Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo
2 april 2016
Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.
Het algemene doel van deze beeldvormingsmethode is om subcellulaire organellen in een gewervelde in vivo te bestuderen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van neuronale celbiologie, zoals de dynamica van mitochondriën of centrosomen in een in-vivo context. Het grote voordeel van deze techniek is dat het hele experiment kan worden uitgevoerd in een intacte gewervelde, zonder dat er een chirurgische ingreep nodig is.
Deze methode kan niet alleen inzicht geven in de subcellulaire dynamica onder fysiologische omstandigheden, maar kan ook worden toegepast op studies van thesismodellen, zoals de ziekte van Alzheimer. Na het genereren van tijdelijk expresserende embryo's door micro-injectie, of het verkrijgen van embryo's uit stabiele transgene lijnen, volgens het tekstprotocol, screen aan het einde van de eerste dag op dode of onbevruchte eieren. Gebruik een plastic overdrachtspipet om de levensvatbare embryo's over te brengen naar Danieau's oplossing met 1x PTU om pigmentvorming te voorkomen, en bewaar de embryo's in Danieau's oplossing met 1x PTU tot het screenen op transgeenexpressie.
Op de dag van het beeldvormingsexperiment, gebruik een fluorescentie dissectiemicroscoop om anesthetiseerde embryo's te screenen op transgeenexpressie. Breng vervolgens de geselecteerde embryo's over naar een afzonderlijke petrischaal met Danieau's buffer met 1x PTU en 1x tricaine. Zodra de embryo's zijn geanesthetiseerd, pipet een paar ervan voorzichtig in de lage smeltende agarose met 1x PTU en 1x tricaine, waarbij u zo min mogelijk vloeistof gebruikt om verdunning van de agarose te voorkomen.
Breng de embryo's met een kleine hoeveelheid agarose over naar een petrischaal met glazen bodem. Gebruik vervolgens, relatief snel werkende, pincetten om de embryo's in de gewenste oriëntatie te plaatsen, afhankelijk van de te beeldvormen structuur. De embryo's moeten bijvoorbeeld plat op de zijkant zijn gepositioneerd voor het beeldvormen van de retina of een Rohon-Beard neuron.
Een nauwkeurige oriëntatie zal zorgen voor de beste beeldkwaliteit en optimaliseert de acquisitiesnelheid. Nadat de agarose minimaal 15 minuten is uitgehard, voegt u Danieau's buffer toe met 1x PTU en 1x tricaine om de embryo's te bedekken. Om breedveldmicroscopie uit te voeren, na het gelijkmaken van een schaal met gemonteerde vissen in een verwarmingskamer op 28,5 graden Celsius, op het podium van een breedveldmicroscoop, en het kiezen van een gebied van belang, opent u de microscoopsoftware.
Onder Verlichting, klik op Configuratie-instellingen om de juiste filtersets voor de golflengte van belang te definiëren. Onder Camera-instellingen, voer de belichtingstijd in die nodig is om een geschikt beeld te verkrijgen. Kies vervolgens een objectief met lange werkafstand, water-dip, variërend van 40x tot 100x vergroting, met de hoogste numerieke apertuur en chromatisch gecorrigeerd.
Klik op Live om het gezichtsveld te kiezen. In het geval van een R-B neuron, beeld mitochondriale transport af bij de stamacson, afkomstig van het cellichaam of in de perifere arbor. Klik vervolgens in het ImageJ menu op de rechthoekige selectieknop en definieer een gebied van belang, of ROI.
En klik op ROI in het micromanager venster. Na het selecteren van de ROI voor beeldvorming, klik op Stop en Save om de neuronale morfologie in het YFP kanaal op te nemen. Om mitochondriale transport af te beelden, klik op Multi-D Acquisitie.
Selecteer vervolgens in het venster Multi-dimensionale Acquisitie het aantal tijdstippen en het interval tussen de tijdstippen. Klik in het venster Multi-dimensionale Acquisitie op Kanalen en voeg de golflengte toe voor beeldvorming en de belichtingstijd. Klik op Afbeeldingen opslaan om de bestanden automatisch op te slaan in de specifieke map die in de directoryroute is aangegeven.
Klik nu op Verwerven in de rechterbovenhoek om de tijdsloopbeeldvorming te starten. Voor confocale microscopie, na het plaatsen van de gemonteerde embryo's in een verwarmingskamer op 28,5 graden Celsius op de confocale podium, opent u de microscoopsoftware en klikt u op Trans Lamp of Epi Lamp. Gebruik vervolgens via de oculairen van de microscoop respectievelijk getransmetteerd of fluorescentielicht om het gebied van belang te identificeren.
In het Venster Acquisitie-instellingen, controleer of het objectief dat is gekozen voor beeldvorming overeenkomt met het objectief dat verschijnt in het vervolgkeuzemenu van de beschikbare objectieven. Klik vervolgens in het Venster Beeldverwervingscontrole op de knop voor de kleurstoffenlijst en selecteer de geschikte fluoroforen. Klik alternatief op de knop Lichtbaan en Kleurstoffen om de parameters handmatig in te stellen.
In het Venster Acquisitie-instellingen, pas de zoomfactor en de aspectverhouding van het gescande beeld aan om de pixelsgrootte te verkrijgen die nodig is om de geïmporteerde structuren het best op te lossen. Stel de pixelsgrootte in op ongeveer de helft van de theoretische resolutie van het objectief, waardoor de criteria van Nyquist's sampling worden gevolgd. Om de pixelsgrootte van een verkregen beeld te bepalen, klikt u in het Venster Beeldverwervingscontrole op de knop I.
Stel vervolgens de scannelheid in op de snelst mogelijke. Klik vervolgens in het Venster Beeldverwervingscontrole op Kalman lijngemiddeld en stel in op een factor van twee of drie om ruis te verminderen. Om een sequentiële scanmodus te selecteren voor het afbeelden van fluoroforen met overlappende spectra, klikt u op Sequentieel en Lijn.
Pas vervolgens de uitgangskracht van de relevante laserlijnen aan. Om het geselecteerde gebied continu te scannen terwijl de detectorinstellingen voor elk kanaal worden aangepast, klikt u op XY Herhalen of Focus x2 of Focus x4. Pas vervolgens HV, Gain en Offset voor elk kanaal aan om afbeeldingen te verkrijgen met de hoogste dynamische waaier van grijstinten.
Druk nu op Control plus H om de verkregen afbeeldingen te visualiseren via een lookup table die onverzadigde pixels in blauw identificeert, en oververzadigde pixels in rood, die beide moeten worden vermeden. Evalueer de uitgangskracht van de relevante laserlijnen opnieuw, en de detectorinstellingen. Om de bovenste en ond
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het in beeld brengen van subcellulaire organellen, specifiek centrosomen en mitochondriën, in levende zebravisembryo's. De techniek stelt onderzoekers in staat om de dynamiek van organellen in vivo te bestuderen, wat inzicht biedt in fysiologische omstandigheden en ziektebeelden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van organel-dynamiek is cruciaal voor inzichten in cellulaire functies.
- Het bestuderen van deze dynamiek in vivo biedt voordelen ten opzichte van traditionele methoden.
- Zebravisembryo's dienen als model voor studies naar gewervelden.
- Deze methode kan worden toegepast op diverse ziektemodellen, waaronder de ziekte van Alzheimer.
Doel van de studie
- Om de dynamiek van mitochondriën en centrosomen in levende organismen te onderzoeken.
- Om een niet-invasieve methode te bieden voor het bestuderen van subcellulaire structuren.
- Om het begrip van het gedrag van organellen onder fysiologische omstandigheden te vergroten.
Gebruikte methoden
- Genetische markering van centrosomen en mitochondriën.
- Wide-field- en confocale microscopie voor beeldvorming.
- Micro-injectie om embryo's met transiënte expressie te genereren.
- Gebruik van Danieau-oplossing met PTU om de levensvatbaarheid van de embryo's te behouden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van organeldynamica in levende zebravissenembryo's.
- Inzichten in het gedrag van mitochondriën en centrosomen in vivo.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van ziektemodellen.
- Demonstratie van een niet-invasieve aanpak voor subcellulaire beeldvorming.
Conclusies
- Deze methode biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van organeldynamiek.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek naar neuronale celbiologie en ziektemechanismen.
- De techniek kan worden aangepast aan diverse experimentele contexten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Het afbeelden van subcellulaire organellen in levende gewervde embryo's maakt directe observatie mogelijk van dynamische cellulaire processen die relevant zijn voor targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Het zebravismodel biedt een intact, optisch toegankelijk systeem voor het bestuderen van organelgedrag onder fysiologische omstandigheden, wat het voorspellend vertrouwen in pathwaymodulatie ondersteunt. Deze aanpak vermindert de afhankelijkheid van invasieve zoogdiermodellen en versnelt het toetsen van hypothesen in de neuronale celbiologie en ziekterelateerde systemen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de dynamiek van mitochondriën en centrosomen in vivo te visualiseren.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets via directe observatie van het gedrag van organellen in neuronale contexten.
- Voorspellende waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targets door subcellular dynamics te koppelen aan cellulaire fenotypen in een gewervelde systeem.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatief beeldbare subcellulaire resultaten voor standaardisatie van assays.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbare preparatie van gelabelde embryo's mogelijk voor consistente imaging-workflows.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform voor meerdere organel-doelen door gebruik te maken van gedeelde genetische en imaging-infrastructuur.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt imaging van organellen in de ontdekkingsfase met preklinische validatie in ziekte-modellen zoals de ziekte van Alzheimer.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt de subcellulaire bijdragen aan celdysfunctie gerelateerd aan ziekten.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door dynamische organelresponsen op genetische of farmacologische perturbatie te onthullen.
Integratie van pijplijn & workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door subcellular resolution-gegevens te leveren die de fasen van target-validatie en lead-identificatie informeren, in het bijzonder binnen programma's gericht op neurowetenschappen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door directe visualisatie van organeldynamiek in levende neuronen.
- Screening: Levert assay-ready, gestandaardiseerde embryonale systemen met fluorescentielabelled organellen voor toepassingen in compound-screening.
- Analytica: Maakt kwantitatieve meting van mitochondriaal transport en centrosoompositionering mogelijk als functionele read-outs.
- Translationeel onderzoek: Zorgt voor continuïteit in preklinische studies door subcellular dynamiek te modelleren in ziekterelevante systemen van vertebraten.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imagingplatform dat via het Gal4-UAS-systeem aanpasbaar is voor meerdere organellen en celtypen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-validatie door mechanistische ambiguïteit in subcellulaire functies te verminderen.
- Operationele waarde: Standaardiseert protocollen voor embryo-preparatie en beeldvorming voor een reproduceerbare beoordeling van subcellulaire dynamiek.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van targets mogelijk te maken via niet-invasieve beeldvorming bij vertebraten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering door organelgedrag te koppelen aan fenotypische uitkomsten in ziektecontexten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de houderij van zebravissen, micro-injectie en het genereren van transgene lijnen.
- Afhankelijk van fluorescentiemicroscopiesystemen met geschikte objectieven en kamers voor omgevingscontrole.
- Maakt standaardisatie van embryo-stadiëring, anesthesie en montageprocedures tussen teams noodzakelijk.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende subcellulaire targets en celtype-specifieke promotoren.
- Omvat praktische beperkingen zoals fototoxiciteit en pigmentinterferentie, die worden beperkt door het gebruik van PTU en beeldvormingspraktijken met weinig licht.
