Genexpressie infecteren Microben Met behulp van een digitale Bar-codering Platform

Het algemene doel van dit experiment is om de genexpressie van pathogenen in vivo nauwkeurig te meten, om zo inzicht te krijgen in hoe een pathogeen zich aanpast aan de infectieuze omgeving en schade toebrengt aan de gastheer. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van infectieziekten om de dynamiek van de genexpressie van pathogenen te onderzoeken tijdens een werkelijke infectie in verschillende weefseltypen en op meerdere tijdstippen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat deze zeer gevoelig en uitermate reproduceerbaar is.

Deze methode maakt het mogelijk om de genexpressie van pathogenen te kwantificeren uit kleine hoeveelheden weefsel van een infectie in de praktijk. Om de reagentia voor te bereiden, voegt u 2-Mercaptoethanol toe aan buffer RLT en mengt u dit goed. Bereid een mengsel van fenol-chloroform isoamylalcoholoplossing in een verhouding van 25:24:1.

Label de homogenisatiebuisjes van het M-type en koel deze op ijs. Label schroefdopbuisjes van twee milliliter en voeg aan elk buisje ongeveer 300 µL zirkonia-kraaltjes toe. Zet de volgende instrumenten klaar voor gebruik, waaronder een weefseldissociator, een bead beater, een tafelcentrifuge met adapters voor 50 mL buisjes en 96-well platen en een fotometer.

Haal eerder ingevroren nieren die zijn geïsoleerd uit met C.albicans-geïnfecteerde muizen uit een vriezer van 80 °C en plaats deze op ijs. Voeg 1,2 mL buffer RLT toe aan elke nier. Giet vervolgens elke nier samen met de buffer over in een homogenisatiebuis van het M-type.

De hoeveelheid gebruikte RLT-buffer wordt empirisch bepaald. Te veel RLT-buffer zal de monsterconcentratie verdunnen, terwijl te weinig buffer het homogenaat zeer viskeus maakt en extreem moeilijk hanteerbaar maakt. Homogeniseer vervolgens de nieren met een weefseldissociator op de vooraf ingestelde stand RNA 2.01.

Centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 1000 x G. Breng 600 µL van elk homogenaat over naar een schroefdopbuisje met zirkoniumkraaltjes en bewaar het resterende homogenaat op ijs. Voeg 600 µL fenol-chloroform-isoamylalcohol toe aan elk buisje, sluit de doppen stevig en vortex gedurende drie minuten bij 4 °C op de bead beater.

Centrifugeer 5 minuten bij 15.000 G bij vier graden celsius. Breng de waterige fase voorzichtig over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg een gelijk volume 70% ethanol toe. Laad dit vervolgens op de spincolumn en centrifugeer bij 8.000 x G. Was elke spincolumn één keer met 700 microliters buffer RW, gevolgd door twee wasbeurten met 500 microliters buffer RPE.

Overbreng de kolommen naar droge opvangbuisjes en centrifugeer nog een minuut om alle resterende vloeistof te verwijderen. Gebruik tot slot 50 µL water om het RNA te elueren. Gebruik vervolgens een spectrofotometer bij OD 216 nm om de RNA-concentratie te meten.

Om genexpressieprofilering uit te voeren met behulp van digitale bar-codering, begint u met het ontdooien van de reportercodeset en de capturecodeset op ijs. Voeg 130 µL hybridisatiebuffer toe aan de reportercodeset. Keer de buis om om te mengen en centrifugeer deze kort.

Voeg vervolgens 20 µL van het mengsel toe aan elk van de 12 reactiebuisjes. Voeg daarna 10 µg totaal weefsel-RNA toe aan elk buisje en meng dit door te pipetteren. Afhankelijk van het infectiemodel, de grootte van het inoculum en de gebruikte pathogene stam, varieert het percentage pathogeen-RNA binnen het totaal RNA van 0 tot 2%. Daarom moet de totale hoeveelheid RNA die per monster moet worden toegevoegd, empirisch worden geoptimaliseerd.

Voeg nu vijf µL capture code set toe aan elke buis. Meng door de buisjes om te keren en centrifugeer ze kort. Incubeer de reacties vervolgens in een thermocycler op 65 °C met een verwarmde klep gedurende ongeveer 18 uur.

Haal één monstercartridge uit 20 °C en laat deze opwarmen tot kamertemperatuur. Haal twee reagensplaten uit 4 °C en centrifugeer deze in een tafelcentrifuge bij 670 x G gedurende twee minuten. Stel vervolgens het preparatiestation in volgens de stapsgewijze instructies op het scherm, waarbij u de optie voor hoge gevoeligheid selecteert.

Verwijder vervolgens de reacties uit de thermocycler en plaats deze direct in het preparatiestation. Nadat het drie-urige programma voor hoge gevoeligheid is voltooid, verwijdert u de cartridge en verzegelt u de banen met transparante tape. Breng indien nodig minerale olie aan op de onderzijde van de cartridge.

Plaats vervolgens de cartridge in de digitale analyzer. Stel de digitale analyzer in volgens de stapsgewijze instructies op het scherm en selecteer de optie voor scanning met hoge resolutie. Download na het uitvoeren van het scanningprogramma de resultaten of kies ervoor om deze per e-mail te ontvangen, en importeer de ruwe data in de software van de fabrikant.

Analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol. Het protocol dat in deze video wordt gedemonstreerd, heeft het unieke voordeel dat het zowel een capture-probe als een report-probe gebruikt om de specificiteit te verhogen en de ruis van het gastheer-RNA te verminderen. Zoals hier wordt getoond, lagen de achtergrond raw counts van een niet-geïnfecteerd weefselmonster allemaal onder de 10, terwijl de raw counts van twee geïnfecteerde weefselmonsters allemaal boven de 10 lagen.

De ruwe tellingen van twee biologische monsters vertoonden een zeer goede correlatie met een R-kwadraatwaarde van 0,945. Het platform biedt tevens een voldoende dynamisch bereik om natuurlijke biologische expressieniveaus te omvatten. Met behulp van een probeset die 248 genen voor milieurespons specificeert, werden twee fasen van genexpressie van het pathogeen bepaald.

Een vroege genexpressie-respons bestaat uit genen met RNA-niveaus die significant verschillen tussen het inoculum en de monsters 12 uur na infectie. Er werd ook een late genexpressie-respons ontdekt, bestaande uit genen met RNA-niveaus die significant verschillen tussen het tijdstip van 12 uur en de monsters 48 uur na infectie. Deze resultaten geven aan dat de genexpressie van C.albicans dynamisch wordt gereguleerd tijdens een invasieve infectie van een zoogdiergastheer.

Deze methode is eenvoudig en snel. De volledige procedure, van weefselafname tot het presenteren van de gegevens, neemt minder dan 48 uur in beslag. De actieve tijd bedraagt ongeveer vier uur voor 12 monsters.

Hoewel deze methode is ontwikkeld om de genexpressie van pathogenen in vivo vast te leggen, kan dezelfde methode ook worden gebruikt om de genexpressie van de gastheer in kaart te brengen. Onderzoekers kunnen op deze manier gelijktijdig nuttige informatie verkrijgen van beide zijden van een infectie.