna+%28Northern+Italy%29+based+on+two+fall%2Fwinter+field+campaigns%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Res%22%5BJournal%5D)">Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns.</a> Atmos. Res. , (2015).</li>
<li>Brent, L. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development%2C+enhancement%2C+and+evaluation+of+aircraft+measurement+techniques+for+national+ambient+air+quality+standard+criteria+pollutants+%5B%5D%22">Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]</a>. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).</li>
<li>Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+elemental+analysis+of+atmospheric+aerosols+for+evaluating+human+health+impacts+of+aerosols+in+East+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia.</a> Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).</li>
<li>Hospodsky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+airborne+fungal+and+bacterial+concentrations+and+emission+rates+in+six+occupied+children%27s+classrooms%5BTitle%5D)+AND+%22Indoor+air%22%5BJournal%5D)">Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms.</a> Indoor air. , (2014).</li>
<li>Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+Bacterial+Populations+Above+Desert+Soils+of+the+McMurdo+Dry+Valleys%2C+Antarctica%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica.</a> Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).</li>
<li>Ovadnevaite, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicron+NE+Atlantic+marine+aerosol+chemical+composition+and+abundance%3A+Seasonal+trends+and+air+mass+categorization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Geophys.+Res.+Atmos%22%5BJournal%5D)">Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization.</a> J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).</li>
<li>Lodge, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ES%26T+Books%3A+Methods+of+Air+Sampling+and+Analysis%2C+3rd+ed%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed.</a> Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Aerosol+Measurement%3A+Principles%2C+Techniques%2C+and+Applications%22">Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications</a>. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).</li>
<li>Vincent, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVincent%2C+JH+%22Aerosol+Sampling%3A+Science%2C+Standards%2C+Instrumentation+and+Applications%22">Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2007).</li>
<li>Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Endotoxins+in+Bioaerosols+at+Workplace%3A+A+Critical+Review+of+Literature+and+a+Standardization+Issue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Occup.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue.</a> Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).</li>
<li>Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+elemental+analysis+of+atmospheric+aerosols+for+evaluating+human+health+impacts+of+aerosols+in+East+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia.</a> Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).</li>
<li>Lewtas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+combustion+emissions%3A+Characterization+of+causative+agents+and+mechanisms+associated+with+cancer%2C+reproductive%2C+and+cardiovascular+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.-Rev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects.</a> Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).</li>
<li>Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+aerosol+as+a+possible+source+for+endotoxins+in+coastal+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total.+Environ%22%5BJournal%5D)">Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas.</a> Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).</li>
<li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clottable+protein+in+Limulus%3A+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Diath.+Haemorrh%22%5BJournal%5D)">Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
<li>O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+aerosol+production%3A+a+review+of+the+current+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+A%22%5BJournal%5D)">Marine aerosol production: a review of the current knowledge.</a> Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).</li>
<li>O'Dowd, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenically+driven+organic+contribution+to+marine+aerosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biogenically driven organic contribution to marine aerosol.</a> Nature. 431, 676-680 (2004).</li>
<li>Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+next-generation+droplet+digital+PCR+%28ddPCR%29+with+quantitative+PCR+%28qPCR%29+for+enumeration+of+Cryptosporidium+oocysts+in+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples.</a> Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).</li>
<li>Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+enumeration+of+airborne+biocontaminants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Detection and enumeration of airborne biocontaminants.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).</li>
<li>Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+housing+characteristics+on+bacterial+and+fungal+communities+in+homes+of+asthmatic+children%5BTitle%5D)+AND+%22Indoor+air%22%5BJournal%5D)">Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children.</a> Indoor air. , (2015).</li>
<li>Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoor+emissions+as+a+primary+source+of+airborne+allergenic+fungal+particles+in+classrooms%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms.</a> Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-size+distributions+and+seasonal+diversity+of+allergenic+and+pathogenic+fungi+in+outdoor+air%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air.</a> ISME J. 6, 1801-1811 (2012).</li>
<li>Karottki, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+and+lung+function+in+relation+to+outdoor+and+indoor+exposure+to+fine+and+ultrafine+particulate+matter+in+middle-aged+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects.</a> Environ Int. 73, 372-381 (2014).</li>
<li>Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuy%2C+D+%22Industrial+Pharmaceutical+Microbiology%3A+Standards+and+Controls%22">Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls</a>. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).</li>
<li>Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf">http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf</a> (2006).</li>
<li>Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf">http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf</a> (2007).</li>
<li>Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.acciusa.com/pageCOA.php">http://www.acciusa.com/pageCOA.php</a> (2015).</li>
<li>Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Five+Extraction+Protocols+for+Quantification+of+Endotoxin+in+Metalworking+Fluid+Aerosol%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Occup.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol.</a> Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).</li>
<li>Thornton, B., Basu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+%28qPCR%29+primer+design+using+free+online+software%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Educ%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software.</a> Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).</li>
<li>Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadigan%2C+MT+%22Brock+Biology+of+Microorganisms%22">Brock Biology of Microorganisms</a>. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).</li>
<li>Watson, J. G., Chow, J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWatson%2C+JG+%22Aerosol+Measurement%3A+Principles+and+Techniques%22">Aerosol Measurement: Principles and Techniques</a>. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).</li>
<li>Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+endotoxin+concentrations+in+PM10+from+Southern+California%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California.</a> Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).</li>
<li>Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy%2C+Precision%2C+and+Method+Detection+Limits+of+Quantitative+PCR+for+Airborne+Bacteria+and+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).</li>
<li>Kutyavin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%E2%80%B2-Minor+groove+binder-DNA+probes+increase+sequence+specificity+at+PCR+extension+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures.</a> Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).</li>
<li>Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+absolute+quantification+method+correcting+for+quantitative+PCR+efficiency+variations+for+microbial+community+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).</li>
<li>Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrober%2C+W+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+enhancement+in+the+analysis+of+airborne+endotoxin+levels+in+various+occupational+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Ind+Hyg+Assoc+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments.</a> Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).</li>
<li>Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKennedy%2C+S+%22PCR+troubleshooting+and+optimization+%3A+the+essential+guide%22">PCR troubleshooting and optimization : the essential guide</a>. , Caister Academic Press. (2011).</li>
<li>Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Endotoxin+Testing+Methods+for+Pharmaceutical+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm+Compd%22%5BJournal%5D)">Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products.</a> Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).</li>
<li>Ebentier, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+a+suite+of+qPCR-based+microbial+source+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods.</a> Water Res. 47, 6839-6848 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit werk beschrijft de extractie en detectiemethoden voor het kwantificeren van zowel endotoxinen en DNA aanwezig in spuitbussen monsters verzameld op filters. De methoden vereisen nauwkeurige routines en kan gemakkelijk worden uitgevoerd zolang de experimentator hecht aan een paar essentiële en belangrijke punten besproken. Voor het endotoxine detectiestap op dat de lysaatoplossing vrij viskeus is en neigt om belletjes op pipetteren. Het is moeilijk te verwijderen u bellen, en ze een wijzig...

Air bemonstering van filters is een fundamenteel instrument in atmosferische aërosolen onderzoek. 1 in de steekproef opgenomen filters zijn het uitgangspunt voor diverse chemische, fysische en biologische karakteriseringen van de verzamelde ambient deeltjes. 2-11 Het voordeel van deze aanpak is dat verschillende analyses kunnen worden uitgevoerd off-line op hetzelfde monster. Samenstellen van de gegevens uit de verschillende analyses maakt de onderzoeker een goed begrip van de kenmerken van de verzamelde deeltjes en hulpmiddelen te verkrijgen bij het ​​oplossen van complexe vraagstukken in de atmosferische wetenschappen. 12,13 Bijvoorbeeld, zee- en binnenvaart air-monsters genomen tijdens dezelfde termijn kan worden vergeleken met betrekking tot de bemonsterde deeltjes toxiciteit en biologische samenstelling. 14 voor deze studie, lipopolysacchariden (LPS), onderdelen van gram-negatieve bacteriële celwanden, ook bekend als endotoxinen werden uit filters bemonsterd wal en een binnenzee site, en werden geëvalueerd met behulp van delimulus amoebocyt lysaat (LAL) -test. Daarnaast werd een genomische evaluatie van de bacteriële inhoud (totaal bacteriën, gramnegatieve en cyanobacteriën) werd uitgevoerd op hetzelfde monster met de kwantitatieve polymerasekettingreactie (Q-PCR). De LAL-test is gebaseerd op metingen van troebelheid gevormd na de toevoeging van een waterig extract van amebocytes van de degenkrab, Limulus polyphemus, aan een waterige oplossing die de endotoxinen. Hoe hoger de endotoxine concentratie in het monster, des te sneller vertroebeling ontwikkelt. 15 de Q-PCR-analyse is gebaseerd op een fluorescentiesignaal uitgezonden als een specifiek DNA-fragment wordt geamplificeerd. 16 Bij real time monitoring van het signaal gedurende de exponentiële fase van de PCR reactie en kalibreren met een standaard curve, kan de eerste DNA bedrag worden gekwantificeerd. De combinatie van deze twee analyses samen met anderen, zoals elders beschreven, kan 14 een goede schatting van de niveaus van endotoxine en het verschaffenhoeveelheid van de bron bacteriën in de monsters. Het doel van de hier gepresenteerde methode is een zeer nauwkeurige en betrouwbare analyse van de endotoxine en DNA- gehalte van bio-aerosolen onttrokken filters te verkrijgen. Terwijl werkwijzen voor bemonstering van de fysische en anorganische chemische eigenschappen van aërosolen zijn welbekend en, meer recentelijk, werkwijzen ontwikkeld om de organische stof component onderzoeken, 17 er weinig onderzoek gedaan naar de biologische component van aërosolen. 18 De reden voor de huidige methode is om deze kloof te pakken door die een gedetailleerd overzicht van een robuuste methode voor het extraheren, analyseren, en het identificeren van de biologische fractie van de lucht aerosolen. 14 De methode die hier beschreven wordt verwacht dat wijdverspreide gebruik vinden in biologische indoor en outdoor aerosol onderzoeksprojecten waarbij filter analyse. 20-24

<table><tbody><tr><td>Filter sampling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiVol 3000 - High Volume Air Sampler</td><td>Ecotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz Microfiber Filters</td><td>Whatman</td><td>1851-865</td><td>203 mm x 254 mm</td></tr><tr><td>ELF - Laboratory Chamber Furnaces</td><td>Carbolite</td><td>ELF 11series</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>Opal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Endotoxin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16368&nbsp;</td><td>Laboratoriumreagens, 96%</td></tr><tr><td>Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1</td><td>ESCO</td><td>10011712</td><td></td></tr><tr><td>Pyrotell -T</td><td>Associates of Cape Cod, Inc.</td><td>T0051</td><td></td></tr><tr><td>Control Standard Endotoxin</td><td>Associates of Cape Cod, Inc.</td><td>E0005-1</td><td>Escherichia coli&nbsp;O113:H10, 0,5 &micro;g/vial 1 Pack</td></tr><tr><td>LAL Reagent Water</td><td>Associates of Cape Cod, Inc.</td><td>W0051</td><td></td></tr><tr><td>10 ml steriele spuit met Luer-Lok tip</td><td>Becton-Dickinson &amp; Co.</td><td>309605</td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide spuitnaald</td><td>Becton-Dickinson &amp; Co.</td><td>305129</td><td>Steriele&nbsp;</td></tr><tr><td>Parafilm-M afdichtingstape</td><td>Parafilm</td><td>P7543</td><td>Sigma catalogusnummer</td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>Axigen</td><td>MCT-200-C</td><td>2 ml, pyrogeenvrij</td></tr><tr><td>1,12 cm diameter Cork Borer</td><td>Boekel Scientific</td><td>1601 BD Series - Steel</td><td>Onderdeel van een kurksnijdersset met snijders met verschillende diameters.&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mm Petri Schaal</td><td>Miniplast Ein-Shemer</td><td>72050-01</td><td>Aseptisch</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2&nbsp;</td><td>Scientific Industries, inc.</td><td>SI-0297</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5415 D</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>TC MicroWell 96 F SI met deksel</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Vlakke bodemputjes (met deksel (individueel verpakt)), steriele, pyrogeenvrij</td></tr><tr><td>Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader</td><td>Biotek</td><td>7091000</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA weg</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>Standaard DNA van de microbiële soort van belang</td><td>ATCC of andere kweekcollectie</td><td></td><td>Ofwel de geschikte microbiële stam voor DNA-extractie of het geëxtraheerde DNA</td></tr><tr><td>Neubauer-verbeterd</td><td>Marienfeld</td><td>640030</td><td>hemocytometers</td></tr><tr><td>TE buffer, Low EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8,0)&nbsp;0,1 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Nuclease-vrije PCR-kwaliteit water&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3315959001</td><td></td></tr><tr><td>PCR-primers</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Richt zich op de microbiële soort van belang</td></tr><tr><td>Dual-Labeled Probes</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Richt zich op de microbiële soort van belang</td></tr><tr><td>Schroefdopbuisjes</td><td>Axigen</td><td>ST-200-SS</td><td>2 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>PowerSoil DNA-extractiekit&nbsp;</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100</td><td></td></tr><tr><td>Glasperken, zuurgewassen 425-600 &micro;m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glasperken, zuurgewassen &lt;106 &micro;m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4649-100G</td><td></td></tr><tr><td>PowerSoil Solution C1</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100-1</td><td>Cell lysis buffer, Power soil Kit</td></tr><tr><td>Magic Touch ijsemmer</td><td>Bel-Art</td><td>18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607EUR</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR-systeem</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4370048</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reactieplaat met streepjescode, 0,1 ml</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Splash-Free 96-Well Basis</td><td>Applied Biosystems</td><td>4312063</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optische Lijmfolie</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td>Rotor A-4-62 met MTP emmers&nbsp;</td></tr></tbody></table>

-air bemonsterd filter analyse voor endotoxinen en dna content

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Outdoor aerosol onderzoek maakt gebruik van algemeen fijn stof bemonsterd filters. Deze procedure kan verschillende karakteristieken van de verzamelde deeltjes wordt parallel uitgevoerd. Het doel van de hier gepresenteerde methode is een zeer nauwkeurige en betrouwbare analyse van de endotoxine en DNA- gehalte van bio-aerosolen onttrokken filters te verkrijgen. De winning van hoogmoleculaire organische moleculen, zoals lipopolysacchariden, van bemonsterde filters omvat het schudden van het monster in een pyrogeen-vrij water gebaseerde medium. De volgende analyse is gebaseerd op een enzymatische reactie die kan worden gedetecteerd met een turbidimetrische meting. Door het hoge gehalte aan organische het bemonsterde filters, wordt de extractie van DNA uit de monsters uitgevoerd met een commerciële DNA extractie kit die oorspronkelijk is ontworpen voor bodems en aangepast aan de DNA opbrengst te verbeteren. De detectie en kwantificering van specifieke microbiële soort, volgens een kwantitatieve polymerasekettingreactie Reactibij analyse (Q-PCR) worden beschreven en vergeleken met andere beschikbare werkwijzen.

Het is gebruikelijk om atmosferische aërosolen studie met &quot;off-line&quot; analyses van bemonsterde filters (zie figuur 2). 32 Chemische analyses van de bemonsterde stof omvatten organische (bijvoorbeeld eiwitten, koolwaterstofmoleculen, sacchariden) en anorganische (bijvoorbeeld metalen, zouten) -gehalte . Biologische analyses omvatten levensvatbare en niet-levensvatbare micro-organismen inhoud, soort-identificatie door een DNA aanpak of...

Twee complementaire analyses van biologische atmosferische deeltjes uit bemonsterde luchtfilters worden hier beschreven: de extractie en detectie van endotoxine en van DNA.

-Air bemonsterd Filter Analyse voor endotoxinen en DNA Content

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

Het algemene doel van deze procedure is om te beschrijven hoe endotoxine- en DNA-gehaltes in geëxtraheerde luchtdeeltjes die op filters zijn verzameld, nauwkeurig kunnen worden geanalyseerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar biologische aerosolen binnenshuis en buitenshuis, zoals het begrijpen van gezondheidsaspecten. De filterbemonsteringsprocedure zal worden gedemonstreerd door Yinon Mazar, een promovendus uit mijn laboratorium.Gebruik voor bemonstering met een hoog volume filters van kwartsvezel. Of kies het specifieke type filter en een filterafsnijgrootte die het beste aansluiten bij de behoeften van het onderzoek. Voorbehandel de filters die bedoeld zijn voor de bemonstering van organische en biologische verbindingen door ze eerst individueel in aluminiumfolie te wikkelen.Bak ze vervolgens in een laboratoriumoven bij 450 °C gedurende ten minste vijf uur. Hiermee worden alle reeds aanwezige organische residuen vernietigd. Bewaar de gebakken filters bij 20 °C tot ze worden gebruikt voor bemonstering.Reinig en desinfecteer vervolgens de high volume sampler, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats daarna het voorgebakken filter in de filtercassette en gebruik de sampler volgens de instructies van de fabrikant om een representatief monster te verzamelen. Snijd in een biosafety cabinet klasse II 22 cirkelvormige stukjes schoon, voorgebakken filtermateriaal met een schone kurkenborer met een diameter van 1,12 centimeter.Gebruik deze stukken om een reeks met endotoxine gespikeerde filters te bereiden om als controles te gebruiken. Snijd vervolgens de filters die het verzamelde monster bevatten uit met een schone kurkboreur van 1,12 centimeter diameter en plaats elk monster in een eigen pyrogeenvrije buis van twee milliliter. Breng daarnaast de gedroogde endotoxine gespikeerde filters over in afzonderlijke pyrogeenvrije buizen van twee milliliter.Voeg één milliliter pyrogeenvrij water toe aan elke buis. Schud deze vervolgens gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met een laboratoriumschudmachine. Centrifugeer de monsterbuisjes daarna in een microcentrifuge bij 375 ×g gedurende 10 minuten.Breng vervolgens de supernatant die de endotoxinen bevat over naar een nieuwe pyrogeenvrije buis van twee milliliter. Bereid een pyrogeenvrije 96-well microplaat met een platte bodem en een deksel voor de endotoxinentest, door eerst de monsterlocaties uit te zetten.Zet vervolgens de microplaatlezer aan en programmeer deze voor een kinetische reactie bij 37 °C met schudden elke vijf minuten. Volg dit met metingen bij 405 nm. Herhaal het schudden van vijf minuten en het uitlezen van de plaat 18 keer.Laad de monsters in de plaat door 50 µL van de standaard endotoxine-oplossingen, die eerder zijn gebruikt om de filters te spiken, in de rijen A1 tot en met A10 en B1 tot en met B10 aan te brengen. Plaats de blanco's in A11, A12, B11 en B12. Voeg vervolgens het supernatant van het gecentrifugeerde extract van de gespikede filters en de bijbehorende blanco's toe aan de rijen C en D. Voeg daarna de supernatanten van de experimentele monsters en blanco's toe aan de overige wells naar behoefte.Om de test te activeren, voegt u snel 50 µL van de limulus amebocyte glycate-oplossing toe aan elke put. Schud de plaat voorzichtig horizontaal voordat u deze in de platenlezer plaatst en de experimentele run start.Verwijder na voltooiing de plaat uit de plaatlezer. Bepaal het endotoxinegehalte in elke monster met behulp van de standaardcurve en bereken daarnaast de efficiëntie waarmee de endotoxinen uit de monsterfilters worden geëxtraheerd. Bereid eerst de filters die zijn gespiked met DNA voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Bereid voor elk filtermonster een mengsel voor van zuurgewassen glasparels in steriele buisjes van 0,5 milliliter, bestaande uit 0,1 gram parels met een diameter van 425 tot 600 micrometers en 0,3 gram parels met een diameter van minder dan of gelijk aan 106 micrometers. Snijd vervolgens drie ronde stukjes uit willekeurig geselecteerde locaties op elk filtermonster met een gedesinfecteerde kurkenborer met een diameter van 1,12 centimeter. Plaats de filtermonsters in individuele schroefdopbuisjes van twee milliliter.Voeg vervolgens het mengsel van glaskralen toe aan elke buis, samen met 60 µL van de cellysebuffer die bij de DNA-extractiekit is geleverd. Sluit de buizen en plaats de monsters in de beadbeater. Gebruik de beadbeater om de gefilterde cellen gedurende één minuut mechanisch te lyseren en koel de monsters vervolgens een minuut lang op ijs.Herhaal deze cyclus vijf keer. Volg vervolgens het protocol van de kitleverancier en extraheer het DNA uit de gelyseerde cellen. Laad na elutie het geëlueerde monster voor een tweede maal in de extractiekolom om de DNA-opbrengst te verbeteren.Schakel het quantitative PCR-instrument vooraf in om het apparaat de tijd te geven om op te warmen. Voer in een nieuw programmaprofiel de details voor de quantitative PCR-run in de besturingssoftware van het instrument in. Desinfecteer vervolgens het werkoppervlak met een DNA-oppervlaktendecontaminant en werk uitsluitend met steriele buisjes, tips en reagentia.Plaats daarnaast een emmer ijs naast de werkbank en zet het tac polemoraris-mengsel in de emmer. Bereid het kwantitatieve PCR-reactiemengsel voor zoals beschreven in tabel vier van het bijbehorende tekstprotocol. Bewaar het reactiemengsel in het donker en op ijs tot gebruik.Plaats vervolgens een schone microplaat in een platenhouder om te voorkomen dat deze het werkoppervlak raakt en om deze schoon te houden. Voeg één microliter standaard-DNA, monster-DNA of nucleasevrij water in triplikaat toe aan de wells van de kwantitatieve PCR-microplaat. Voeg daarna negen microliters van de master reaction mix toe aan elke reactiewell.Bedek de plaat na voltooiing met optische adhesiefilm en verzegel deze stevig aan alle zijden. Centrifugeer de plaat gedurende één minuut bij 1000 ×g in een centrifuge die is uitgerust met plaatbakjes, voordat u deze in de thermocycler plaatst. Activeer tot slot het voorbereide kwantitatieve PCR-programma en start de run.Tijdens de endotoxine-extractie worden filtermonsters gecentrifugeerd om de endotoxine uit het filter te extraheren. Verschillende centrifugatiesnelheden leiden tot verschillende extractie-efficiënties, vooral bij hogere endotoxineconcentraties.Er moet een voorlopige test voor de extractie-efficiëntie worden uitgevoerd voor het gekozen specifieke filter en het toegepaste protocol. Hogere extractie-efficiënties worden behaald bij het toevoegen van standaarden aan schone filters in vergelijking met bemonsterde kwartsfilters, en beide efficiënties zijn lager dan die welke wordt bereikt via directe detectie van de standaardoplossing. Wanneer de methode onder controle is, kan de endotoxine-analyse in drie en een halve uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals DNA-sequencing, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over het transport van organismen in de atmosfeer. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe endotoxinen en DNA efficiënt uit luchtmonsterfilters kunnen worden geëxtraheerd en nauwkeurig kunnen worden geanalyseerd.

air-sampled-filter-analysis-for-endotoxins-and-dna-content

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

This video demonstrates a rapid bioassay for investigating endotoxin activity in a whole blood sample via a chemiluminescence-based method. This assay is a rapid and sensitive biomarker test for early-stage diagnosis of endotoxin-mediated sepsis.

Endotoxin Activity Assay: A Chemiluminescence-Based Bioassay for Investigating Endotoxin Activity in Blood Sample

This video describes the turbidimetric format of the Limulus amoebocyte lysate, or LAL, assay to estimate endotoxin contamination in PEGylated liposomal doxorubicin nano-formulations. The turbidity of the solution following the reaction of the endotoxin with the LAL reagent helps to estimate the endotoxin in the sample.

Turbidimetric Limulus Amoebocyte Lysate Assay: A Technique to Detect and Quantify Endotoxin Contamination in Nano-Formulated Drugs

This video describes a gel-clot assay to determine the presence of bacterial endotoxins in nano-formulations using Limulus Amoebocyte Lysate derived from the blood cells of horseshoe crabs. The assay helps test for endotoxin contamination of pharmaceutical products, including nano-based formulations.

Gel-Clot Limulus Amoebocyte Lysate Assay: A Method for Bacterial Endotoxin Detection in Nanoparticle Formulations

This video demonstrates an assay to examine the toll-like receptor(TLR)-dependent activity of the transcription factors nuclear factor-kappa-B (NF-κB) and activator protein-1 (AP-1) in macrophages. The TLRs trigger a pro-inflammatory signaling cascade upon recognizing damage-associated molecular patterns (DAMPs), activating NF-κB and AP-1. The engineered reporter macrophages produce secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) enzyme upon NF-κB and AP-1 activation, which is detected via a...

An Assay for TLR-Dependent NF-&kcy;B/AP-1 Transcription Factor Signaling in Macrophages

We beschrijven een protocol voor het filtreren van watermonsters met een filtercartridge en het extraheren van omgevings-DNA (eDNA) zonder dat het behuizing hoef te worden geopend om de filter te verwijderen. Dit protocol is ontwikkeld voor metabarcoding van eDNA van vissen, maar is ook toepasbaar op eDNA van andere organismen.

Het gebruik van een filter cartridge voor filtratie van watermonsters en Winning van Environmental DNA

Het bepalen van de schimmel diversiteit binnen een omgeving is een methode gebruikt in studies van de gezondheid op het werk te identificeren van de gevaren voor de gezondheid. Dit protocol beschrijft DNA-extractie uit beroepsmatige lucht monsters voor de versterking en de sequencing van schimmel ITS-regio's. Deze aanpak detecteert vele schimmel soorten die kunnen worden overzien door traditionele beoordelingsmethoden.

Collectie en extractie van beroepsmatige Air monsters voor analyse van schimmel DNA

Hierbij presenteren wij een protocol om aan het bed de endotoxine activiteit van menselijke volbloed monsters te meten. De endotoxine activity assay is een eenvoudige test om te presteren en kan een nuttige biomarker zijn bij ernstig zieke patiënten met sepsis.

Endotoxine activiteit test voor de detectie van volbloed Endotoxemie bij ernstig zieke patiënten

Inzicht in de biologische samenstelling van milieu zwevende deeltjes is belangrijk voor de studie van de significante effecten op de volksgezondheid en verspreiding van de ziekte. Hier, we drie soorten bioaerosol bemonsteringsmethoden en een biologische analyse van airborne microben gebruikt om beter verkennen vanuit de lucht microbiële gemeenschappen onder verschillende omgevingsomstandigheden.

Samenstelling en analyse van de verdeling van Bioaerosols onder verschillende omgevingsomstandigheden

Detectie van endotoxines in technisch vervaardigde nanomaterialen vertegenwoordigt een van de grote uitdagingen op het gebied van de nanogeneeskunde. Hier, presenteren we een case-studie die het kader bestaat uit drie verschillende LAL formaten beschrijft te schatten van potentiële endotoxine besmetting in nanodeeltjes.

Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen

Dit protocol biedt onderzoekers een snelle, indirecte methode voor het meten van TLR-afhankelijke NF-кB/AP-1 transcriptiefactor-activiteit in een muriene macrofaag cellijn in reactie op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken en geadsorbeende eiwit lagen die de micro omgeving van het biomateriaal implantaat modelleren.

Een macrophage reporter Celassay om Tolachtige receptor-gemedieerde NF-kB/AP-1-signalering op geadsorbeerde proteïne lagen op polymere oppervlakken te onderzoeken

Betrouwbare en nauwkeurige vormen van veldinzetbare DNA-analyse zijn cruciaal voor veel industrieën. Dit artikel biedt twee methoden voor milieumicrobiële analyse in het veld: 1) de isolatie van microbieel DNA uit omgevingsmonsters met behulp van een biologische extractie-veldkit, en 2) de analyse van DNA via de field qPCR-eenheid.

Microbieel DNA-onderzoek in het veld met behulp van een biologische extractie-veldkit en een veld-qPCR-eenheid

Leer endotoxine- en DNA-analyse van luchtbevochtigde filters voor biologisch aerosolonderzoek. Deze methode helpt onderzoekers gezondheidsvragen in binnen- en buitenomgevingen te beantwoorden.

-Air bemonsterd Filter Analyse voor endotoxinen en DNA Content

Meer video's verkennen