Een Fast Air-droge Dropping Chromosome Bereidingswijze Geschikt voor vissen in planten

Het algemene doel van deze methode is om plantenchromosomen voor te bereiden die geschikt zijn voor de fluoresceine in C twee hybridisatietechniek met behulp van enkele en hoge kopie DNA-sondes. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de cytogenetica en genoomonderzoek, zoals detectie van chromosoomherschikkingen, ordening van genetische markers op chromosomen en vergelijkende analyse tussen verschillende soorten. Het grote voordeel van deze procedure is dat de voorbereiding van chromosoomuitstrijkjes snel, eenvoudig en efficiënt wordt.

Celsuspensie kan tot twee maanden op min 20 graden worden bewaard en indien nodig worden gebruikt voor chromosoomvoorbereiding. We hadden dit idee voor deze methode voor het eerst toen we waarnamen dat de kwaliteit en het aantal geschikte chromosomen dramatisch toenemen bij menselijke dagen Kiemp 10 tot 20 gerstzaden op twee lagen vochtige filterpapier in een petrischaal onder donkere omstandigheden gedurende twee dagen bij 22 tot 24 graden Celsius na twee dagen. Snijd krachtige wortels met lengtes van één tot twee centimeter van het zaad af met behulp van een scheermesje.

Bereid vervolgens ijswater voor door een glazen fles van 500 milliliter met koud kraanwater in gemalen ijswater te plaatsen. Beluch de ijswater en dompel de wortelpunten 20 uur onder om de frequentie van metafasecellen te verhogen. Breng de wortels over van water naar 50 milliliter ethanol azijnzuur fixatief om ze bij kamertemperatuur gedurende twee dagen te fixeren na fixatie.

Was 10 tot 20 wortels met 30 milliliter ijswater in een glazen speaker van 50 milliliter gedurende vijf minuten twee keer. Breng de wortels één voor één over in 30 milliliter citraatbuffer met behulp van een pincet. Was de wortels door de glazen speaker twee keer gedurende vijf minuten te schudden.

Plaats vervolgens de wortels op filterpapier om de vloeistof volledig te verwijderen onder een microscoop. Snijd het ongewenste niet-meristematische weefsel af met een scheermesje. De meest kritische stap van deze procedure is het bepalen van de juiste verteringstijd die kan variëren tussen verschillende soorten.

Hier worden tot 20 wortelpunten gedurende ongeveer 50 minuten in één milliliter enzymmengsel bij 37 graden Celsius geïncubeerd. Om het plantenweefsel in een horlogeglas onder een microscoop te verzachten, verwijdert u het enzym door te pipetten en was de wortelpunten op ijs met vijf milliliter 0,01 molair citraatbuffer om het resterende enzym te vervangen. Blijf de wortelpunten met één milliliter 96%ethanol twee keer voorzichtig in hetzelfde horlogeglas wassen.

Vervolgens vervangt u het ethanol door 10 tot 15 microliters vers bereid fixatief per wortelpunt. Breng de wortelpunten samen met het fixatief over in een tweedubbele buis en breek de wortelmarstengels met een dissectieneedel of pincet. Tik 20 keer op de buis om de cellen te resuspenderen en een celsuspensie te verkrijgen.

Plaats vervolgens twee tot drie lagen met water doordrenkt tissuepapier op een hotplate op 50 graden Celsius. Dompel de microscopische dia's in ijs, koud kraanwater in de koelkast gedurende 30 minuten. Plaats vervolgens de dia's op de vochtige tissuepapier, pipet zeven tot 10 microliters celsuspensie en laat deze vanaf een afstand van 20 centimeter vallen op de gekoelde dia die op de hotplate ligt.

Volg dit met 10 microliters van het azijnzuur ethanol mengsel op dezelfde plaats als de celsuspensie op de dia en houd de dia op de hotplate. Plaats na twee minuten de dia op de hotplate zonder het natte tissue en laat deze nog een minuut drogen. Controleer de dia's met behulp van een gezichtscontrastmicroscoop om de kwaliteit van de chromosoomuitbreiding te controleren.

Gebruik de dia's op dezelfde dag of bewaar ze door ze onder te dompelen in 96%Ethanol in een coplinpot bij min 20 graden Celsius om de dia's vooraf te behandelen voor vissen. Plaats de dia's in een coplinpot met 50 milliliter twee XSSC gedurende vijf minuten met behulp van een pincet. Breng de dia's over naar een coplanpot met 50 milliliter 45%azijnzuur gedurende drie tot 10 minuten.

Breng vervolgens de dia's over naar een coplanpot met 50 milliliter twee XSSC gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de dia's over naar een coplinpot met 50 milliliter 4%formaldehyt en dompel de dia's gedurende 10 minuten onder om de chromosomen te fixeren. Verwijder het formaldehyde door de dia's drie keer vier minuten te spoelen in een coplinpot met 50 milliliter twee XSSC.

Dehydrateer vervolgens de dia's gedurende twee minuten in een reeks 70%90%en 100%ethanol en droog de dia's in verticale positie. Bereid voor elke dia een hybridisatieoplossing van 20 microliters met behulp van 10 microliters gedeïoniseerd formamid vijf microliters vier X hybridisatiebuffer, drie microliters van de sonde en twee microliters D ns vrije water. Voeg 20 microliters hybridisatieoplossing per dia toe en bedek met een dekglas van 24 bij 32 millimeter.

Na het verzegelen van het dekglas met rubbercement, denatureer dia's met sondes gelijktijdig gedurende twee minuten op een hotplate bij 80 graden Celsius, breng de dia's over naar een vochtige kamer en incubeer ze gedurende één nacht bij 37 graden Celsius. Vermijd licht, verwijder de dekglazen door de dia's te spoelen in een koppelpot met twee XSSC. Plaats vervolgens de dia's in een coplanpot met 55 tot 60 graden Celsius, twee XSSC en incubeer ze gedurende 20 minuten.

Plaats vervolgens de dia's in twee XSSC in een coplanpot gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Dehydrateer de dia's in een coplanpot gedurende twee minuten in een reeks 70%90%en 100%ethanol. Droog de dia's en tegensteek met dappy in Antifa montagemedium, vermijd intens licht.

Analyseer de dia's met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. De selectie van de filter hangt af van de