Name: Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer subcellulaire beeldvorming van centrosomen en mitochondriën in levende Danio rerio embryo's. Deze niet-invasieve techniek maakt in vivo studie van organdynamica mogelijk voor onderzoek naar fysiologische en ziekteprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

P.E. wordt ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 en de Graduate School van de Technische Universität München (TUM-GS). G.P. werd ondersteund door TUM-GS. L.T. wordt ondersteund door een EMBO-beurs (EMBO ALTF 108-2013). D.P.'s werk aan zebravissen werd ondersteund door de DFG via de Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); het Center for Integrated Protein Sciences (Munich) en het Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) van de Europese Gemeenschap onder subsidieovereenkomst nr. 200611 (MEMOSAD). Hij is momenteel een New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow en werd ondersteund door een beurs van de Duitse Academie van Wetenschappen Leopoldina. L.G. wordt ondersteund door financiering van de DFG via SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Project A11. 
We zijn dankbaar aan Kristina Wullimann voor het onderhouden van onze visfaciliteit, Yvonne Hufnagel voor technische ondersteuning en Thomas Misgeld voor opmerkingen over het manuscript. We zijn dankbaar aan R. Köster (Technische Universität Braunschweig) voor het verstrekken van de M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) waaruit we Centrin-YFP hebben gekloond en S.C. Suzuki en T. Yoshimatsu (University of Washington) voor het verstrekken van de 14xUAS:MA-cerulean cassette die we hebben gebruikt om het reporterconstruct te genereren om CentrinFish te maken. We danken ook S.C. Suzuki en T. Yoshimatsu (University of Washington) voor de Otx2:Gal4 transgene lijn, A. Sagasti voor de Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) en M. Nonet (Washington University in St. Louis) voor de pCold Heart Tol2 vector. We erkennen Bettina Schmid, Alexander Hruscha en Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich - DZNE) voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van MitoFish.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier tonen we de veelzijdigheid van het Gal4-UAS expressiesysteem om fluorescent label mitochondria, centrosomes en de cellulaire membranen van specifieke celtypen in vivo in zebravisembryo&#39;s. Veel fluorescerende fusie-eiwitten die andere organellen of subcellulaire structuren label kan worden gevonden in de gepubliceerde literatuur en kunnen worden verkregen bij het ​​desbetreffende laboratorium, commerciële bronnen of niet-commerciële plasmide depots (bijvoorbeeld Addgene). In nieuw fluorescent f...

In vivo beeldvorming verschaft directe visualisatie van cellulaire gedrag in de fysiologische context. De transparantie van de zebravis embryo&#39;s, hun snelle en externe ontwikkeling en een rijk scala aan genetische tools die tl-etikettering toe hebben bijgedragen aan het toenemende gebruik van in vivo microscopie om de dynamiek van de belangrijkste ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen op te helderen. Imaging studies van de ontwikkeling van het zenuwstelsel in de zebravis hebben bijvoorbeeld sterk uitgebreid onze kennis van het gedrag van neurale stamcellen en het lot van hun nageslacht met inbegrip van hun latere migratie, differentiatie en integratie circuit 1-8. Het podium is nu ingesteld om de subcellulaire dynamiek ten grondslag liggen aan deze cellulaire gedrag te onderzoeken. Sterker nog, de zebravis worden reeds benut als instrumenten voor in vivo celbiologie. Het is nu mogelijk om mitochondriën 9-11 visualiseren, centrosomes 2,8,12-14, Golgi 15, De microtubule 4 en 16 actine cytoskelet, endosomen 17 en onderdelen van de apicale membraan complex 1,18, onder andere subcellulaire structuren in de zebravis embryo&#39;s in vivo. Tot dusver veel wat bekend is over de functie van deze organellen komt van het bestuderen van hun gedrag in gekweekte cellen. Terwijl in vitro studies enorme inzicht in celbiologie hebben opgeleverd, hebben de cellen in de cultuur niet volledig vertegenwoordigen de complexiteit van de in vivo situatie en dus niet noodzakelijk overeen met de functie en de dynamiek van subcellulaire organellen in vivo. Zebravis embryo&#39;s bieden een levensvatbare in vivo alternatief voor de behandeling van subcellulaire dynamiek. Zoals vertebraten, zebravis bezitten vele orgaansystemen (bijvoorbeeld neurale retina) die homoloog zijn met die in zoogdiersoorten zijn. Bovendien zebravisembryo&#39;s worden in toenemende mate toegepast om menselijke ziekten 19,20 modelleren </sup&gt;, ook op het gebied centrosomal functie (bijvoorbeeld, microcefalie 21 en congenitale amaurosis 22 Leber&#39;s) en mitochondriale functie (bijvoorbeeld de ziekte van Parkinson 23, tauopathieën 10,24 en Barthsyndroom 25). In vivo beeldvorming op cellulair en subcellulair niveau in deze gevallen zal een beter begrip van de celbiologie ten grondslag liggen aan deze pathologische toestanden mogelijk te maken. De algemene doelstelling van de hier beschreven methoden is om een uitgebreide gids te verstrekken aan organellen en andere subcellulaire structuren in de zebravis embryo&#39;s met behulp van in vivo lichtmicroscoop te onderzoeken. Het volledige work-flow die betrokken zijn bij het ​​visualiseren en het bijhouden van subcellulaire structuren in vivo wordt beschreven - van genetische labeling benaderingen, tot het genereren van transient uitdrukken en stabiele transgene vis, en ten slotte naar de beeldvorming met behulp van wide-field en confocale microscopie. Hoewel elk van deze procedures wordt gebruikt door talrijke laboratoria zebravis, worden de beschreven protocollen geoptimaliseerd en gestroomlijnde onderzoeken van de dynamica van subcellulaire structuren. Twee bijzondere aspecten van het hier beschreven werk garandeert vermelding: Ten eerste, het gebruik van het Gal4-UAS expressiesysteem in meerdere configuraties genetisch label organellen in specifieke celtypen. Ten tweede, een directe vergelijking van wide-field en confocale microscopie om de afbeelding subcellulaire structuren in vivo. Huidige strategieën om genetisch label organellen en andere subcellulaire structuren in de zebravis ofwel gebruik maken van de afgetopte mRNA 1,4,8 of op basis van DNA-constructen, waar promotor elementen die rechtstreeks de expressie van fusie-eiwitten 9,14,15. In vitro getranscribeerd afgetopte RNA resultaten in te rijden snelle en brede expressie, die niet weefselspecifiek echter. Daarnaast expressie niveaus afnemen in de tijd als de afgetopte RNA wordt verdund of afgebroken. Waardoor het gebruik van RNA gebaseerdeconstrueert naar organel dynamiek in latere stadia van ontwikkeling is beperkt onderzocht (meestal tot 3 dagen na de bevruchting). Deze beperkingen kunnen worden overwonnen met behulp van DNA-constructen, waarin ruimtelijke en temporele controle van expressie wordt bepaald door promotor elementen. Wanneer DNA gebaseerde constructen worden gebruikt in het kader van het Gal4-UAS systeem aanzienlijk verbetert transgenexpressie gerespecteerd worden 26,27. In dit bipartiete expressiesysteem, celtype-specifieke promoter elementen drijven de expressie van een transcriptionele activator Gal4, terwijl reporter genen stroomafwaarts van het Gal4-bindende stroomopwaartse activerende sequentie (UAS) gekloneerd. Door het combineren van UAS verslaggevers met de juiste Gal4 drivers, kan expressie worden beperkt tot specifieke celtypen, het omzeilen van de noodzaak om de reporter genen te klonen achter verschillende promotors elke keer dat een specifieke uitdrukking patroon gewenst is. Bovendien kan de expressie van meerdere genen UAS reporteraangedreven door een enkele Gal4 activator. Het Gal4-UAS systeem verschaft aldus een veelzijdig en flexibel genetische benadering voor subcellulaire etikettering. Wide-field en confocale microscopen zijn de werkpaarden van de meeste laboratoria. Breedveldbeeld systemen gebruiken typisch een booglamp als lichtbron en het uitgezonden licht te detecteren met een gevoelige camera die is geplaatst aan het einde van de lichtweg. Dit beeldvormende modaliteit wordt meestal beperkt tot dunne monsters als out-of focus licht verduistert in-focus informatie in dikkere monsters. Confocale microscopen verschillen van wide-field systemen in dat ze zijn gebouwd om signalen die afkomstig zijn van de focal plane over degenen die afkomstig zijn uit focus (dat wil zeggen, &quot;optische sectie&quot;) 28 te bevorderen. Om optische sectie bereiken van een pinhole wordt in de emissie pad in een conjugaat staat de puntlichtbron. Lasers worden gebruikt als lichtbronnen en signalen worden gedetecteerd met fotomultiplicatorbuizen (PMT). Praktisch, een laserbundel wordt gehaald via sample point-by-point en de fluorescentie-emissie Bij iedere (pixel) wordt gedetecteerd door de PMT. Hier beeld dat we precies dezelfde subcellulaire structuren in levende zebravis embryo&#39;s met behulp van zowel wide-field en confocale microscopie om een ​​directe vergelijking van beide microscopie modaliteiten te bieden. Het achterliggende doel van het verstrekken van dergelijke vergelijkingen is om richtlijnen voor het kiezen van de meest geschikte microscopie techniek voor de specifieke vraag bij de hand te bieden. Met de hier beschreven tonen we aan Gal4 UAS-gebaseerde genetische kenmerken van mitochondria en centrosomes benaderingen. Deze organellen worden afgebeeld in verschillende celtypes van het zenuwstelsel en in spiercellen via wide-field en confocale microscopie om de geschiktheid van elke beeldvormende modaliteit tonen. De hier beschreven werkwijzen kunnen gemakkelijk worden aangepast voor het onderzoeken van andere organellen en subcellulaire structuren in levende zebravis embryo.

<table><tbody><tr><td>Agarose (2-hydroxyethylagarose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td><td>Low-gelling temperature Type VII</td></tr><tr><td>Block heater</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermomixer compact</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>202967-50g</td><td>To prepare 30x Danieau's</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Coated Dumont #5 Forceps</td><td>Dumont - Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td>#5 Forceps</td></tr><tr><td>Confocal laser-scanning microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Culture dish heater</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>DH-35</td><td>Heating ring</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt</td><td>PharmaQ</td><td>Tricaine PharmaQ-25g</td><td>Tricaine (anesthetic)</td></tr><tr><td>Fluorescence dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GeneClean kit</td><td>MP Biomedicals</td><td>111001200</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Culture Dishes</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td>35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass</td></tr><tr><td>Glass needles</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>For microinjections</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250g</td><td>To prepare 30x Danieau's</td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>DCC000001242 150g</td><td>Silicon dioxide grease</td></tr><tr><td>KCl 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7643-5kg</td><td>To prepare 30x Danieau's</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O &nbsp;&nbsp;Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230291-500g</td><td>To prepare 30x Danieau's</td></tr><tr><td>Microinjector&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0.5-20 ul</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder</td><td>Intracel</td><td>P/N 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>To transcribe PCS-Transposase</td></tr><tr><td>NaCl BioXtra >99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td><td>To prepare 30x Danieau's</td></tr><tr><td>Nanophotometer</td><td></td><td></td><td>To measure DNA/RNA concentration</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Flaming/Brown</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0.80W&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Water-dipping-cone objective</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98%</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>PTU (prevents pigmentation)</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>821472</td><td>92 x 16mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Plastic molds&nbsp;</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>For microinjections</td></tr><tr><td>Plexiglas cover-with a hole</td><td>Custom-made</td><td></td><td>The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective</td></tr><tr><td>Tea-strainer (Plastic)</td><td></td><td></td><td>To collect zebrafish eggs</td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td>Dual Automatic Temperature Controller</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>86.1171</td><td>3.5mL plastic transfer pipettes</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1.00W</td><td>Olympus</td><td></td><td>Water-dipping-cone objective</td></tr><tr><td>UMPlanFLN 20x/0.50W&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Water-dipping-cone objective</td></tr><tr><td>Widefield microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU (50x Stock)</td><td></td><td></td><td>Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water Stir vigorously at room temperature&nbsp; Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution</td></tr><tr><td>Tricaine (20x Stock)</td><td></td><td></td><td>Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water Add 2 ml 1M Tris base (pH9) Adjust to pH 7&nbsp; Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution</td></tr><tr><td>Danieau's Solution (30x Stock)</td><td></td><td></td><td>1,740 mM&nbsp; NaCl&nbsp; 21 mM&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; KCl&nbsp; 12 mM&nbsp; &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;MgSO4.7H2O&nbsp; 18 mM&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Ca (NO3)2 150 mM&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; HEPES buffer&nbsp; Distilled water upto 1 L&nbsp; Store at 4 oC&nbsp; Use at 0.3x working solution</td></tr></tbody></table>

beeldvorming subcellulaire structuren in het living zebravis embryo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo beeldvorming biedt ongekende toegang tot het dynamisch gedrag van cellulaire en subcellulaire structuren in hun natuurlijke context. Het uitvoeren van dergelijke beeldvormingsexperimenten bij hogere gewervelde dieren zoals zoogdieren vereist over het algemeen chirurgische toegang tot het onderzochte systeem. De optische toegankelijkheid van embryonale en larvale kievisjes maakt het mogelijk om dergelijke invasieve procedures te omzeilen en beeldvorming mogelijk te maken in het intacte organisme. Inderdaad is de kievis nu een goed gevestigd model om dynamisch cellulair gedrag te visualiseren met behulp van in vivo microscopie in een breed scala van ontwikkelingscontexten, van proliferatie tot migratie en differentiatie. Een recentere ontwikkeling is het toenemende gebruik van kievisjes om subcellulaire gebeurtenissen te bestuderen, inclusief mitochondriaal verkeer en centrosoomdynamiek. De relatieve gemak waarmee deze subcellulaire structuren genetisch kunnen worden gelabeld door fluorescerende eiwitten en het gebruik van lichtmicroscopietechnieken om ze af te beelden, transformeert de kievis in een in vivo model van celbiologie. Hier beschrijven we methoden om genetische constructen te genereren die organellen fluorescerend labelen, waarbij we mitochondriën en centrosomen als specifieke voorbeelden benadrukken. We gebruiken het bipartiete Gal4-UAS systeem in meerdere configuraties om de expressie te beperken tot specifieke celtypen en bieden protocollen om tijdelijk en stabiel transgene vissen te genereren. Ten slotte geven we richtlijnen voor het kiezen van lichtmicroscopiemethoden die het meest geschikt zijn voor het afbeelden van subcellulaire dynamica.

Hier is het gebruik van wide-field en confocale microscopie om de afbeelding mitochondria en centrosomes in levende zebravis embryo&#39;s is direct vergeleken en gecontrasteerd. Afhankelijk van de locatie van de cellen waarin organel dynamiek te onderzoeken en de eigenfrequentie van de specifieke subcellulaire gebeurtenissen, algemeen hetzij wide-field of confocale microscopie is de betere keuze. We afgebeeld organellen in RB neuronen op het oppervlak van het embryo en retinale cellen di...

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Het algemene doel van deze beeldgevingsmethode is om subcellulaire organellen in vivo bij een gewerveld dier te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neuronale celbiologie, zoals de dynamiek van mitochondria of centrosomen in een in-vivo context. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gehele experiment kan worden uitgevoerd in een intact gewerveld dier, zonder dat er een chirurgische ingreep nodig is.Deze methode kan niet alleen inzicht bieden in subcellulaire dynamiek onder fysiologische omstandigheden, maar kan ook worden toegepast op studies naar ziektemodellen, zoals de ziekte van Alzheimer. Nadat er transient-expresserende embryo's zijn gegenereerd door microinjectie, of embryo's zijn verkregen uit stabiele transgene lijnen volgens het tekstprotocol, dient men aan het einde van de eerste dag te screenen op dode of onbevruchte eitjes. Breng de levensvatbare embryo's met een plastic transferpipet over naar Danieau-oplossing met 1x PTU om pigmentvorming te voorkomen, en houd de embryo's in Danieau-oplossing met 1x PTU tot de screening op transgene expressie.Gebruik op de dag van het beeldvormingsexperiment een fluorescentie-dissectiemicroscoop om geanestheseerde embryo's te screenen op transgeenexpressie. Breng de geselecteerde embryo's vervolgens over naar een aparte petrischaal met Danieau-buffer met 1x PTU en 1x tricaine. Zodra de embryo's zijn geanestheseerd, worden er voorzichtig enkele embryo's met een pipet in de laagsmeltende agarose met 1x PTU en 1x tricaine geplaatst, waarbij zo min mogelijk vloeistof wordt overgebracht om verdunning van de agarose te voorkomen.Breng de embryo's met een kleine hoeveelheid agarose over naar een petrischaal met glazen bodem. Positioneer vervolgens, terwijl u relatief snel werkt, de embryo's met een pincet in de gewenste oriëntatie, afhankelijk van de structuur die moet worden afgebeeld. De embryo's moeten correct georiënteerd zijn, bijvoorbeeld plat op de zijkant voor het afbeelden van het netvlies of een Rohon-Beard-neuron.Een nauwkeurige oriëntatie garandeert de beste beeldkwaliteit en optimaliseert de acquisitiesnelheid. Nadat de agarose minstens 15 minuten heeft kunnen stollen, voegt u Danieau's buffer toe met 1x PTU en 1x tricaine om de embryo's te bedekken. Om wide-field microscopie uit te voeren, opent u de microscopesoftware nadat een schaal met gemonteerde vissen is geëquilibreerd in een verwarmingskamer bij 28.5 degrees Celsuis op de tafel van een wide-field microscoop en er een gebied van interesse is gekozen.Klik onder Verlichting op Configuratie-instellingen om de juiste filtersets voor de gewenste golflengte te definiëren. Voer onder Camera-instellingen de belichtingstijd in die nodig is om een geschikte afbeelding te verkrijgen. Kies vervolgens een waterdompelingsconusobjectief met een lange werkafstand en een vergroting van 40x tot 100x, dat de hoogste numerieke apertuur heeft en chromatisch gecorrigeerd is.Klik op Live om het gezichtsveld te kiezen. In het geval van een R-B neuron, beeldt u het mitochondriële transport af bij het axonale stammetje, uitgaande van het cellichaam of in de perifere arborisatie. Klik vervolgens in het ImageJ-menu op de knop voor rechthoekige selectie en definieer een regio van belang, of ROI.Klik vervolgens op ROI in het Micro-Manager-venster. Nadat de ROI voor beeldvorming is geselecteerd, klikt u op Stop and Save om de neuronale morfologie in het YFP-kanaal vast te leggen. Om mitochondriaal transport te beelden, klikt u op Multi-D Acquisition.Select vervolgens in het venster Multi-dimensional Acquisition het aantal tijdspunten en het interval tussen de tijdspunten. Klik in het venster Multi-dimensional Acquisition op Channels en voeg de golflengte voor beeldvorming en de belichtingstijd toe en definieer deze. Klik op Save images om de bestanden automatisch op te slaan in de specifieke map die in het directorypad is aangegeven.Klik nu op Acquire in de rechterbovenhoek om te beginnen met time-lapse imaging. Voor confocale microscopie: na het plaatsen van de gemonteerde embryo's in een verwarmingskamer op 28,5 °C op de confocale tafel, opent u de microscopiesoftware en klikt u op Trans Lamp of Epi Lamp. Gebruik vervolgens, via de oculairs van de microscopie, respectievelijk doorgelet licht of fluorescentielicht om het interessegebied te identificeren.Controleer in het instellingenvenster voor acquisitie of het voor beeldvorming gekozen objectief overeenkomt met het objectief dat in het vervolgkeuzemenu van de beschikbare objectieven verschijnt. Klik vervolgens in het venster voor de besturing van de beeldacquisitie op de knop voor de kleurstoffenlijst en selecteer de juiste fluoroforen. Klik alternatief op de knop Lichtpad en Kleurstoffen om de parameters handmatig in te stellen.Pas in het venster Acquisition Setting de zoomfactor en de beeldverhouding van het gescande beeld aan om de pixelgrootte te verkrijgen die nodig is om de afgebeelde structuren optimaal op te lossen. Stel de pixelgrootte in op ongeveer de helft van de theoretische resolutie van het objectief, om zo te voldoen aan de Nyquist-steekproefcriteria. Om de pixelgrootte van een verkregen beeld te bepalen, klikt u in het venster Image Acquisition Control op de I-knop.Stel vervolgens de scansnelheid in op de maximaal mogelijke snelheid. Klik daarna in het venster Image Acquisition Control op Kalman line averaging en stel dit in op een factor twee of drie om ruis te verminderen. Om een sequentiële scanmodus te selecteren voor het beelden van fluorforen met overlappende spectra, klikt u op Sequential and Line.Pas vervolgens het uitgangsvermogen van de relevante laserlijnen aan. Klik op XY Repeat of Focus x2 of Focus x4 om de geselecteerde regio continu te scannen terwijl de detectorinstellingen voor elk kanaal worden aangepast. Stel daarna de HV, Gain en Offset voor elk kanaal in om beelden te verkrijgen met het hoogste dynamische bereik van grijswaarden.Druk nu op Control plus H om de verkregen beelden te visualiseren via een opzoektabel die onderverzadigde pixels in het blauw en oververzadigde pixels in het rood identificeert; beide situaties moeten worden vermeden. Evalueer het uitgangsvermogen van de relevante laserlijnen en de detectorinstellingen opnieuw. Om de boven- en ondergrenzen van het te beelden volume te definiëren, klikt u in Acquisition Setting op de knop End Set bij de bovengrens, focus vervolgens naar de ondergrens en druk op Start Set.Om de Z-resolutie van het objectief te controleren, klikt u in Image Acquisition Control op het I-symbool. Selecteer vervolgens een stapgrootte die de helft is van de Z-resolutie voor het betreffende objectief. Voer in het subvenster TimeScan de frequentie in waaronder de Z-stacks moeten worden verkregen, en het aantal keren dat de beelden moeten worden verkregen, om een tijdserie in te stellen die geschikt is voor de dynamiek van de te beelden subcellulaire structuur.Klik op de knoppen Depth en Time om te bevestigen dat de Z-stack en de tijdserie zullen worden vastgelegd. Klik ten slotte op de knop XY Zt om te beginnen met het vastleggen van time-lapsebeelden. Klik na de beeldacquisitie in de software-interface op Series Done.Sla de afbeeldingen op in OIB-formaat om de beelden en de bijbehorende metadata vast te leggen. Deze figuur toont organellen en R-B-neuronen op het oppervlak van het embryo met behulp van breedveld- en confocale microscopie. Hier werd time-lapse-imaging op een breedveldmicroscoop gebruikt om de beweging van een individueel mitochondrion in de perifere arbor van een R-B-neuron te volgen.Confocale beeldvorming is aanzienlijk langzamer en kan leiden tot een onderschatting van de dynamiek van specifieke subcellulaire gebeurtenissen. Beelden van retinale cellen die zijn verkregen via wide-field microscopie lijden onder een slecht contrast, omdat fluorescentiesignalen uit een groot weefselvolume de details in het brandvlak maskeren. Hier verbetert de optische sectiecapaciteit van confocale microscopie het contrast merkbaar.De insets tonen details van een gebied van de binnenste nucleaire laag, met labeling van celmembranen en mitochondriën. Gestuurd door een specifieke Gau-4 driver van een sensorisch neuron, maakt de mozaïekexpressie uit de injecties van UAS-mito-CFP en UAS MAY-FP het mogelijk om individuele cellen over meerdere dagen te volgen, zoals te zien is bij dit R-B sensorisch neuron twee en drie dagen na bevruchting. Naast mitochondriën kunnen andere subcellulaire organellen, zoals centrosomen, fluorescent gelabeld worden.In dit voorbeeld zorgden twee UAS-cassettes op een enkel aaneengesloten construct voor de expressie van centrosoom-gericht YFP en membraan-gericht cerulean in retinale cellen. De insets tonen een cel in de M-fase. Deze volledige procedure vereist meerdere dagen, vanaf de paring, eierverzameling en injecties, tot uiteindelijk de beeldvorming drie of vier dagen na bevruchting.Het eigenlijke imaging-experiment op de microscoop kan enkele minuten tot een hele dag in beslag nemen. Na deze procedure kunnen andere organellen, zoals microtubuli of peroxisomen, worden gelabeld en afgebeeld om hun in-vivo dynamiek te begrijpen. Vergeet niet dat PTU carcinogeen is en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

imaging-subcellular-structures-in-the-living-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.

Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

Leer subcellulaire beeldvorming van centrosomen en mitochondriën in levende Danio rerio embryo's. Deze niet-invasieve techniek maakt in vivo studie van organdynamica mogelijk voor onderzoek naar fysiologische en ziekteprocessen.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Meer video's verkennen