Name: Tuning een parallelle gesegmenteerd Flow Column en Multiplexed Detection inschakelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer hoe u een parallelle gesegmenteerde flow-kolom afstemt voor multiplex detectie in HPLC-analyse. Deze methode versnelt de analyse van complexe monsters zoals koffie en wijn aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door UWS en ThermoFisher Scientific. Een van de auteurs (DK) erkent het ontvangen van een Australian Postgraduate Award.

Opmerking: Dit protocol bevat instructies over hoe je een column PSF te gebruiken op een HPLC-systeem in combinatie met meerdere detectoren voor multiplex detectie. Het protocol is geschreven ervan uitgaande dat de lezer heeft basiskennis en ervaring in chromatografie en diverse HPLC detectiemethoden. Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor alle materialen en reagentia voor het gebruik (dwz, MSDS voor methanol). Zorg ervoor dat het gebruik van alle nodige veiligheidsvoorschriften bij de omgang met oplosmiddelen en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluens. Zorgen voor het juiste gebruik van de technische controles van HPLC, analytische balans en de detector instrumentatie, en zorgen voor het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en dichte schoenen). 1. Instellen van HPLC Instrument <ol><li> Bereid de HPLC-instrument met ultrapuur water (bv, 100% Milli-Q-water) voor line A en 100% methanol lijn B als de mobiele fase en ontlucht de pompen volgens fabrikant eis. Als een van de detectoren gebruikte MS, als hier, voeg 0,1% mierenzuur tot mobiele fasen A en B. </li><li> Stel de HPLC instrumentele componenten en detectoren zoals getoond in figuur 2. Dit vergt geschikte plaatsing van de detectoren ten opzichte van de kolom om het dode volume tussen de detector en de kolom te minimaliseren. Flexibiliteit in het configuratie HPLC is gewenst. </li></ol> 2. Instellen van UV-Vis en MS detectoren <ol><li> Stel het UV-Vis detector op de gewenste golflengte afhankelijk van het monster van belang (bijvoorbeeld 280 nm). </li><li> Stel de MS-detector in de positieve modus voor Total Ion Count (TIC) analyse met behulp van Full Scan detectiemethode. Ook pas de volgende MS parameters dienovereenkomstig: verdamper temperatuur van 500 ° C, capillaire temperatuur van 350 ° C, schede gas ingesteld op een snelheid van 60 eenheden, extra gasstroom40 en vegen gasstroom op 5 units en sproei voltage 3,5 kV. Deze instellingen kunnen later voor specifieke behoeften van de gebruikers afhankelijk is van het monster wordt geanalyseerd worden aangepast. </li></ol> 3. Voorbereiding van 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl Radical (DPPH •) Reagens Setup van DPPH • Systeem Detector <ol><li> Weeg 25 mg DPPH • en los op in 250 ml methanol in een maatkolf. </li><li> Voeg 250 ul van mierenzuur tot de DPPH • reagens. Bedek de kolf in folie om de blootstelling aan licht te voorkomen. </li><li> Sonificeer de kolf met de DPPH • reagens gedurende 10 min. </li><li> Spoel de DPPH • pomp met de voorbereide DPPH • reagens als per eis van de fabrikant. </li><li> Stel het DPPH • systeem volgens figuur 2 door het aanbrengen van de pomp aan op de inlaat van een T-stuk. </li><li> Bevestig een 100 ul reactie spoel aan The uitlaat van het T-stuk en maak het andere uiteinde van de reactiespiraal naar de detector. </li><li> Encase de reactie spoel in een kolomverwarmer en stel de kolomverwarmer temperatuur tot 60 ° C. </li><li> Stel de DPPH • UV-Vis-detector tot 520 nm. </li></ol> 4. Instellen van PSF Column <ol><li> Verbind de inlaat van de kolom PSF met de HPLC instrument. </li><li> Sluit de centrale poort naar het MS detector, met een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang. </li><li> Verbind een randapparaat poort aan de UV-Vis-detector met een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang. </li><li> Sluit een ander randapparaat poort voor de T-stuk van de DPPH • detectiesysteem met een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang. </li><li> Blokkeer de ongebruikte perifere poort met behulp van een kolom stopper. </li><li> Breng de stroomsnelheid van de HPLC-pomp met 1 ml min -1 bij 100% lijn B - 100% Methanol (0,1% mierenzuur). </li><li> Equilibreren van de kolom met 100% methanol mobile phase gedurende 20 min bij 4,6 mm ID x 250 mm kolomlengte. Deze tijd wordt geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker mag gebruiken. </li></ol> 5. Tuning PSF Kolom voor multiplexverzending Detection <ol><li> Meet de massa van ten minste twee lege opvangbakken (een voor de poort verbonden met de UV-Vis detector en een voor de DPPH • detector) middels een analytische balans. </li><li> Verzamel mobiele fase uit de UV-Vis en DPPH • poorten in twee afzonderlijke, vooraf gewogen verzamelvaten (5,1). Noteer de tijd voor de collectie. Vang minimaal 500 mg oplosmiddel in elk vat. </li><li> De collectie schepen wegen en bepalen van de massa van de mobiele fase. Aangezien de dichtheid van de methanol wordt 0,791 g ml -1, bepaalt het volume van de mobiele fase vanuit elke poort. </li><li> Door het verschil, dat wil zeggen, de nominale pomp set debiet minus het debiet door de DPPH • en UV-Vis DETECTOr stroompoorten Bepaal het debiet naar de MS-detector. Versneld iedere stroom naarmate percentage van de totale stroom. Opmerking: het ideale geval de stroom percentages zijn: het MS 18% van het totale debiet, de UV-Vis 22%, de DPPH • detector 60%. </li><li> Zo niet, stel de stroming percentages door verandering van de tegendruk op de UV-Vis-detector. Bijvoorbeeld, als de stroom naar de UV-Vis te hoog, verlaag de hoeveelheid door toevoeging voeg 15 cm doorsnede van 0,13 mm id slang aan de uitgang van de UV-Vis-detector. Herhaal vervolgens stappen 5,1-5,5. </li></ol> 6. Final Setup Voorwaarden <ol><li> Stel het debiet van de DPPH • reagens pomp dezelfde stroomsnelheid de uitlaatpoort verbonden met de DPPH • detector verlaten. Opmerking: De kolom PSF gemultiplext met UV-Vis, DPPH • en MS is nu klaar voor analyse. </li></ol>

<ol><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+a+new+concept+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology%3A+Parallel+segmented+outlet+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%2C+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations%3A+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> 35 (3), 410-415 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology%3A+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.%2C+A%22%5BJournal%5D)">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111, 3-7 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography%3A+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%2C+A%22%5BJournal%5D)">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+active+flow+technology+HPLC+columns+as+a+platform+for+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection.</a> Microchem. J. 110, 473-479 (2013).</li>
<li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns%3A+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+%27virtual%27+narrow+bore+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.%2C+A%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).</li>
<li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection%3A+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze studie heeft betrekking op de karakterisering en profilering van koffie met behulp van HPLC met multiplex detectie gebruik van een parallelle gesegmenteerde stroom (PSF) kolom. Multiplexed HPLC met PSF kolommen maakt de karakterisering en identificatie van belangrijke chemische entiteiten door het verminderen van de complexiteit gegevens van het monster terwijl het verkrijgen van een grotere molecuul-specifieke informatie binnen een fractie van de tijd die met gebruikelijke multi-detectie werkwijzen. De kolom PSF m...

Active Flow Technology Columns Actieve stroom technologie (AFT) chromatografiekolommen werden onlangs ontwikkeld tot inefficiëntie in scheidingen in verband met stroom heterogeniteit 1-6 te overwinnen en ook multiplex detectie mogelijk te maken. In dit specifieke communicatie we detail het operationele proces van de parallelle gesegmenteerde stroom (PSF) kolom met multiplex detectie. De belangrijke functionele voordelen van de kolom PSF zijn: (1) de stroom vanaf de radiale centrale gebied van het kolombed wordt geïsoleerd van het perifeer of wandgebied van stroming, (2) het volume van de mobiele fase die moet worden verwerkt door een detectie- bron wordt verminderd, en (3) detectie bronnen kunnen worden gemultiplext om monsterinformatie uitzetten zonder wekken detectie vertraging over elke detectieproces of later noodzakelijk de splitsing van een postkolom vloeistofstroom 7,8. Het belangrijkste kenmerk van het ontwerp van de kolom PSF dat het mogelijk maakt eendvantage gemultiplexte detectie is de nieuwe outlet fitting en frit samenstel. Figuur 1 is een foto van de AFT kolom opzichte van een conventionele kolom. Het is belangrijk te begrijpen dat het splitsingsproces verkregen met evenwijdige gesegmenteerde stroom kolommen is niet hetzelfde als postkolom flows splitsen. In een postkolom vloeistofstroom gesplitst het gehele monster band van de voorste rand aan de uiteinden van de staart gelijkelijk bemonsterd (dwz axiaal) daardoor elke flows gelijk met betrekking tot de efficiëntie en gevoeligheid; de omvang van de gevoeligheid aldus gedeeld door het aantal splitsingen. In PSF, maar de splitsing proces monsters van de band radiaal, niet axiaal. Als zodanig, de centrale poort monsters de top bedraagt ​​- het meest geconcentreerde gebied van de piek. Dus de gevoeligheid hier de hoogste piek niet wordt verdund door de diffuse staart regio. Het monster elueren uit het perifere havens is niet zo efficiënt als de central zone, maar omdat de band radiaal wordt bemonsterd in plaats van axiaal, de breedte van de piek is smaller dan het geval zou een bemonsteringsproces dat de piek verdeelt in axiale richting, dat wil zeggen een postkolom worden gesplitst. Vandaar de gevoeligheid bij een concentratie afhankelijke detector niet verminderd. In de kolom PSF, de uitlaat fitting omvat meerdere uitlaatpoorten en aan de binnenkant van de eindfitting wordt gehuisvest een ringvormige frit. Het binnenste deel van deze ringvormige frit kanalen stromen uit de kolom via de radiale centrale uitlaat poort, terwijl de buitenste radiale gedeelte van de uitlaat frit kanalen uit de kolom stroomt via de perifere of wand regio stopcontact stroom poorten. De binnenste en buitenste gedeelten van de uitlaat frit worden gescheiden door een ondoordringbare barrière die dwarsstroom tussen deze stromingsgebieden 2 verhindert. Als gevolg van dit ontwerp de centrale radiale stroming stroom door de kolom bed wordt gescheiden van het wandgebied stroom inside de kolom. Het relatieve aandeel van stroom uit deze twee gebieden worden gevarieerd om bijna elk gewenste verhouding tot drukbeheer om verschillende functionele aspecten van de kolomtechnologie, zoals scheidingsefficiëntie of detectiegevoeligheid optimaliseren. In wezen is dit ontwerp effectief vast binnen de grotere format kolom een &quot;virtueel kolom heeft smallere inwendige diameter, en dus de kolom functioneert als een echte wall-less kolom overwinnen zuilenbed heterogeniteit en de wandeffecten 9,10. De belangrijkste voordelen van PSF kolommen verbetering kolomefficiëntie, minimalisering van het oplosmiddel voor het opsporen source (s) en mogelijk gemultiplexte detectie. Echter, een extra voordeel is dat aangezien de staart en fronting gebieden van elke band worden verwijderd uit de algemene elutieprofiel de opgeloste stof aan elutie of detectie aanwezig in een hogere concentratie dan anders zou worden waargenomen voor hetzelfde solute injectie en concentratie belasting van een conventionele kolom, afhankelijk van de segmentering toegepaste verhouding. Als gevolg hiervan is er vaak waargenomen een winst in signaalintensiteit voor scheidingen uitgevoerd op PSV kolommen 2. In feite, als de segmentatie verhouding wordt ingesteld dat 25% van de stroom verlaat elk van de vier uitlaatopeningen, de signaalintensiteit die wordt waargenomen onder toepassing van ultraviolet (UV) detectie toont vrijwel exact dezelfde signaalintensiteit zoals duidelijk met een gewone kolom waarin de volledige (100%) van de mobiele fase wordt geanalyseerd 7. Bovendien fijnafstelling van de uitlaat verhouding tussen de centrale en de wand stromingsgebieden kan de kolom efficiëntie te optimaliseren. De winst in kolomefficiëntie waargenomen via AFT kolommen kan niet worden gesteld aan een enkele waarde, omdat deze efficiëntie is afhankelijk van drie factoren: (1) de stroomsnelheid, (2) de segmentatie verhouding, en (3) de opgeloste stof retentiefactor . Toch winst in efficiëntie in vergelijking met conventional kolommen zijn bijna altijd waargenomen, en soms deze winsten meer dan 100% van het aantal theoretische schotels 1,2. De mogelijkheid om af te stemmen de segmentatie verhouding laat de analist effectief maat van de diameter van de &quot;virtuele&quot; kolom, en dit is een belangrijke factor met betrekking tot het detectieproces. Zo wordt een virtuele 2,1 mm diameter (id) kolom interne opgericht vanuit fysisch 4,6 mm id kolom wanneer de segmentatie verhouding 21% van de mobiele fase elueren van het radiale centrale uitlaatpoort. Onder deze omstandigheden is de virtuele 2,1 mm kolom id uitvoert met een efficiëntie die meer dan 70% groter is dan de gebruikelijke 2,1 mm id kolom kan, afhankelijk van de stroomsnelheid en opgeloste retentiefactor 10. De huidige kolom PSF ontwerp dat wordt gebruikt voor gemultiplexte detectie omvat een 4-poort uitlaatfitting, maar de kolom kan worden uitgerust met een 2-port-eindstuk echter ook beperkt dit detectie to twee detectoren. De basiswerking van deze kolommen is echter hetzelfde, behalve dat vier detectoren simultaan kunnen worden gekoppeld aan de 4-port outlet column PSF een uitbreiding van het gemultiplexte detectie. Naast pre- en post-kolom verbindende buis, het enige aanvullende eisen op een kolom PSF actief is buis die kan worden aangesloten op de perifere uitlaatpoorten, en een middel waarmee de hoeveelheid van de mobiele fase die door elke buis kan worden gemeten, meestal ofwel een massa meting of een volumetrische meting. Voor het gemak van tuning wordt de inwendige diameter van uitlaatstroom buizen hetzelfde zijn. De stroomverhouding tussen de perifere en radiale centrale uitgangsopeningen wordt vervolgens gevarieerd door het gebruik van drukbeheer, simpelweg door de lengte van de buis op het perifere uitlaatfitting, of buisstuk bericht detector op de radiale centrale uitlaatpoort. Multiplexed Detectie Met behulp van Columns PSF </strong&gt; Een belangrijk voordeel van PSF kolommen is dat elk van de uitlaat uitlaatpoorten direct kan worden aangesloten op een detectie-bron, waardoor gemultiplexte detectie. In een goed ontworpen detectiesysteem één analyse multiplex detectie kan essentiële informatie met betrekking tot de aard van de componenten in het monster. Belangrijk kunnen destructieve en niet-destructieve tests uitgevoerd op exact hetzelfde tijdstip, zonder detectie vertraging. Hierdoor kan de absolute toewijzing van bijvoorbeeld antioxidantia gebruikt DPPH • reagens, met componenten waargenomen elueer met UV- en / of massaspectrometrie (MS) detectie responsen 7,11. Daarom kunnen vier onafhankelijke detectors gelijktijdig worden bediend met geschikte porties stroom naar iedere detector via een van de vier afvoeropeningen. Aangezien de stroom door deze poorten gemakkelijk kunnen worden aangepast aan de hoeveelheid opgeloste stof bereiken een van de detectoren kan worden aangepast aan suitde gevoeligheid van de detector bepaalde bron. Opgemerkt zij echter dat de doeltreffendste opgeloste migratie waargenomen door het radiale centrale uitlaatpoort. Elk van de perifere poorten bieden gelijkwaardige scheidingsefficiëntie die, wanneer ingesteld op 25% door elke poort, slechts iets minder efficiënt dan een conventionele kolom. Als zodanig is het belangrijk dat de kwantitatieve detector ingesteld op monster van de radiale centrale uitlaatopening analyseren. Bij het opzetten van een kolom PSF behoeve van multiplexen detectie zijn er een aantal overwegingen die moeten worden gedaan om efficiënte en hoogwaardige resultaten; dat buisafmetingen voor elke poort, de keuze van welke poort voor een type detector en flow adjustment. Buis Afmetingen voor elke poort In chromatografie lengte van postkolom buis speelt een cruciale rol in de efficiëntie en prestaties van de scheiding. Grote dead-volume als gevolg van lange of brede id slang van kolomuitlaat naar detector leidt tot een rendementsverlies, resolutie en gevoeligheid. Zo moet de juiste afmetingen slangen worden gebruikt bij het opzetten van de kolom PSF om het maximale potentieel te bereiken in het leveren van efficiënte scheiding, terwijl het verstrekken van de voordelen van multiplexing. Poort naar Detector Figuur 2 is een illustratie van een voorbeeld configuratie van gemultiplexte detectie (Ultra Violet-Visible (U-Vis) massaspectrometer (MS) en 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH •) detectie). De afbeelding toont de centrale poort naar de MS-detector bevestigd, terwijl de DPPH • en UV-Vis detectoren zijn bevestigd aan de perifere poorten. Omdat de MS is de meest gevoelige detector van de drie stromen naar deze detector is gericht van het centrale uitlaatpoort. Zoals DPPH • opsporing is selectief aan de Presence van antioxidanten, en het minst gevoelig en meest tolerant bandverbreding, stromen naar deze detector werd geleid vanuit een perifere poort. De UV-Vis was een secundaire &#39;generieke&#39; detector, zodat de stroom naar deze detector werd geleid vanuit een tweede perifere poort. Flow adjustment Zodra aan de buis is bevestigd uit een haven detector, kan de uitgaande stroom uit elk van de detectors worden aangepast aan de gewenste hoeveelheid. Een eenvoudige manier om de hoeveelheid stroom verlaten van elke detector meten is de hoeveelheid van de mobiele fase die elueert door elke poort over een bepaalde tijdsperiode te wegen. Het percentage stroom kan dus worden bepaald, en de stroom verhoudingen kunnen worden ingesteld door hetzij verkorten of verlengen van de slang verbonden met de uitlaatleiding van de detektoren daarom aan de vereisten van de detektoren keuze passen. Verschillende detectoren hebben verschillende eisen van stroom, bijvoorbeeld de stroomcel vaneen fluorescentie detector (FLD) niet debiet beperkt, maar zorg moet worden genomen om overdruk van de stroomcel voorkomen. Vandaar de regeling van stroming door de FLD wordt gewoonlijk bereikt door het aanpassen van de drukval over de andere detectoren en de rest van de stroom gaat dan door de FLD. Een detector die gevoelig is voor de hoeveelheid stroom die geleverd is het MS. In het algemeen kan de huidige high-end massaspectrometers gemakkelijk verwerken rond 1 tot 1,5 ml / min van matig waterige mobiele fase. Boven dit debiet, kan overstroming van de bron de MS onbruikbaar te maken. Echter, gevoeligheid in de meeste massaspectrometers geprofiteerd door lagere debieten; vandaar de PSF stroom splitsing mogelijkheden zijn uiterst nuttig voor toepassingen waarbij MS detectie. Hoge kolom debiet kan worden toegepast, maar met een laag volume ladingen vervoerd naar de MS-detector. Afstemmen van de stroom naar de MS-detector, moet echter heeft plaatsgevonden door de drukval voor deMS-detector, in plaats van na de MS. Hier is het gebruik van smalle boring buis (0,1 mm id) is zeer nuttig, wanneer de druk gemakkelijk kan worden aangepast zonder toevoeging ongepast dood volume. Afhankelijk van het type detector aanpassing van de segmentatie verhouding kan worden gedaan vóór of na detector. Wanneer een niet-destructieve detector, zoals UV-Vis wordt gebruikt, zou het percentage stroom worden gemeten en ingesteld na detector. Als een vernietigende detector wordt gebruikt in het opzetten multiplex de stroom percentage wordt bepaald door berekening weer op de andere poort stroming percentages. Als een reagens gebaseerde detector wordt gebruikt zoals DPPH • wordt de stroom gemeten percentage bericht detector zonder toevoeging van reagens; en als twee of meer destructieve detectoren worden toegepast dan de stroomverhouding wordt gemeten pre-detector. Detectie systemen die extra instrumentatie, zoals DPPH • kan eisen, zal extra druk van het systeem die de stroom kunnen veranderen hebbenpercentage eenmaal bevestigd aan het detectiesysteem. Daarom moet een zorgvuldige afweging worden besteed aan de systeemdruk van een destructieve detector, bij het aanpassen van stroom percentage pre-detector. Ongeacht de stroom verhouding die is ingesteld door middel van een van de havens, moeten kwantitatieve informatie worden verkregen door middel van passende standaardisatie. Zodra de stroom verhoudingen zijn ingesteld, maar ze zijn robuust, en ze niet veranderen, zelfs onder omstandigheden gradiëntelutie 7, Is bedoeld de gedetailleerde video protocol bij dit manuscript te laten zien hoe te gebruiken en af ​​te stemmen een kolom PSF functioneren in een multiplex wijze van opsporing.

<table><tbody><tr><td>HPLC-instrument</td><td></td><td></td><td>Meerdere detectoren naar keuze voor multiplexdetectie. De keuze aan detectoren kan extra instrumentatie vereisen, bijv., pomp.</td></tr><tr><td>Parallel gesegmenteerde stroom HPLC-kolom</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Niet gedefinieerd</td><td>Binnenkort gecommercialiseerd</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Elk merk</td><td></td><td>HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>PEEK-buizen</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Verschillende lengtes en i.d.</td></tr><tr><td>Kolomstoppen</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Voor het blokkeren van ongebruikte perifere poorten.</td></tr><tr><td>PEEK-buissnijder</td><td>Elk merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytische weegschaal</td><td>Elk merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stopwatch</td><td>Elk merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eluentverzamellekbakjes</td><td>Elk merk</td><td></td><td>1-2 ml monstervial kan worden gebruikt als eluentverzamellekbakjes</td></tr></tbody></table>

tuning een parallelle gesegmenteerd flow column en multiplexed detection inschakelen

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Actieve stromingstechnologie (AFT) is een nieuwe vorm van kolomtechnologie die is ontworpen om stromingsheterogeniteit te overwinnen om de scheidingsprestaties te verbeteren in termen van efficiëntie en gevoeligheid en om multiplex-detectie mogelijk te maken. Deze vorm van AFT gebruikt een parallel gesegmenteerde stroming (PSF) kolom. Een PSF kolom uitlaat-aansluiting bestaat uit 2 of 4 poorten, die kunnen worden gemultiplext om tot 4 detectoren aan te sluiten. De PSF kolom biedt niet alleen een platform voor multiplex-detectie maar ook de combinatie van zowel destructieve als niet-destructieve detectoren, zonder extra dode volume buiswerk, gelijktijdig. De hoeveelheid stroming door elke poort kan ook worden aangepast door drukbeheer om te voldoen aan de vereisten van specifieke detector(s). Om multiplex-detectie te bereiken met behulp van een PSF kolom zijn er een aantal parameters die kunnen worden geregeld om optimale scheidingsprestaties en kwaliteit van de resultaten te garanderen; dat wil zeggen buismateningen voor elke poort, keuze van poort voor elk type detector en stromingaanpassing. Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een PSF kolom te gebruiken en af te stemmen die functioneert in een multiplex-modus van detectie.

Een gemultiplexte HPLC-analyse werd uitgevoerd met een AFT kolom PSF stand (figuur 1) en ingesteld zoals weergegeven in figuur 2. Dit type installatie kon een koffiemonster gelijktijdig worden geanalyseerd met UV-Vis, DPPH • en MS in Total Ion Count (TIC) modus. De verbindingen van de koffie monster die reageerden op DPPH • kan vervolgens eenvoudig worden aangepast aan de UV-Vis en MS - TIC antwoorden op basis van de uitlijning van de retentietijd zoals geïllustree...

Hier presenteren we een protocol voor de werking en afstemming van parallelle gesegmenteerde flow chromatografie kolommen om multiplexed detectie mogelijk te maken.

Tuning een parallelle gesegmenteerd Flow Column en Multiplexed Detection inschakelen

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Het algemene doel van deze HPLC-procedure is het afstellen van een parallelle gesegmenteerde stroomkolom om multiplex-detectie mogelijk te maken. Deze methode beantwoordt belangrijke vragen op het gebied van gezondheid en welzijn, milieuwetenschappen, forensisch onderzoek en alle gebieden die de analyse van complexe monsters vereisen, zoals bio-ontdekking. Deze techniek maakt een uitgebreide monsteranalyse mogelijk, terwijl er tegelijkertijd informatie wordt verkregen over de chemische en bioactieve eigenschappen van stoffen in complexe mengsels.De protocollen voor multitudetectie maken bovendien een snelle analyse mogelijk. Deze methode maakt de ontwikkeling van strategieën mogelijk om de chemische vingerafdruk van complexe mengsels, zoals koffie en wijn, te definiëren, waardoor fabrikanten het onderscheid kunnen maken tussen hun eigen producten en goedkope vervalsingen. In eerste instantie kan het onorthodox aanvoelen om niet het volledige monster naar slechts één detector te sturen voor een nauwkeurige analyse.De analytconcentratie binnen elke stroom is echter hoger dan de totale stroom van een conventionele kolom. Begin met het instellen van het HPLC-instrument met 100% UE-water en zuiver methanol voor respectievelijk mobiele fasen A en B. Indien er een MS-detector wordt gebruikt, voeg dan 0,1% mierenzuur toe aan beide mobiele fasen en spoel vervolgens de HPLC-pompen door volgens de instructies van de fabrikant.Stel de MS-, UV-, VS- en DPPH-detectoren samen volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat de componenten zodanig zijn geplaatst dat het dode volume in de detectorgestuurde lijnen minimaal is.Stel vervolgens de golflengte van de UV VISTA-detector in op de golflengte die specifiek is voor het betreffende monster. Gebruik 280 nanometers voor de MS-detector. Gebruik de positieve modus voor de analyse van de totale ionenstroom of TIC met de full scan detectiemethode.Stel de temperatuur en de gasstroom van de MS-detector in op de volgende waarden: een vaporizer-temperatuur van 500 °C, een capillaire temperatuur van 350 °C, een hulpgasstroom van 40 units, een sweepgasstroom van 5 units, een sheathgasstroom van 60 units en een sprayspanning van 3,5 kV. Begin bij de bereiding van het DPPH-radicaalreagens met het oplossen van 25 mg DPPH-radicaal in 250 mL methanol in een maatkolf.Voeg 250 µL mierenzuur toe aan de oplossing en sonicate de oplossing gedurende 10 minuten. Dek daarna de kolf en het folie af om blootstelling aan licht te voorkomen. Spoel vervolgens de pomp door met de DPPH-radicaaloplossing volgens de aanwijzingen van de fabrikant om het DPPH-radicaalsysteem in te stellen.Zorg ervoor dat de pompleiding is bevestigd aan de inlaat van een T-stuk, en verbind vervolgens de reactiespoel van 100 microliter met de uitlaat van het T-stuk. Bevestig de detector aan het andere uiteinde van de reactiespoel ENC-behuizing, de reactiespoel en een kolomverwarmer. Stel tenslotte de DPPH-radicaal UV-detector in op 520 nanometer.Om de parallel gesegmenteerde stroom- of PSF-kolom op te bouwen, sluit u eerst de kolominlaat aan op het HPLC-instrument. Gebruik vervolgens een stuk slang om de centrale poort met de MS-detector te verbinden. Gebruik slang met dezelfde afmetingen om één perifere kolompoort aan te sluiten op de UV VS-detector en een andere op het T-stuk van het DPPH-radicaaldetectiesysteem.Blokkeer alle ongebruikte perifere poorten met kolomstoppers. Stel de stroomsnelheid van de HPLC in op één milliliter per minuut van 100% mobiele fase B voor een kolom met een binnendiameter van 4,6 millimeter en een lengte van 250 millimeter. Laat dit 20 minuten equilibreren.Om het PSF-systeem af te stemmen, moeten de verzamelvaten eerst worden geleegd. Gebruik deze flesjes om apart de mobiele fase op te vangen uit de UV VS- en DPPH-radicaalpoorten. Noteer de verzameltijd en vang ten minste 500 milligram oplosmiddel op in elk vat.Weeg vervolgens de opvangvaten om de massa van de mobiele fase te bepalen en deel de massa door de dichtheid van methanol om het volume van de mobiele fase te berekenen dat via elke poort is opgevangen. Bepaal tot slot de stroomsnelheid naar de MS-detector en bereken de stroomverhoudingen van alle detectoren als een percentage van de totale stroom, zoals beschreven in het tekstprotocol. Als de stroomverhoudingen aanzienlijk afwijken van de ideale waarden, voeg dan waar nodig extra slang toe om de tegendruk aan te passen en herhaal het opvang- en berekeningsproces.Stel slutतः de stroomsnelheid van de DPPH-radicaalreagenspomp zo in dat deze overeenkomt met de stroomsnelheid van de uitlaatpoort die verbonden is met de detector. Er werd een gemultiplexe HPLC-analyse uitgevoerd op een koffiemonster. De mogelijkheid om gelijktijdig DPPH-radicaal UV- en MS-chromatogrammen vast te leggen, maakt het mogelijk om de verbindingen in het monster die positief reageerden op het DPPH-radicaal eenvoudig te koppelen aan de UV-chromatogrammen.En voor MS-responsen op basis van retentietijd-uitlijning waarbij een positieve respons werd waargenomen van de MSS TIC-detector, werd de moleculaire massa van de piek geregistreerd. Het gemak waarmee pieken tussen verschillende detectieprocessen kunnen worden gekoppeld, maakt een snelle en efficiëntere vorm van screening en karakterisering mogelijk voor een complex monster zoals koffie. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer een uur worden opgezet en is deze klaar voor monsteranalyse volgens deze procedure. Andere detectoren, zoals brekingsindex- en fluorescentiedetectie, en chemisch gebaseerde detectie zoals chemiluminescentie, kunnen worden gebruikt om aanvullende monsterinformatie te verkrijgen.Na het bekijken van deze video moet u het belang herkennen van het multiplexen van detectieprocessen om een beter inzicht te krijgen in een complex monster. Bovendien is multiplexdetectie met behulp van parallelle gesegmenteerde stroomkolommen een uiterst efficiënte manier om bio-exploratie uit te voeren.

tuning-parallel-segmented-flow-column-enabling-multiplexed

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Een automatische methode om geschikte hydrofobe interactie chromatografie (HIC) media te gebruiken in het proces van eiwitzuivering gepresenteerd. De werkwijze maakt gebruik van een medium-druk vloeistof chromatografie systeem met automatische buffer mengen dynamische monsterlus injectie opeenvolgende kolomselektiemiddelen, multi-golflengte analyse en split fractie eluaat collectie.

Geautomatiseerde hydrofobe interactiechromatografie Kolomselectieopties voor gebruik in Protein Purification

Een protocol voor het gebruik van reactieflow hoogprestatievloeistofchromatografie kolommen voor methoden die post-kolom derivatisatie (PCD) toepassen, wordt gepresenteerd.

Bericht Column Derivatisering behulp Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Hier presenteren we een protocol voor de werking en optimalisatie van Active Flow Technology (AFT) kolom in Curtain flow (CF) modus voor verbeterde scheidingsprestaties.

Gordijn Flow Column: Optimalisatie van efficiëntie en gevoeligheid

Een snel protocol voor proteolytische vertering met een zelfgebouwde flow-through tryptische microreactor gekoppeld aan een elektrospray-ionisatie (ESI) massaspectrometer wordt gepresenteerd. De fabricage van de microreactor, de experimentele opstelling en het proces voor gegevensverzameling worden beschreven.

Fast enzymatische verwerking van eiwitten voor MS Detection met een Flow-through Microreactor

Meerkleurige fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica omvat doorgaans omvangrijke en complexe detectiesystemen op basis van epifluorescentiemicroscopen. Hier beschrijven we een compact en modulair meerkleurig detectieschema dat gebruikmaakt van een reeks optische vezels om meerkleurige gegevens die door een enkele fotodetector worden verzameld, tijdelijk te coderen.

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

We tonen een microfluïdische platform met een geïntegreerde oppervlakte-elektrode netwerk resistieve pulse sensing (RPS) met code division multiple access (CDMA) combineert, om detectie en afmeting van deeltjes in meerdere microkanalen multiplexen.

Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Dit protocol demonstreert een eenvoudig, robuust en hoge doorvoer enkel molecuul stroom-stretching assay voor het bestuderen van de eendimensionale (1D) verspreiding van moleculen langs DNA.

Een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul Flow uitrekkende Assay uitvoering voor de studie van vervoer van moleculen langs DNA

Gedetailleerde hierin zijn de werking en vergadering protocollen van een modulaire microfluidic screening platform voor de systematische karakterisering van colloïdale semiconductor nanocrystal syntheses. Door middel van volledig aanpasbare systeem regeling kan hoogefficiënte spectra verzamelen over 4 ordes van grootte reactietijd schalen binnen een ruimte die massa overdracht-gecontroleerde steekproeven worden uitgevoerd.

Een modulaire Microfluidic technologie voor systematische Studies van colloïdale Semiconductor nanokristallen

Hier presenteren we een protocol voor de geoptimaliseerde FlashPack capillaire kolomverpakkingsprocedure. Toepassing van een geoptimaliseerd protocol op een gemeenschappelijke 100-bar drukbomopstelling maakt 10 keer snellere verpakking en productie van lange ultra-high performance capillaire kolommen mogelijk.

Eenvoudige in-house ultra-high performance capillaire kolomproductie met de FlashPack-aanpak

Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.

Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

Deze studie verbetert de nauwkeurigheid van de elektromagnetische debietmeter door excitatiegolfvormen te optimaliseren, meertraps filtering toe te passen en gebruik te maken van op Complex Programmable Logic Device (CPLD) gebaseerde rectificatie. Een nieuwe, op golfvormen gebaseerde detectiemethode voor lege leidingen verhoogt de betrouwbaarheid. Experimenten tonen een nauwkeurigheid van 0,1% binnen 0,1-15 m/s, wat de industriële toepasbaarheid valideert.

Uiterst nauwkeurige elektromagnetische flowmeter met detectie van lege leidingen via complexe programmeerbare logische apparaatgebaseerde golfvormherkenning

Leer hoe u een parallelle gesegmenteerde flow-kolom afstemt voor multiplex detectie in HPLC-analyse. Deze methode versnelt de analyse van complexe monsters zoals koffie en wijn aanzienlijk.

Tuning een parallelle gesegmenteerd Flow Column en Multiplexed Detection inschakelen

Meer video's verkennen