Name: Een Fast Air-droge Dropping Chromosome Bereidingswijze Geschikt voor vissen in planten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Leer een snelle luchtdroog druppelmethode voor het prepareren van plantenchromosomen voor FISH-analyse. Deze techniek verbetert de kwaliteit en efficiëntie van cytogenetisch onderzoek met gerst als modelorganisme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de DFG hartelijk voor de financiële ondersteuning (HO 1779/21-1), evenals Katrin Kumke en Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) voor technisch advies.

1. Chromosome Voorbereiding <ol><li> Zaadontkieming en fixatie van wortelpunten <ol><li> 10-20 zaden ontkiemen gerst twee lagen vochtig filtreerpapier in een petrischaal onder donkere omstandigheden gedurende 2 dagen bij 22-24 ° C. Snijd krachtige wortels met een lengte van 1-2 cm uit het zaad door gebruik van een scheermesje. </li><li> Bereid ijskoud water door het plaatsen van een 500 ml glazen fles met koud leidingwater in gemalen ijs-water. Beluchten het ijskoude water en dompel wortel tips voor 20 uur om de frequentie van de metafasecellen verhogen. </li><li> Transfer wortels water tot 50 ml ethanol: azijnzuur (3: 1) fixeermiddel ze op te lossen bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen. WINKEL wortels in een vers bereide ethanol: azijnzuur (3: 1) fixatief bij 4 ° C tot gebruik tot een jaar. </li></ol></li><li> Wassen en enzymbehandeling <ol><li> Was de 10-20 wortels met 30 ml ijskoud kraanwater gedurende 5 minuten tweemaal met een 50 ml glazen beker. Gebruik binoculair microscoop. Overdracht roots een voor een in30 ml 0,01 M citraatbuffer (0,01 M citroenzuur + 0,01 M natriumcitraat, pH 4,8) met behulp van een tang en was door schudden bekerglas gedurende 5 min tweemaal. Plaats wortels op filterpapier om de vloeistof volledig te verwijderen en cut-off ongewenste niet-meristeemweefsel met een scheermesje. </li><li> Incubeer maximaal 20 wortelpunten in 1 ml enzymmengsel bij 37 ° C gedurende 50 min naar het plantenweefsel te verzachten (tabel 1) in een horlogeglas. Enzymmengsel bevat 0,7% cellulase R10, 0,7% cellulase, 1% en 1% Pectolyase cytohelicase verdund in 0,01 M citraatbuffer. Bewaar het enzymmengsel bij -20 ° C en opnieuw maximaal vijf keer. </li><li> Verwijder het enzym door pipetteren en was de wortel tips op ijs met 5 ml 0,01 M citraatbuffer twee keer om de resterende enzym te vervangen. </li></ol></li><li> Root maceratie <ol><li> Was wortelpunten met 1 ml 96% ethanol tweemaal zorgvuldig in dezelfde horlogeglas. Vervang ethanol met vers bereide fixatief (75% azijnzuur 25% ethanol). Gebruik 10-15ul fixatief per wortel tip. </li><li> Transfer wortelpunten samen met het fixeermiddel in een 2 ml buisje en desintegreren wortel meristemen met een dissectie naald of pincet. Tik de buis 20 tijden resuspendeer cellen om een ​​celsuspensie te verkrijgen. Bewaar de celsuspensie bij -20 ° C tot twee maanden. </li></ol></li><li> Het laten vallen van de celsuspensie <ol><li> Plaats 2-3 lagen water doordrenkte papieren tissue op een hete plaat bij 50 ° C. Dompel microscopische preparaten in ijskoud water uit de kraan in de koelkast gedurende 30 minuten. En plaats glijdt bovenop de vochtige papieren tissue. </li><li> Pipet 7-10 ul van celsuspensie en zet het op een afstand van 20 cm op de gekoelde dia geplaatst op de hete plaat. Pipetteer 10 gl azijnzuur-ethanol mengsel op dezelfde plaats als celsuspensie op de dia en houd de schuif op de hete plaat gedurende nog 2 min. Plaats de dia op de hete plaat zonder het natte doekje en laat het drogen gedurende 1 minuut. </li></ol></li><li> Kwaliteitscontrole en opbergdoose glijbanen <ol><li> Controleer slides met een fasecontrastmicroscoop de kwaliteit van het chromosoom spread besturen. Gebruik slides hetzij dezelfde dag of op te slaan door onderdompeling in 96% ethanol in een Coplin jar bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Voorbehandeling van dia&#39;s voor vis; alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur uitgevoerd <ol><li> Plaats de glaasjes in een Coplin pot met 50 ml 2x SSC (20x SSC bevat 3 M NaCl en 300 mM trinatriumcitraat) gedurende 5 min. Met behulp van een tang, overdracht van dia&#39;s een Coplin pot met 50 ml 45% azijnzuur voor 3-10 min. </li><li> Transfer schuift een Coplin pot met 50 ml 2 x SSC gedurende 10 minuten. Overdracht dia&#39;s een Coplin pot met 50 ml van 4% formaldehyde (in 2x SSC) en dompel dia&#39;s voor 10 min om chromosomen te lossen. </li><li> Verwijder formaldehyde door spoelen van de glaasjes 3 keer gedurende 4 minuten elk, in een Coplin pot met 50 ml 2 x SSC. Uitdrogen objectglaasjes in een Coplin jar gedurende 2 min in series van 70%, 90% en 100% ethanol, respectievelijk droge schuift verticaalpositie. </li></ol></li></ol> 2. Fluorescent in situ hybridisatie (FISH) <ol><li> Voor elk objectglaasje, stelt een hybridisatie-oplossing van 20 ul in totaal via 10 pl gedeioniseerd formamide, 5 ui 4x hybridisatiebuffer (200 pl buffer bevat 80 pl 20x SSC, 8 pi 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 ui 0,5 M EDTA, 11,2 gl 10 ug / ul zalmsperma en 99,2 ul DNase-vrij water), 3 pl van de probe en 2 gl DNase-vrij water. </li><li> Voeg 20 ul van hybridisatie-oplossing per glijbaan en deksel met een 24 x 32 mm dekglas en arresteren de cover slip met rubber cement. Denatureren slides met probes gelijktijdig bij 80 ° C gedurende 2 minuten op een hete plaat. </li><li> Transfer schuift een vochtige kamer en incubeer glijbanen bij 37 ° CO / N vermijden licht. Verwijder dekglaasjes door het spoelen van de dia&#39;s in een Coplin pot met 2x SSC. Plaats de glaasjes in een Coplin pot met 55-60 ° C 2x SSC en incubeer gedurende 20 min. </li><li> Plaats de dia&#39;s 2x SSC in een Coplin jar gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Uitdrogen objectglaasjes in een Coplin jar gedurende 2 min in series van 70%, 90% en 100% ethanol, respectievelijk. </li><li> Lucht drogen de dia&#39;s en tegenkleuring met 1 ug / ml 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) in antifade montage medium, vermijd intens licht. </li></ol> 3. Microscopische Analyse en opslag <ol><li> Analyseer de dia&#39;s met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. De keuze van de filter afhankelijk van de fluorochroom voor probe labeling. Eventueel slides opslag bij 4 ° C onder donkere omstandigheden tot een jaar. </li></ol>

<ol><li>Geber, G., Schweizer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+heterochromatin+differentiation+in+Sinapis+alba+%28Cruciferae%29+using+a+simple+air-drying+technique+for+producing+chromosome+spreads%5BTitle%5D)+AND+%22Pl+Syst+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads.</a> Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).</li>
<li>Andras, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drop-spreading+technique+to+produce+cytoplasm-free+mitotic+preparations+from+plants+with+small+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes.</a> Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).</li>
<li>Rothfels, K. H., Siminovitch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+air-drying+technique+for+flattening+chromosomes+in+mammalian+cells+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro.</a> Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).</li>
<li>Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+preparation+of+plant+chromosomes+for+high-resolution+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy.</a> Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).</li>
<li>Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+fluorescence+in+situ+hybridization+signal+detection+in+maize+using+directly+labeled+probes+produced+by+high+concentration+DNA+polymerase+nick+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation.</a> Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).</li>
<li>Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+%27SteamDrop%27+method+for+high+quality+plant+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation.</a> Mol. Cytogenet. 7, 21(2014).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synteny+between+Brachypodium+distachyon+and+Hordeum+vulgare+as+revealed+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH.</a> Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).</li>
<li>Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+painting+using+repetitive+DNA+sequences+as+probes+for+somatic+chromosome+identification+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).</li>
<li>Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+cell+synchronization+in+plant-roots+by+hydroxyurea+and+amiprophos-methyl+or+colchicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine.</a> Genome. 36 (2), 387-390 (1993).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+karyotyping+of+sorghum+by+in+situ+hybridization+of+landed+BACs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs.</a> Genome. 45 (2), 402-412 (2002).</li>
<li>Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+physical+mapping+with+barley+BAC+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FISH physical mapping with barley BAC clones.</a> Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).</li>
<li>Aliyeva-Schnorr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+mapping+with+centromeric+BAC+contigs+shows+that+this+recombination-poor+region+comprises+more+than+half+of+barley+chromosome+3H%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H.</a> Plant J. 84, 385-394 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het chromosoom voorbereiding experiment is uitgevoerd met behulp van de jonge wortels van granen behoren tot het gras familie (Poaceae). Alle geanalyseerde soorten hebben 14 relatief lange mitotische metafasechromosomen (11-15 pm) in het diploïde genoom set en behoren tot grote genoom-soorten (5,1-7,9 GBP). Lengte van ontkiemde wortels niet meer dan 2 cm tot maximaal meristeem weefsel te verkrijgen. Synchronisatie van delende cellen werd bereikt door een 20 uur lange ijswater behandeling die...

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een doeltreffend instrument voor de fysieke kaart brengen van enkele en hoog kopie sequenties op het chromosomaal niveau. Voorwaarde is de bereiding van hoge kwaliteit chromosoom spreads. Er is geen algemene chromosoom voorbereiding protocol dat even geschikt voor dier- en plantencellen zou zijn. Bereiding van plantaardige chromosomen is bijzonder uitdagend te wijten aan de starre celwand en diverse cytoplasma consistentie binnen verschillende soorten. Eén van de gunstige werkwijzen voor de bereiding van plantaardige chromosomen is een zogenaamd druppel techniek ook wel drop strooitechniek en air-droogtechniek 1,2. Deze werkwijze werd eerst geïntroduceerd in 1958 door rothfels en Siminovitch in vitro gekweekt zoogdiercellen 3. Later Martin et al. 4 en Kato et al. 5 aangepaste methode voor planten. Recenter een werkwijze genaamd &quot;SteamDrop &amp;# 39; ontwikkeld dat waterdamp voor de bereiding van niet-overlappende chromosomen 6. Hoewel de positieve invloed van een hoge luchtvochtigheid was eerder 7 waargenomen, &#39;SteamDrop&#39; levert een gecontroleerde workflow van hoogwaardige chromosoom voorbereiding 6. De stoombehandeling veroorzaakt rekken chromosomen waarschijnlijk verbonden met een aantal wijzigingen van chromosomale eiwitten. De kwaliteit van de verkregen metafase smeersels is zeer hoog, hoewel behoud van voldoende totale metafase spreads volgende FISH experimenten vereist technische expertise. Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding van de mitotische granen chromosomen die geschikt zijn voor de FISH detectie van enkele en hoog kopie sondes 5,8. Deze werkwijze is een verbeterde variant van de luchtdroge dropping beschreven door Kato 9 uitgevoerd onder relatieve vochtigheid van 50% -55% (figuur 1). Dit protocol omvat een gereduceerd aantalvan wasstappen maken van de toepassing ervan eenvoudig, efficiënt en reproduceerbaar. Met behulp van dit protocol verkregen wij hoogwaardige chromosoom spreads en FISH resultaten voor Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum en Secale cereale.

<table><tbody><tr><td>Hot Plate</td><td>MEDAX GmbH</td><td>12603</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase R10</td><td>Duchefa</td><td>C8001</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase&nbsp;</td><td>CalBioChem</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase</td><td>Sigma</td><td>P3026</td><td></td></tr><tr><td>Cytohelicase</td><td>Sigma</td><td>C8274</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-12-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C3176</td><td>direct fluorochrome&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluor488-5-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C11397</td><td>direct fluorochrome&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Olympus BX61</td><td>BX61</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Orca ER, Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>4&rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>fluorescent dye</td></tr></tbody></table>

een fast air-droge dropping chromosome bereidingswijze geschikt voor vissen in planten

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Bereiding van chromosoom spreads is een voorwaarde voor de succesvolle uitvoering van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Voorbereiding van hoogwaardige plantaardige chromosoom spreads is een uitdaging te wijten aan de starre celwand. Eén van de erkende werkwijzen voor de bereiding van plantaardige chromosomen is een zogenaamd druppel preparaat, ook wel drop verspreiding of lucht-droogtechniek. Hier presenteren we een protocol voor de snelle bereiding van mitotische chromosoom spreads geschikt voor de FISH detectie van enkele en hoog kopie DNA-sondes. Deze werkwijze is een verbeterde variant van de luchtdroge neerzetten uitgevoerd onder een relatieve vochtigheid van 50% -55%. Dit protocol omvat een gereduceerd aantal wasstappen van zijn aanvraag eenvoudig, efficiënt en reproduceerbaar. Duidelijke voordelen van deze aanpak zijn goed gespreid, onbeschadigd en tal metafasechromosomen dienen als een perfecte voorwaarde voor een succesvolle FISH analyse. Met behulp van dit protocol verkregen wij hoogwaardige chromOsome spreads en reproduceerbare FISH resultaten voor Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum en Secale cereale.

Microscopische objectglaasjes met metafase mitotische smeersels werden bereid met een snelle drogen dropping chromosoom bereidingsmethode beschreven (Suppl. Figuur 1). FISH analyse werd uitgevoerd met zowel repetitief en single-copy sequenties. Beelden werden verkregen door een epifluorescentiemicroscoop met een set van filters waardoor excitatie van overeenkomstige fluoroforen en opgevangen door een zeer gevoelige CCD monochrome camera. Voor het beeld overname gebruikten we een computer met een beeld a...

Er wordt een protocol beschreven voor de bereiding van hoogwaardige mitotische plantenchromosoomuitstrekkingen door een snelle luchtdroog-druppelmethode die geschikt is voor de FISH-detectie van enkele en hoge kopie-DNA-sondes.

Een Fast Air-droge Dropping Chromosome Bereidingswijze Geschikt voor vissen in planten

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Het algemene doel van deze methode is het prepareren van plantenchromosomen die geschikt zijn voor de fluorescentie-in-situ-hybridisatietechniek met behulp van single- en high-copy DNA-sondes. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de cytogenetica en genomica-onderzoek, zoals de detectie van chromosoomrearrangementen, de ordening van genetische markers op chromosomen en comparatieve analyse tussen verschillende soorten. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat het prepareren van chromosoomspreidingen snel, eenvoudig en efficiënt wordt.Celsuspensies kunnen tot twee maanden bij -20 °C worden bewaard en indien nodig worden gebruikt voor de preparatie van chromosomen. We kwamen 처음elijk op dit idee voor deze methode toen we observeerden dat de kwaliteit en het aantal geschikte chromosomen drastisch toenamen. Laat 10 tot 20 gerstzaden twee dagen lang bij 22 tot 24 °C onder donkere omstandigheden kiemen op twee lagen vochtig filterpapier in een Petrischaal. Snijd na twee dagen met een scheermes krachtige wortels met een lengte van 1 tot 2 cm van de zaden af.Bereid vervolgens ijskoud water voor door een glazen fles van 500 milliliter met koud kraanwater in een bad van gecrusht ijs en water te plaatsen. Belucht het ijskoude water en dompel de worteltops gedurende 20 uur onder om de frequentie van cellen in de metafase te verhogen. Verplaats de wortels vanuit het water naar 50 milliliter ethanol-azijnzuur fixatiemiddel om ze gedurende twee dagen bij kamertemperatuur te fixeren.Was 10 tot 20 wortels twee keer gedurende vijf minuten met 30 milliliter ijskoud kraanwater in een glazen bekerglas van 50 milliliter. Verplaats de wortels één voor één met een pincet naar 30 milliliter citraatbuffer. Was de wortels door het bekerglas twee keer gedurende vijf minuten te schudden.Plaats de wortels vervolgens onder een microscoop op filterpapier om de vloeistof volledig te verwijderen. Snijd het ongewenste niet-meristematische weefsel af met een scheermesje. De meest kritische stap van deze procedure is het bepalen van de juiste digestietijd, die per soort kan variëren.Hierbij worden tot 20 wortelpuntjes gedurende ongeveer 50 minuten geïncubeerd in één milliliter enzymmengsel bij 37 °C. Om het plantenweefsel in een horlogeglas onder een microscoop te verzachten, wordt het enzym met een pipet verwijderd en worden de wortelpuntjes op ijs gewassen met vijf milliliter 0,01 M citraatbuffer om het resterende enzym te vervangen. Was de wortelpuntjes vervolgens twee keer zorgvuldig met één milliliter 96% ethanol in hetzelfde horlogeglas.Vervang vervolgens de ethanol door 10 tot 15 µL vers bereide fixeeroplossing per wortelpunt. Breng de wortelpunten samen met de fixeeroplossing over naar een buisje van twee milliliter en ontbind de wortelstengels met een dissectienaald of pincet. Tik 20 keer tegen het buisje om de cellen opnieuw te suspenderen en een celsuspensie te verkrijgen.Plaats vervolgens twee tot drie lagen in water gedrenkt theepapier op een warmteplaat bij 50 °C. Dompel de microscopische objectglazen gedurende 30 minuten onder in ijskoud kraanwater in de koelkast. Plaats de objectglazen vervolgens op het vochtige theepapier, pipetteer 7 tot 10 µL van de cel-suspensie en laat dit vanuit een afstand van 20 cm op het gekoelde objectglas vallen dat op de warmteplaat is geplaatst.Voeg vervolgens 10 µL van het azijnzuur-ethanolmengsel toe op dezelfde plek als de cel-suspensie op het objectglas en laat het objectglas op de warmteplaat liggen. Plaats het objectglas na twee minuten op de warmteplaat zonder het natte weefsel en laat het nog één minuut drogen. Controleer de objectglazen met een fasecontrastmicroscoop om de kwaliteit van de chromosoomspreiding te controleren.Gebruik de coupes op dezelfde dag of bewaar deze door ze onder te dompelen in 96% Ethanol in een Coplin-pot bij min 20 graden Celsius om de coupes voor te behandelen vóór FISH. Plaats de coupes met een pincet gedurende vijf minuten in een Coplin-pot met 50 milliliters 2X SSC. Verplaats de coupes naar een Coplin-pot met 50 milliliters 45% azijnzuur voor drie tot 10 minuten.Kruislingse overdracht: plaats de objectglaasjes vervolgens gedurende 10 minuten in een Coplin-pot met 50 milliliter 2 XSSC. Plaats de objectglaasjes daarna gedurende 10 minuten in een Coplin-pot met 50 milliliter 4% formaldehyde om de chromosomen te fixeren. Verwijder de formaldehyde door de objectglaasjes drie keer gedurende vier minuten te spoelen in een Coplin-pot met 50 milliliter 2 XSSC.Dehydrateer vervolgens de coupes gedurende twee minuten in een serie van 70%, 90% en 100% ethanol, en droog de coupes in een verticale positie. Bereid voor elke coupe een hybridisatieloplossing van 20 µL door 10 µL gedeïoniseerd formamide, vijf µL 4X hybridisatiebuffer, drie µL van de probe en twee µL DNase-vrij water te gebruiken. Voeg 20 µL hybridisatieloplossing per coupe toe en dek deze af met een dekglas van 24 bij 32 millimeter.Nadat het dekglas met rubbercement is verzegeld, worden de preparaten met probes gelijktijdig gedenatureerd bij 80 °C gedurende twee minuten op een warmteplaat, waarna de preparaten worden overgebracht naar een vochtige kamer en overnight worden geïncubeerd bij 37 °C. Verwijder, onder vermijding van licht, de dekglasjes door de preparaten te spoelen in een coplan-pot met 2X SSC. Plaats de preparaten vervolgens in een coplan-pot met 2X SSC bij 55 tot 60 °C en incubeer gedurende 20 minuten.Plaats de coupes vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur in twee XSSC in een coplan-pot. Dehydrateer de coupes gedurende twee minuten in een coplan-pot in een reeks van 70%, 90% en 100% ethanol. Laat de coupes aan de lucht drogen en kleur ze tegen met dappy in Antifa-monteermedium, waarbij intense lichtinstraling wordt vermeden.Analyseer de preparaten met een epifluorescentiemicroscoop. De keuze van het filter hangt, indien nodig, af van het fluorochroom dat is gebruikt voor de labeling van de probe. Bewaar de preparaten tot een jaar lang bij vier graden Celsius onder donkere omstandigheden.Hier worden mitotische metafase-spreidingen getoond die zijn geprepareerd met de methode van snelle luchtdroging via druppelpreparatie van chromosomen. De FISH-analyse werd uitgevoerd met behulp van zowel repetitieve als single-copy sequenties. Beelden zijn verkregen met een epifluorescentiemicroscoop met een set filters waarmee excitatie van de corresponderende fluoroforen mogelijk is, en zijn vastgelegd met een monochrome CCD-camera met hoge gevoeligheid.Het FISH-experiment op mitotische metafasechromosomen van hoard en vulgari met behulp van een single copy probe en five S-R-D-N-A onthulde duidelijke signalen van hoge kwaliteit. Hybridisatie van CT CTT 10 microsatelliet op de chromosomen van hordy en BULBUS resulteerde in een specifiek en duidelijk patroon. Het FISH-experiment op mitotische metafasechromosomen van sala serial met behulp van PSC 119 twee probe resulteerde in specifieke signalen van hoge kwaliteit.De overduidelijke voordelen van deze benadering zijn goed verspreide, onbeschadigde en talrijke metafasechromosomen, wat een perfecte voorwaarde is voor een succesvolle FISH-analyse. Eenmaal beheerst, kan deze procedure in minder dan twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een kwalitatieve mitotische metafase-chromosomenpreparaat voor FISH en Former bereidt. Aangezien formaldehyde extreem gevaarlijk kan zijn, dient u altijd handschoenen te dragen en een zuurkast te gebruiken bij het uitvoeren van deze procedures.

a-fast-air-dry-dropping-chromosome-preparation-method-suitable-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Fluorescerende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie op Mitotische Chromosomen van muggen

Dit artikel beschrijft DNA-extractie uit zebravisstaartclip. Het protocol demonstreert een snelle en efficiënte methode om zebravis genotypen te analyseren.

DNA-extractie uit staartclip: een methode die wordt gebruikt bij het genotyperen van zebravissen

Het materiaal hier beschrijft een methode die is ontwikkeld om de driedimensionale chromatinestructuur van testiculaire kiemcellen te behouden. Dit wordt de driedimensionale (3D) diamethode genoemd. Deze methode verbetert de gevoeligheid voor detectie van subnucleaire structuren en is toepasbaar voor immunofluorescentie, DNA en RNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).

Diavoorbereidingsmethode om driedimensionale chromatinearchitectuur van testiculaire kiemcellen te behouden

Chromosoomschilderen is een handige methode voor het bestuderen van de organisatie van de celkern en de evolutie van het karyotype. Hier demonstreren we een aanpak om specifieke interessegebieden te isoleren en te versterken van enkele polytene chromosomen die vervolgens worden gebruikt voor twee- en driedimensionale fluorescerende in situ hybridisatie (FISH).

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de productie en de achterste CRISPR/Cas9 genoom Knockout elektrische vissen. Gedetailleerd beschreven zijn de vereiste moleculaire biologie-, fok-en veeteelt vereisten voor zowel een gymnotitievorm als een mormyrid, en injectietechnieken om Cas9-geïnduceerde Indel F0 -larven te produceren.

Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis

Nucleaire oppervlaktespreads zijn een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoomgebeurtenissen tijdens meiose. Hier demonstreren we een methode om meiotische chromosomen voor te bereiden en te visualiseren tijdens profase I van zebravissen spermatocyten.

Bereiding van Meiotic Chromosome Spreads van Zebrafish Spermatocyten

Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie in intacte zebravisembryo's.

Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.

Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen

Dit protocol beschrijft een aangepaste procedure voor het snel isoleren van schone fase I-eicellen in zebravissen zonder granulosacellen, waardoor een handige methode wordt geboden voor eicelspecifiek onderzoek.

Snelle isolatie van stadium I eicellen in zebravissen zonder granulosacellen

Leer een snelle luchtdroog druppelmethode voor het prepareren van plantenchromosomen voor FISH-analyse. Deze techniek verbetert de kwaliteit en efficiëntie van cytogenetisch onderzoek met gerst als modelorganisme.

Een Fast Air-droge Dropping Chromosome Bereidingswijze Geschikt voor vissen in planten

Meer video's verkennen