Genexpressie infecteren Microben Met behulp van een digitale Bar-codering Platform

Het algemene doel van dit experiment is om de expressie van ziekteverwekkergenen in vivo nauwkeurig te meten om meer licht te werpen op hoe een ziekteverwekker zich aanpast aan de besmettelijke omgeving en schade veroorzaakt aan zijn gastheer. Deze techniek heeft de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van infectieziekten om de expressiedynamiek van ziekteverwekkergenen te verkennen tijdens een echte infectie op verschillende weefselsoorten en op meerdere tijdstippen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat deze zeer gevoelig en uiterst reproduceerbaar is.

Deze methode maakt het haalbaar om de expressie van ziekteverwekkergenen te kwantificeren uit kleine hoeveelheden weefsels van een echte infectie. Om te beginnen met het voorbereiden van reagentia, voeg 2-Mercaptoethanol toe aan buffer RLT en meng goed. Bereid een 25:24:1 mengsel van fenol-chloroform isoamyl alcohol oplossing voor.

Label M-type homogenisatiebuizen en zet ze op ijs. Label twee milliliter schroefdopbuizen en voeg ongeveer 300 microliters zirkoniumoxidekralen toe aan elke buis. Zorg dat de volgende instrumenten klaar staan voor gebruik, inclusief een weefsel dissociator, een bead beater, een tafelcentrifuge met adapters voor 50 milliliter buizen en 96-well platen en een fotometer.

Haal eerder bevroren nieren geïsoleerd uit C.albicans-geïnfecteerde muizen uit een vriezer van 80 graden Celsius en zet ze op ijs. Voeg 1,2 milliliter buffer RLT toe aan elke nier. Giet vervolgens elke nier met buffer in een M-type homogenisatiebuis.

De hoeveelheid buffer RLT die wordt gebruikt, wordt empirisch bepaald. Te veel buffer RLT zal de steekproefconcentratie verdunnen, terwijl te weinig de homogenaat erg stroperig en uiterst moeilijk hanteerbaar maakt. Vervolgens homogeniseer de nieren met behulp van een weefsel dissociator op de voorgeladen instelling RNA 2.01.

Centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 1000 x G. Breng 600 microliter van elk homogenaat over naar een schroefdopbuis met zirkoniumoxidekralen en bewaar de resterende homogenaat op ijs. Voeg 600 microliter fenol-chloroform isoamyl alcohol toe aan elke buis, sluit de deksels goed en vortex gedurende drie minuten op vier graden Celsius.

Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 15.000 G en vier graden Celsius. Breng de waterige fase voorzichtig over naar een nieuwe 1,5 milliliter microfugebuis, voeg een gelijk volume van 70%ethanol toe. Laad vervolgens op de spinkolom en centrifugeer bij 8.000 x G. Was elke spinkolom eenmaal met 700 microliter buffer RW, gevolgd door twee wasbeurten met 500 microliter buffer RPE.

Breng de kolommen over naar droge opvangbuizen en centrifugeer nog een minuut om eventueel overgebleven vocht te verwijderen. Gebruik ten slotte 50 microliter water om het RNA te elueren. Gebruik vervolgens een spectrofotometer bij OD 216 nanometer om de RNA-concentratie te meten.

Om genexpressieprofilering uit te voeren met behulp van digitale barcodering, begin met het ontdooien van de reporter code set en de capture code set op ijs. Voeg 130 microliter hybridisatiebuffer toe aan de reporter code set. Draai om om te mengen en centrifugeer naar beneden.

Voeg vervolgens 20 microliter van het mengsel toe aan elk van de 12 reactiebuizen. Voeg vervolgens 10 microgram totaal weefsel-RNA toe aan elke buis en meng door te pipetteren. Afhankelijk van het infectiemodel, de inoculumgrootte en de gebruikte ziekteverwekkerstam, varieert het percentage ziekteverwekker-RNA binnen het totale RNA van 0 tot 2%. Daarom moet de totale hoeveelheid RNA die voor elk dient te worden toegevoegd empirisch worden geoptimaliseerd.

Voeg nu vijf microliter van de capture code set toe aan elke buis. Meng door de buizen om te draaien en snel naar beneden te centrifugeren. Incubeer vervolgens de reacties in een thermische cycler bij 65 graden Celsius met een verwarmd deksel gedurende ongeveer 18 uur.

Verwijder een steekproefcartridge uit 20 graden Celsius en laat deze opwarmen tot kamertemperatuur. Verwijder twee reagentiaplaten uit vier graden Celsius en centrifugeer in een tafelcentrifuge bij 670 x G gedurende twee minuten. Stel vervolgens de voorbereidstation in volgens de stapsgewijze instructies op het scherm, selecteer de optie voor hoge gevoeligheid.

Verwijder vervolgens de reacties uit de thermische cycler en laad ze onmiddellijk op de voorbereidstation. Nadat het programma voor hoge gevoeligheid van drie uur is uitgevoerd, verwijder de cartridge en gebruik helder tape om de lanen af te sluiten. Breng eventueel mineraalolie aan op de bodem van de cartridge.

Laad vervolgens de cartridge op de digitale analyzer. Stel de digitale analyzer in volgens de stapsgewijze instructies op het scherm, selecteer de optie voor hoge resolutie scan. Nadat het scanprogramma is uitgevoerd, download de resultaten of kies om ze per e-mail te ontvangen en importeer de ruwe gegevens in de software van de fabrikant.

Analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol. Het protocol dat in deze video wordt gedemonstreerd, heeft het unieke voordeel dat het zowel een capture sonde als een report sonde gebruikt om de specificiteit te verhogen en het lawaai van het gastheer-RNA te verminderen. Zoals hier getoond, waren achtergrond ruwe tellingen van een niet-geïnfecteerd weefselmonster allemaal onder de 10, terwijl de ruwe tellingen van twee geïnfecteerde weefselmonsters allemaal boven de 10 lagen.

Ruwe tellingen van twee biologische monsters hadden een zeer goede correlatie met een R-kwadraat waarde van 0,945. Het platform biedt ook voldoende dynamisch bereik om natuurlijke biologische expressieniveaus te omvatten. Met behulp van een probe set die 248 omgevingsreactiegenen specificeert, werden twee fasen van ziekteverwekker genexpressie bepaald.

Een vroege genexpressierespons omvat genen met RNA-niveaus die significant verschillen tussen de inoculum en 12 uur na infectie monsters. Er werd ook een late genexpressierespons ontdekt die genen omvat met RNA-niveaus die significant verschillen tussen de