Name: Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Leer hoe je oxytrofe mutanten van Saccharomyces boulardii genereert met UV-mutagenese en hun hechting aan Peyer's patches in muizen verifieert. Deze methoden ondersteunen onderzoek naar orale vaccinatie en gastro-intestinale therapeutica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen financiering via het Children&#39;s Center voor Immunologie en vaccins en een NIH New Innovator Award (1DP2AI112242-01) toegekend aan Tracey J. Lamb. De auteurs danken ook Natalya P. Degtyareva voor de gulle bijdrage van Rad1 S. cerevisiae.

<ol><li>Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+and+physiological+characterization+of+Saccharomyces+boulardii%2C+the+probiotic+strain+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).</li>
<li>Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Heterologous+Protein+Expression+by+Genetically+Engineered+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii.</a> PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+in+Enzymology%2C+Volume+149%3A+Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , (1991).</li>
<li>DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+with+PCR+products+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 158, 113-117 (1995).</li>
<li>Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+Uracil+Auxotroph+Strain+of+the+Probiotic+Yeast+Saccharomyces+boulardii+as+a+Host+for+the+Recombinant+Protein+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+Journal+of+Medical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).</li>
<li>Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).</li>
<li>Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+transformation+of+intact+yeast+cells+by+electroinjection+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).</li>
<li>Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBecker%2C+D+%22Methods+in+Enzymology%2C+Volume+149%3A+Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. , 182-187 (1991).</li>
<li>Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+yeast+transformation+method+for+the+generation+of+very+large+human+antibody+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+engineering%2C+design+%26+selection+%3A+PEDS%22%5BJournal%5D)">An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries.</a> Protein engineering, design & selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).</li>
<li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi%3A+methods+and+possible+underlying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered+bugs%22%5BJournal%5D)">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li>
<li>Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+transformation+process+studied+by+fluorescence+labeling+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique.</a> Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of yeast.</a> BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).</li>
<li>JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology</a>. , (2015).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).</li>
<li>Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Can%27t+Rodents+Vomit%3F+A+Comparative+Behavioral%2C+Anatomical%2C+and+Physiological+Study%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spoonful+of+sugar+helps+the+medicine+go+down%3A+a+novel+technique+to+improve+oral+gavage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).</li>
<li>Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+M+%22Animal+Models+in+Toxicology%22">Animal Models in Toxicology</a>. , 50-193 (2006).</li>
<li>Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+produced+by+gavage+administration+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+topics+in+laboratory+animal+science+%2F+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Stress produced by gavage administration in the rat.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).</li>
<li>Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacoby%2C+R+%22Laboratory+animal+medicine%22">Laboratory animal medicine</a>. , 35-133 (2002).</li>
<li>Schulz, O., Pabst, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+sampling+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen sampling in the small intestine.</a> Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).</li>
<li>McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Farache, J., Koren, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+bacteria+recruit+CD103%2B+dendritic+cells+into+the+intestinal+epithelium+to+sample+bacterial+antigens+for+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation.</a> Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).</li>
<li>Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+D+%22Methods+in+yeast+genetics%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).</li>
<li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5%27-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast%3A+5-fluoro-orotic+acid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+general+genetics+%3A+MGG%22%5BJournal%5D)">A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Molecular & general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).</li>
<li>Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+lys2+mutants+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+the+utilization+of+alpha-aminoadipate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate.</a> Genetics. 93, 51-65 (1979).</li>
<li>Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+counterselection+for+the+tryptophan+pathway+in+yeast%3A+5-fluoroanthranilic+acid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance.</a> Yeast. 16 (6), Chichester, England. 553-560 (2000).</li>
<li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+characterization+of+met15+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae%3A+a+selective+system+for+forward+and+reverse+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations.</a> Genetics. 81, 75-97 (1975).</li>
<li>Singh, A., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+relationships+of+mercury+resistant+mutants+and+methionine+auxotrophs+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).</li>
<li>McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+binding+to+cell-surfaces+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc%2FSS-DNA%2FPEG+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li>
<li>Zhang, Z., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+stability+in+recombinant+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 14 (4), 401-435 (1996).</li>
<li>Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+Fluorescent+Protein+Is+Lighting+Up+Fungal+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).</li>
<li>Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+the+preparation+of+yeast+cells+for+transformation+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation.</a> Yeast. 14, 565-571 (1998).</li>
<li>Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gavage-related+reflux+in+rats%3A+identification%2C+pathogenesis%2C+and+toxicological+implications+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+pathology%22%5BJournal%5D)">Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review).</a> Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).</li>
<li>Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+uptake+of+biodegradable+nanoparticles%3A+effect+of+particle+size%5BTitle%5D)+AND+%22Pharma%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size.</a> Pharma. 13 (12), (1994).</li>
<li>Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+uptake+by+Peyer%27s+patches%3A+a+pathway+for+drug+and+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+delivery%22%5BJournal%5D)">Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery.</a> Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).</li>
<li>Szymanski, E. P., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+protein+extraction+and+purification+for+the+study+of+function%2C+interactions%2C+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921(2013).</li>
<li>Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Auxotrophic+Mutants+of+Diploid+Industrial+Yeast+Strains+after+UV+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis.</a> Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Samen vormen de protocollen beschrijven hierin de essentiële stappen die nodig zijn voor het ontwikkelen en testen van auxotrofe probiotische giststammen voor afgifte van heteroloog therapeutisch eiwit aan de darm. Deze manipulatie en het testen van recombinant probiotische gist vereist technieken en middelen waarmee een individu laboratorium kan op dit moment niet bekend zijn. Dus, hoewel talrijke eerdere studies de hierboven beschreven protocollen voor meerdere gist en muis stammen, deze methoden hebben niet om de ken...

Probiotische micro- organismen een intrigerende potentieel middel efficiënt en economisch afleveren heterologe eiwitten aan het maagdarmkanaal. Deze organismen kunnen overleven passage door het maagdarmkanaal nog niet koloniseren 1, waardoor geregelde dosering en beperken van de blootstelling aan het geneesmiddel expressie. Bovendien de mogelijkheid om eenvoudig manipuleren deze organismen heterologe eiwit op grote schaal maakt ze een voordelig alternatief voor synthetische levering deeltjes. Echter, de ontwikkeling van een dergelijke benadering, zoals onlangs aangetoond met een auxotrofe stam van het probiotische gist Saccharomyces boulardii 2, vereist kennis van laboratoriumtechnieken gewoonlijk niet gecombineerd tot een bepaald onderzoek, van gist en moleculaire biologie dier behandelingstechnieken en immunologische werkwijzen. Hoewel dus de hierin beschreven afzonderlijke procedures op zichzelf niet nieuwlaboratoriumprotocollen het doel van dit manuscript is om een ​​uniforme inleiding technieken die nodig zijn voor experimentele testen van probiotische gist geneesmiddelafgiftedragers met het muize maagdarmkanaal aanwezig. Verschaft wordt een compilatie van essentiële protocollen: 1) productie van auxotrofe mutante giststammen die gemakkelijk genetisch kunnen worden gemanipuleerd; 2) transformatie van gist culturen heteroloog eiwit tot expressie brengen; 3) toediening van recombinant gist de darm via orale gavage; en 4) het herstel van levensvatbare recombinant probiotische gist uit de muizen darm en beoordeling van hun heterologe eiwitexpressie. Eerst, hoewel talrijke positieve en negatieve selectie methoden bestaan ​​voor het manipuleren van gistsoorten, negatieve selectie bijvoorbeeld door het gebruik van auxotrofe merkers verhoogt de efficiëntie en het gemak waarmee gist kan worden getransformeerd en geselecteerd. Positieve selectie van transformanten het gebruik van antibiotica, in samenwerkingntrast, verhoogt de kosten van gist manipulatie. Bovendien kan selectie van gist op antibiotica bevattende vaste media zorgen voor meer groei van getransformeerde achtergrond kolonies ten opzichte van selectie van auxotrofe gist over synthetische drop-out vaste media (niet gepubliceerde waarnemingen). Auxotrofe gist stammen die enzymen die kritisch zijn voor de synthese van essentiële aminozuren of uracil ontbreekt. Dergelijke gist kan alleen groeien als aangevuld met de ontbrekende metaboliet of metabole gen, waardoor negatieve selectie wanneer gist wordt uitgeplaat op synthetische drop-out media dat de essentiële metaboliet ontbreekt. Veel veelgebruikte Saccharomyces cerevisiae laboratoriumstammen zijn in feite al auxotrofe mutanten 3. Industriële, klinische en probiotische giststammen zijn echter meestal prototrofe met de mogelijkheid om alle benodigde voedingsstoffen synthetiseren. Efficiëntere genetische manipulatie van dergelijke gist mogelijk te maken, kunnen auxotrofe genen selectief worden gerichtstammen die kunnen worden geselecteerd zonder antibiotica te genereren. Specifiek richten auxotrofe merker genen kan worden bereikt door PCR gemedieerde genverstoring beroep op homologe recombinatie of recenter tot CRISPR / Cas9 targeting 4-6. Als alternatief kunnen UV-mutagenese snel genereren auxotrofe mutanten zelfs in giststammen die transformatie met meerdere plasmiden is technisch moeilijk 7. Terwijl PCR targeting en CRISPR / Cas9 zijn uitgebreid elders zijn beschreven, gepresenteerd in het eerste deel van dit manuscript is een gedetailleerd protocol beschrijft een UV-mutagenese benadering van auxotrofe stammen die zal zorgen voor negatieve selectie in plaats van positief antibiotische selectie van gist-transformanten te creëren. De volgende noodzakelijke stap in het gebruik van dergelijke auxotrofe stammen voor orale afgifte van heteroloog eiwit gist transformatie met plasmide-DNA. Sinds de eerste succesvolle transformatie van yeast sferoplasten gerapporteerd voor Saccharomyces cerevisiae in 1978 8, zijn talrijke wijzigingen gekarakteriseerd om de efficiëntie en het gemak waarmee gistsoort genetisch kunnen worden gemodificeerd. Gebruik van elektroporatie voor de succesvolle transformatie van DNA in S. cerevisiae werd eerst beschreven in 1985 9 en is sindsdien verbeterd via de toevoeging van 1 M sorbitol incubatie osmotisch steuncellen 10. Electroporatie efficiency is bovendien aangetoond dat afhangen van de gistsoort en stam celaantal en groeifase, elektroporatie volume, veldsterkte en specifieke buffers 11. Lithiumacetaat (LiOAc) transformatie, oorspronkelijk beschreven door Ito et al. 12, is een van de meest gebruikte transformatie protocollen zoals vereist geen speciale apparatuur. Aanvullende analyses toonden aan dat de efficiëntie van LiOAc gist transformatie verhoogt wanneer cellen worden verzameld in mid-log-fasegroei en worden warmteschok in aanwezigheid van polyethyleenglycol (PEG) en DNA bij 42 ° C 12. Incubatie van intacte gist geheel met PEG is essentieel voor efficiënte transformatie, mogelijk door verbetering bevestiging van DNA aan het celmembraan en via andere effecten op het membraan 13. Lithium zelf verhoogt ook de permeabiliteit van intacte cellen 14. Hoewel de meeste laboratorium S. cerevisiae stammen kunnen gemakkelijk worden omgezet middels LiOAc transformatie 3, kunnen andere gistsoorten efficiënter omgezet alternatieve protocollen. Pichia pastoris, bijvoorbeeld, is het meest efficiënt omgezet via elektroporatie plaats LiOAc transformatie 13. Het is cruciaal derhalve testen meerdere methoden voor transformatie en incubatieperiode en reagens concentraties te optimaliseren bij een poging om genetisch te modificeren een uncharacterized giststam. Dit manuscript beschrijft dus zowel LiOAc transformation en elektroporatie als technieken voor de transformatie van auxotrofe mutant en wildtype S. boulardii. Geïnteresseerde lezers zijn gericht op de recente beoordelingen voor een grondige beschrijving van de evolutie van gist transformatie, alternatieve protocollen, en de verdere discussies over mogelijke werkingsmechanismen 13,15. Transformatie van gist met plasmide dat codeert voor een gemakkelijk detecteerbaar eiwit ook van groot belang voor stroomafwaartse testen teneinde juiste expressie en functie van heteroloog eiwit te garanderen. Talloze verschillende eiwitten kunnen worden geselecteerd afhankelijk van het uiteindelijke doel van de therapeutische studie en de voor eiwit detectie antilichamen door immunoblotting, ELISA en andere technieken. Protocollen voor deze technieken zijn uitvoerig beschreven elders 16,17 en kunnen worden gebruikt om niveaus van heterologe eiwitproductie uit getransformeerde gist te bepalen in vergelijking met standaard curves. Voor demonstratiedoeleinden en tonensuccesvolle productie van een zeer algemeen gebruikte eiwit in gist biologie, dit manuscript geeft transformatie met plasmide dat codeert voor groen fluorescent eiwit (GFP), waardoor voor daaropvolgende detectie middels fluorescentiemicroscopie. Even belangrijk voor de productie van probiotische organismen die tot expressie heteroloog eiwit goed beheer en detectie van deze micro-organismen in het maagdarmkanaal weefsels, zoals uiteengezet onder drie en vier. Toediening van recombinant gist via orale sondevoeding maakt afgifte van gecontroleerde hoeveelheden gist direct in de maag, waar C57BL / 6-muizen van nature niet in staat 18 braken. Echter, ongepaste dierlijke behandeling en sondevoeding leiden tot slokdarmkanker schade en perforatie, maagperforatie, tracheale administratie en aspiratiepneumonie 19,20. Slechte techniek en onervarenheid kan verder toenemen variabiliteit in muizen immuunreacties en experimentele results, die zijn toegeschreven aan dierlijke nadruk op orale gavage 21,22. Praktijk de juiste techniek kan derhalve niet alleen ongemak verminderen dier, maar ook precisie van experimentele resultaten verhogen. Dit manuscript beschrijft en demonstreert dierlijke behandeling en orale sondevoeding voor het beheer van gecontroleerde doses van recombinant gist. Tenslotte is het essentieel om succesvolle uitvoering van recombinante gist bevestigd door analyse lymfoïde weefsels op de aanwezigheid van gist en heteroloog eiwit. Het maag immune weefsels die het gemakkelijkst en voorspelbaar voor de vinding onderzocht zijn de plaques van Peyer. Peyer&#39;s patches zijn secundaire lymfoide organen langs de dunne darm dat de belangrijkste bezienswaardigheden van mucosale immuunrespons inductie 23 zijn. Antigenen uit de lumen worden overgedragen via transcellulair microfold (M) cellen in het epitheel en vrijkomen in de plaques van Peyer, aldus blootstellen omsluitend antigeenpresenterende cellen luminale inhoud intestinale. Hoewel deeltjes opname door de intestinale epitheel ook kan worden bereikt door slijmbekercellen werden deze cellen is aangetoond dat alleen van deeltjes kleiner dan 0,02 pm in diameter 24. Transepithele dendrieten verlengd van CD103 + dendritische cellen (DC) ook van kleine deeltjes uit het darmlumen 25; Er zijn echter nog geen rapporten die aantonen dat CD103 + DCs nemen deeltjes groter dan bacteriën. Aldus intact probiotische gist, van gemiddelde grootte tussen 3-6 pm in diameter, hoogstwaarschijnlijk door M-cellen worden genomen en overgedragen aan de plekken van Peyer. Hier beschreven is een protocol voor het verzamelen en screening van plaques van Peyer van levensvatbare recombinante gist, alhoewel deze procedure ook gemakkelijk kan worden aangepast voor de evaluatie opname van probiotische bacteriën. Kortom, de beoordeling recombinante probiotische gist voor de levering van derapeutic eiwitten naar de darm vereist vaardigheid in laboratoriumtechnieken verspreid over de moleculaire biologie van dieren handling en immunologie. hier gepresenteerde zijn protocollen voor 1) het genereren en screenen van auxotrofe giststammen die gemakkelijk kan negatief zonder antibiotica worden geselecteerd, 2) alternatieve protocollen om gist te transformeren en in staat de expressie van heteroloog eiwit, 3) demonstraties van de juiste behandeling van dieren technieken en orale sondevoeding voor intragastrische levering van recombinante gist, en 4) protocollen voor Peyer&#39;s patch dissectie en screenen op levensvatbare recombinante gist en functioneel heterologe eiwitten. Samen zullen deze protocollen zorgen voor het genereren en testen van een probiotische giststam kan leveren heteroloog therapeutisch eiwit aan het maagdarmkanaal.

<table><tbody><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>Voorbeeld van een spectrophotometer voor het bepalen van de celconcentratie en OD600 van gistculturen</td></tr><tr><td>New Brunswick Roller Drum</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>Voorbeeld van een rollerdrum voor gistcultuur incubatie</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075-03</td><td>Voorbeeld stratalinker</td></tr><tr><td>Stuart Colony Counter SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher Scientific</td><td>Staand plaatje met vergroting registreert het aantal kolonies bij het voelen van druk van de pen</td></tr><tr><td>Scienceware Colony Counter&nbsp;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>Handmatige kolonieteller pen</td></tr><tr><td>Replica plating device</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>Voorbeeld van replica plating stand en pads&nbsp;</td></tr><tr><td>Velveteen squares</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>L-vormige steriele celverspreiders&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonucleïnezuur, enkelstrengs uit zalmtestikels</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>Voorbeeld drager DNA voor gist LiOAc transformatie</td></tr><tr><td>Gavagenaalden</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&nbsp; 002</td><td>Voor muizen van 15-20 g, is de aanbevolen naald een 22 gauge (1,25 mm kogel), 1 inch lang, herbruikbare, rechte gavagenaald. Voor muizen met een gewicht van meer dan 20&nbsp; g, kunnen 20 gauge of grotere rechte of gebogen gavagenaalden worden gebruikt</td></tr><tr><td>1 ml steriele slip-tip wegwerp tuberculine spuit</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Blunte pincetten zoals Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) getande tip, brede grip pincetten</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77937-28</td><td>Voorbeeld van blunte pincetten nodig voor dissectie&nbsp;</td></tr><tr><td>Rechte en gebogen dissectiescharen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72966-02 en 72966-03</td><td>Voorbeelden van schaar nodig voor dissectie</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale immune tissues na orale sondevoeding in muizen

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

De ontwikkeling van recombinante orale therapie zou een meer directe aanpak van het mucosale immuunsysteem mogelijk maken en de mogelijkheid verbeteren om gastro-intestinale aandoeningen te bestrijden. Het aanpassen van specifiek probiotische gist voor deze benadering biedt verschillende voordelen. Deze stammen hebben niet alleen het potentieel om een grote verscheidenheid aan complexe heterologe eiwitten te synthetiseren, maar zijn ook in staat om te overleven en die eiwitten te beschermen tijdens het transport door de darm. Belangrijk is echter dat deze aanpak expertise vereist in vele diverse laboratoriumtechnieken die doorgaans niet in tandem worden gebruikt. Verder, hoewel individuele protocollen voor gisttransformatie goed gekarakteriseerd zijn voor veelgebruikte laboratoriumstammen, wordt hier de nadruk gelegd op alternatieve benaderingen en de belangrijkheid van het optimaliseren van transformatie voor minder goed gekarakteriseerde probiotische stammen. Het beschrijven van deze methoden zal de discussie helpen faciliteren over de beste benaderingen voor het testen van probiotische gist als orale geneesmiddelafgiftesystemen en zal inderdaad dienen om de ontwikkeling van deze nieuwe strategie voor gastro-intestinale therapie te bevorderen.

Genereren van een overlevingscurve na UV bestraling vereist plating verdunde gistcellen zodat afzonderlijke kolonievormende eenheden (CFU) kunnen vormen. Elk 500 pl monster verzameld zoals hierboven beschreven bevat ongeveer 5 x 10 6 cellen; Echter, meer dan 100 kolonies per plaat zijn moeilijk om nauwkeurig te onderscheiden. Plating onverdund monster en seriële verdunningen van 1:10 bestraalde cellen dus zorgt ervoor dat CFU kunnen worden geteld op elke UV dosering, zoals aan...

Hier voorgesteld is een enkelvoudige beschrijving van technieken die kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen, veranderen, beheren en testen heterologe eiwitexpressie van de probiotische gist Saccharomyces boulardii.

Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Het algemene doel van deze procedures is het ontwikkelen van een stam van probiotische gist die eenvoudig getransformeerd kan worden om heterologe eiwitten te tot expressie te brengen en af te leveren in het gastro-intestinale kanaal van muizen. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze de snelle generatie van oxotrofe stammen van probiotische gist mogelijk maken. Deze gemuteerde gisten kunnen vervolgens genetisch worden gemanipuleerd zonder afhankelijk te zijn van antibioticaselectie.Orale gavage van muizen en het oogsten van de Peyers plaques maakt het ook mogelijk om de adhereentie van gemuteerde gist aan de immuunweefsels van het maagdarmstelsel te verifiëren. Deze methoden zullen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van orale vaccinatie en experimenten faciliteren voor het testen van probiotica voor de toediening van gastro-intestinale therapeutica. Nadat het YPD-medium is bereid en de gist gedurende de nacht tot verzadiging is gekweekt, worden de cellen één op tien verdund in water in een plastic cuvette.Nul vervolgens een spectrofotometer en bepaal de optische dichtheid van de overnight-kweek. Verdun de cellen met 20 milliliter steriel gede

transformation-probiotic-yeast-their-recovery-from-gastrointestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a procedure of fecal microbiota transplantation in an interleukin-10 deficient mouse with colon inflammation. Colonized fecal microbes in the gut release secondary metabolites, eliciting anti-inflammatory cytokine release and reducing colon inflammation.

Evaluating the Effects of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin-10 Deficient Mouse

This video showcases the oral administration of transformed yeast cells into a mouse model. The transformed yeast cells are orally administered using a gavage technique, reaching the mouse's stomach. Later, the cells migrate to the small intestine, where microfold cells engulf them and facilitate their transfer to Peyer's patches and gain access to the intestinal immune system.

Oral Delivery of Transformed Yeast Cells into the Mouse Intestinal Immune System

Hier bieden wij gedetailleerde protocollen voor de orale toediening van antibiotica aan muizen, verzameling van fecale monsters, DNA-extractie en kwantificering van fecale bacteriën door qPCR.

Kwantitatieve Polymerase Chain Reaction gebaseerde Analyses van lymfkliertest intestinale Microbiota na behandeling met mondelinge antibiotica

Deze studie een overzicht van het proces van de precieze bedragen gavaging van probiotica met neonatale muizen. De experimentele opstelling is geoptimaliseerd om te omvatten maar is niet beperkt tot probiotische doseren, methoden voor beheer, en kwantificering van bacteriën in de darmen.

Probiotische Studies in neonatale muizen met behulp van de maagsonde

We beschrijven een nieuwe methode voor het genereren van dubbele gehumaniseerde blt-muizen die een functioneel menselijk immuunsysteem en een stabiel geënt mens-achtige gut microbiome bevatten. Dit protocol kan worden gevolgd zonder de noodzaak van kiemvrije muizen of gnotobiotische faciliteiten.

Een dubbel gehumaniseerd BLT-muizen model met een stabiele mens-achtige gut Microbiome en menselijk immuunsysteem

Het doel van dit protocol is het visualiseren van Candida albicans celvorm en lokalisatie in het maagdarmkanaal van zoogdieren.

Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

De interactie van genetische gevoeligheid, mucosale immuniteit en intestinale micro-ecologische omgeving is betrokken bij de pathogenese van inflammatoire darmziekte (IBD). In deze studie pasten we fecale microbiota-transplantatie toe op IL-10-deficiënte muizen en onderzochten we de impact ervan op darmontsteking en hartfunctie.

Therapeutische evaluatie van fecale microbiotatransplantatie in een interleukine 10-deficiënt muismodel

Hier presenteren we een protocol om het door antibiotica geïnduceerde pseudo-kiemvrije dextraansulfaat-natrium-geïnduceerde colitis-muismodel op te stellen om de rol van darmmicrobiota bij het reguleren van de positieve effecten van Bacillus cereus op colitis te onderzoeken.

Onderzoek naar de verlichtende effecten van toediening van Bacillus cereus op colitis door middel van darmmicrobiotamodulatie

Bacteriofagen (fagen), virussen die bacteriën infecteren, zijn een integraal onderdeel van het darmmicrobioom. Hoewel deze symbiotische bewoners de bacteriële fitheid en populatiedynamiek aansturen, is er weinig bekend over hoe ze de darmhomeostase en ziekte beïnvloeden. Dit protocol bestudeert geïsoleerde T4-fagen in een muismodel, aanpasbaar aan andere faag-bacterieparen.

T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

Dit protocol beschrijft de beste praktijken voor kiemvrije overdracht van muizen naar en huisvesting in experimentele isolatoren met één kooi (isocages) met behoud van steriele omstandigheden. Methoden voor fecale transplantatie in kiemvrije muizen en het verzamelen van levensvatbare bacteriën van deze darm "gehumaniseerde" muizen voor verdere toepassingen worden besproken.

Voorbereiding en onderhoud van Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment voor menselijke fecale transplantatie in kiemvrije muizen

Leer hoe je oxytrofe mutanten van Saccharomyces boulardii genereert met UV-mutagenese en hun hechting aan Peyer's patches in muizen verifieert. Deze methoden ondersteunen onderzoek naar orale vaccinatie en gastro-intestinale therapeutica.

Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen

Meer video's verkennen