Voorbereiding van de thermoresponsieve nanogestructureerde oppervlakken voor Tissue Engineering

Het algemene doel van deze Langmuir-Schaefer-methode met blokcopolymeren is het fabriceren van celvellen onder verschillende condities van het temperatuurgevoelige oppervlak, door de sterkte van de celadhesie en aanhechtingen te beheersen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de biomaterialen, zoals biocompatibele materialen, celkweekoppervlakken en bioseparatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de interactie tussen het temperatuurgevoelige oppervlak en de cellen kan worden beheerst, en de modificerende condities voor het terugwinnen van de celvellen kunnen worden geoptimaliseerd.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de interactie tussen cel en oppervlak, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals bioseparatie en biofilm. Los eerst styreen, ECT en ACVA op in 40 milliliters 1,4-dioxaan. Vries de oplossing 15 tot 20 minuten onder vacuüm in vloeibare stikstof om de reactieve species te verwijderen.

Na het geleidelijk ontdooien van de oplossing bij kamertemperatuur wordt deze cyclus van invriezen, pompen, ontdooien en ontgassen drie keer herhaald. Verkrijg het polystyreen als macro-RAFT-agens door polymerisatie gedurende 15 uur bij 70 °C in een oliebad. Precipiteer het polystyreen macro-RAFT-agens met 800 ml ether en droog in vacuo.

Los vervolgens de IPAAm-monomeer, het polystyreen macro-RAFT-agens en ACVA op in vier milliliter 1, 4-Dioxaan. Verwijder de zuurstof in de oplossing met behulp van bevries-pomp-dooi-ontgassingscycli zoals eerder beschreven. Voer na het ontgassen een polymerisatie uit bij 70 °C gedurende 15 uur in een oliebad.

Verkrijg tot slot het gesynthetiseerde St-IPAAm-molecuul op dezelfde manier als het polystyreen macro-RAFT-agens. Was de glazen substraten met een overmaat aan aceton en ethanol, en sonicize gedurende vijf minuten om oppervlakteverontreinigingen te verwijderen. Droog de substraten in een oven bij 65 °C gedurende 30 minuten.

Gebruik vervolgens zuurstofplasma om de oppervlakken van de substraten bij kamertemperatuur te activeren. Dompel de substraten een nacht lang bij kamertemperatuur onder in tolueen met 1% hexatrimethoxysilaan om het substraat te sylaniseren. Was de gesylaniseerde substraten daarna in tolueen en dompel ze 30 minuten lang onder in aceton om de niet-gereageerde stoffen te verwijderen.

Anneal de substraten gedurende twee uur bij 110 °C om het oppervlak volledig te immobiliseren. Snijd vervolgens de gesylaniseerde substraten met een glasnijper op 25 millimeter bij 24 millimeter, zodat ze in de celkweekschalen passen. Plaats het Langmuir-filmapparaat in een kast om stofophoping te voorkomen.

Was de Langmuir-trog en de barrières met gedestilleerd water en ethanol om verontreinigingen te verwijderen. Droog de trog en de barrières door ze af te vegen met een pluisvrije doek. Vul de trog vervolgens met ongeveer 110 milliliters gedestilleerd water en plaats de barrières aan beide zijden van de trog.

Verhit vervolgens een platinumaan Wilhelmy-plaat voor het monitoren van de oppervlaktespanning met een gasbrander totdat de plaat roodgloeiend wordt. Was de plaat daarna met gedestilleerd water om verontreinigingen te verwijderen. Hang de Wilhelmy-plaat aan een draad die is bevestigd aan het instrument voor de meting van de oppervlaktedruk.

Stel het instrument voor de meting van de oppervlaktedruk in op nul volgens het protocol van de fabrikant. Comprimeer de lucht-waterinterface op het trogje met de barrières aan beide zijden van het trogje totdat de interface ongeveer 50 square centimeters bereikt zonder polymeerdruppels. Aspireer eventuele kleine verontreinigingen totdat de oppervlaktedruk bijna nul millinewtons per meter is.

Plaats de barrières aan beide zijden opnieuw en voeg gedestilleerd water toe om het verlies aan gedestilleerd water te compenseren. Los vervolgens vijf milligram van het gesynthetiseerde St-IPAAm-molecuul op in vijf milliliter van een ontwikkelingsoplossing van chloroform. Druppel daarna voorzichtig 27 µL van het in chloroform opgeloste St-IPAAm op het reservoir met behulp van een microspuit of micropipet.

Wacht vijf minuten om volledige verdamping van chloroform mogelijk te maken en verschuif vervolgens beide barrières horizontaal om het St-IPAAm-molecuul aan het oppervlak samen te persen. Handhaaf een compressiesnelheid van de barrières van 0,5 millimeter per seconde totdat het doeloppervlak van 50 vierkante centimeter is bereikt. Meet tijdens de compressie de oppervlaktespanning Pi-A isothermen met de platina Wilhelmy-plaat die is bevestigd aan het instrument voor de meting van de oppervlaktespanning, volgens het protocol van de fabrikant.

Nadat de doelgrootte van het oppervlak is bereikt, wordt het oppervlak gedurende vijf minuten in stand gehouden om de St-IPAAm-moleculen te laten relaxeren. De moleculen bereiken niet onmiddellijk het evenwicht na compressie. Vervolgens wordt de Langmuir-film gedurende vijf minuten met een transferapparaat overgebracht naar een hydrofoob gemodificeerd glazen substraat om de film robuust te absorberen.

Fixeer het hydrofobe glassubstraat parallel op het apparaat. Verbind het apparaat met een uitlijningspodia en beweeg loodrecht. Til het substraat horizontaal op met het transfersysteem en droog het gedurende één dag in een desiccator.

Om celsuspensies te bereiden, worden endotheliale cellen van de bovine halsslagader, of BAECs, gekweekt tot 1/3 confluentie bij 37 °C in 5% CO2 en 95% lucht, op weefselkweekpolystyreen met DMEM, bevattend FBS en penicilline. Zodra de confluentie is bereikt, worden de BAECs gedurende drie minuten behandeld met drie milliliter 0,25% trypsin EDTA bij 37 °C in 5% CO2 en 95% lucht. Deactiveer de trypsin EDTA door 10 milliliter DMEM met 10% FBS toe te voegen.

Verzamel de celsuspensie in een conische buis van 50 milliliter. Na centrifugeren bij 120 ×g gedurende vijf minuten wordt het supernatant afgezogen en worden de cellen geresuspendeerd in 10 milliliter DMEM. Zaai de teruggewonnen cellen op de St-IPAAm-oppervlakken uit bij een concentratie van 10.000 cellen per vierkante centimeter, geteld met een wegwerphemocytometer.

Observeer de cellen op de oppervlakken met een microscoop die is uitgerust met een incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 95% lucht. Steriliseer vervolgens de St-IPAAm-oppervlakken met ultraviolet licht dat is bevestigd aan een cleanbench. Leg timelapse-beelden vast van adherente BAECs gedurende ongeveer 24,5 uur bij 37 °C met een fasecontrastmicroscoop bij 10x vergroting.

Na adhesie van de BAEC's wordt de loslating van de BAEC's van het St-IPAAm-oppervlak geregistreerd bij 20 °C gedurende ongeveer 3,5 uur. Na optimalisatie van de celadhesie en -loslating op het oppervlak waarnaar de Langmuir-film is overgedragen, worden de celvellen vervaardigd door eerst BAEC's te kweken zoals hierboven beschreven. Zaai in totaal 100.000 cellen per vierkante centimeter op St-IPAAm-oppervlakken.

En incubeer gedurende drie dagen bij 37 °C in 5% CO2. Confluente BAECs detacheerden spontaan bij 20 °C. De bereiding van een oppervlak met een overgedragen temperatuurgevoelige Langmuir-film wordt hier getoond.

De gesynthetiseerde St-IPAAm chloroformoplossing werd voorzichtig gedruppeld op een lucht-waterinterface. Er werden twee barrières gebruikt om de St-IPAAm-moleculen op de interface samen te persen tot een doeloppervlak van 50 vierkante centimeter was bereikt. De oppervlaktedruk werd tijdens de compressie gemeten om eventuele defecten in de Langmuir-film te detecteren.

Na compressie werd een hydrofoob gemodificeerd dekglas-substraat horizontaal op de interface geplaatst met behulp van een uitlijningsplatform. Het substraat werd horizontaal opgetild en gedurende één dag gedroogd. Na deze stap waren de St-IPAAm-oppervlakken klaar voor gebruik in celcultuurexperimenten.

Hier worden representatieve resultaten getoond van topografische beelden van St-IPAAm-oppervlakken verkregen via atoomkrachtmicroscopie. Nanostructuren werden waargenomen op beide St-IPAAm-oppervlakken. De grootte en vorm van de nanostructuren waren sterk afhankelijk van AM en de samenstelling van St-IPAAm.

Hier wordt een macroscopisch beeld getoond van een teruggewonnen cellaag op een oppervlak dat is overgedragen via een Langmuir-film met St-IPAAm 480 en een AM van 40 vierkante nanometer per molecuul. Cellen bereikten confluentie na drie dagen kweek op St-IPAAm 170 en St-IPAAm 480 oppervlakken bij 37 °C. De cellaag werd snel teruggewonnen na het verlagen van de temperatuur van 37 naar 20 °C.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe u de moleculaire samenstelling van polymeren ontwerpt, hoe u Langmuir-films vervaardigt en overdraagt, hoe u celadhesie en -detachement beheerst en hoe u cellagen terugwint. Na de ontwikkeling van deze techniek opent deze de weg voor onderzoekers in het veld van biomaterialen en weefseltechnologie om interacties tussen cellen en oppervlakken en celkweekstrategieën voor gebruik in de degeneratieve geneeskunde te onderzoeken. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot celtransplantatietherapie, omdat deze techniek het potentieel heeft om cellagen van diverse celtypen te vervaardigen, afkomstig van patiënten.