Tuning een parallelle gesegmenteerd Flow Column en Multiplexed Detection inschakelen

Het algemene doel van deze HPLC-procedure is het afstellen van een parallelle gesegmenteerde stroomkolom om multiplex-detectie mogelijk te maken. Deze methode beantwoordt belangrijke vragen op het gebied van gezondheid en welzijn, milieuwetenschappen, forensisch onderzoek en alle gebieden die de analyse van complexe monsters vereisen, zoals bio-ontdekking. Deze techniek maakt een uitgebreide monsteranalyse mogelijk, terwijl er tegelijkertijd informatie wordt verkregen over de chemische en bioactieve eigenschappen van stoffen in complexe mengsels.

De protocollen voor multitudetectie maken bovendien een snelle analyse mogelijk. Deze methode maakt de ontwikkeling van strategieën mogelijk om de chemische vingerafdruk van complexe mengsels, zoals koffie en wijn, te definiëren, waardoor fabrikanten het onderscheid kunnen maken tussen hun eigen producten en goedkope vervalsingen. In eerste instantie kan het onorthodox aanvoelen om niet het volledige monster naar slechts één detector te sturen voor een nauwkeurige analyse.

De analytconcentratie binnen elke stroom is echter hoger dan de totale stroom van een conventionele kolom. Begin met het instellen van het HPLC-instrument met 100% UE-water en zuiver methanol voor respectievelijk mobiele fasen A en B. Indien er een MS-detector wordt gebruikt, voeg dan 0,1% mierenzuur toe aan beide mobiele fasen en spoel vervolgens de HPLC-pompen door volgens de instructies van de fabrikant.

Stel de MS-, UV-, VS- en DPPH-detectoren samen volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat de componenten zodanig zijn geplaatst dat het dode volume in de detectorgestuurde lijnen minimaal is.

Stel vervolgens de golflengte van de UV VISTA-detector in op de golflengte die specifiek is voor het betreffende monster. Gebruik 280 nanometers voor de MS-detector. Gebruik de positieve modus voor de analyse van de totale ionenstroom of TIC met de full scan detectiemethode.

Stel de temperatuur en de gasstroom van de MS-detector in op de volgende waarden: een vaporizer-temperatuur van 500 °C, een capillaire temperatuur van 350 °C, een hulpgasstroom van 40 units, een sweepgasstroom van 5 units, een sheathgasstroom van 60 units en een sprayspanning van 3,5 kV. Begin bij de bereiding van het DPPH-radicaalreagens met het oplossen van 25 mg DPPH-radicaal in 250 mL methanol in een maatkolf.

Voeg 250 µL mierenzuur toe aan de oplossing en sonicate de oplossing gedurende 10 minuten. Dek daarna de kolf en het folie af om blootstelling aan licht te voorkomen. Spoel vervolgens de pomp door met de DPPH-radicaaloplossing volgens de aanwijzingen van de fabrikant om het DPPH-radicaalsysteem in te stellen.

Zorg ervoor dat de pompleiding is bevestigd aan de inlaat van een T-stuk, en verbind vervolgens de reactiespoel van 100 microliter met de uitlaat van het T-stuk. Bevestig de detector aan het andere uiteinde van de reactiespoel ENC-behuizing, de reactiespoel en een kolomverwarmer. Stel tenslotte de DPPH-radicaal UV-detector in op 520 nanometer.

Om de parallel gesegmenteerde stroom- of PSF-kolom op te bouwen, sluit u eerst de kolominlaat aan op het HPLC-instrument. Gebruik vervolgens een stuk slang om de centrale poort met de MS-detector te verbinden. Gebruik slang met dezelfde afmetingen om één perifere kolompoort aan te sluiten op de UV VS-detector en een andere op het T-stuk van het DPPH-radicaaldetectiesysteem.

Blokkeer alle ongebruikte perifere poorten met kolomstoppers. Stel de stroomsnelheid van de HPLC in op één milliliter per minuut van 100% mobiele fase B voor een kolom met een binnendiameter van 4,6 millimeter en een lengte van 250 millimeter. Laat dit 20 minuten equilibreren.

Om het PSF-systeem af te stemmen, moeten de verzamelvaten eerst worden geleegd. Gebruik deze flesjes om apart de mobiele fase op te vangen uit de UV VS- en DPPH-radicaalpoorten. Noteer de verzameltijd en vang ten minste 500 milligram oplosmiddel op in elk vat.

Weeg vervolgens de opvangvaten om de massa van de mobiele fase te bepalen en deel de massa door de dichtheid van methanol om het volume van de mobiele fase te berekenen dat via elke poort is opgevangen. Bepaal tot slot de stroomsnelheid naar de MS-detector en bereken de stroomverhoudingen van alle detectoren als een percentage van de totale stroom, zoals beschreven in het tekstprotocol. Als de stroomverhoudingen aanzienlijk afwijken van de ideale waarden, voeg dan waar nodig extra slang toe om de tegendruk aan te passen en herhaal het opvang- en berekeningsproces.

Stel slutतः de stroomsnelheid van de DPPH-radicaalreagenspomp zo in dat deze overeenkomt met de stroomsnelheid van de uitlaatpoort die verbonden is met de detector. Er werd een gemultiplexe HPLC-analyse uitgevoerd op een koffiemonster. De mogelijkheid om gelijktijdig DPPH-radicaal UV- en MS-chromatogrammen vast te leggen, maakt het mogelijk om de verbindingen in het monster die positief reageerden op het DPPH-radicaal eenvoudig te koppelen aan de UV-chromatogrammen.

En voor MS-responsen op basis van retentietijd-uitlijning waarbij een positieve respons werd waargenomen van de MSS TIC-detector, werd de moleculaire massa van de piek geregistreerd. Het gemak waarmee pieken tussen verschillende detectieprocessen kunnen worden gekoppeld, maakt een snelle en efficiëntere vorm van screening en karakterisering mogelijk voor een complex monster zoals koffie. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer een uur worden opgezet en is deze klaar voor monsteranalyse volgens deze procedure. Andere detectoren, zoals brekingsindex- en fluorescentiedetectie, en chemisch gebaseerde detectie zoals chemiluminescentie, kunnen worden gebruikt om aanvullende monsterinformatie te verkrijgen.

Na het bekijken van deze video moet u het belang herkennen van het multiplexen van detectieprocessen om een beter inzicht te krijgen in een complex monster. Bovendien is multiplexdetectie met behulp van parallelle gesegmenteerde stroomkolommen een uiterst efficiënte manier om bio-exploratie uit te voeren.