Name: Gordijn Flow Column: Optimalisatie van efficiëntie en gevoeligheid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Leer hoe je een curtain flow kolom optimaliseert om efficiëntie en gevoeligheid van HPLC-scheidingen te verbeteren. Deze methode biedt een betrouwbare oplossing voor trace-analyse in milieuwetenschappen en forensisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Een van de auteurs (DK) erkent de ontvangst van een Australian Postgraduate Award.

Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor alle materialen en reagentia voor het gebruik (dwz, VIB voor methanol). Zorg ervoor dat het gebruik van alle nodige veiligheidsvoorschriften bij de omgang met oplosmiddelen en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluent. Zorgen voor het juiste gebruik van technische controles van HPLC, analytische balans en de detector instrumentatie, en zorgen voor het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en dichte schoenen). Let op: Dit protocol bevat instructies over hoe je een CF column te gebruiken op een HPLC-systeem in combinatie met een UV-Vis detector. Het protocol is geschreven in de veronderstelling de lezer basiskennis en ervaring in de chromatografie. 1. Setup van HPLC Instrument Opmerking: Dit gedeelte kan worden aangepast aan de analisten behoeften, dat wil zeggen aan te passen, de keuze van oplosmiddelen, golflengte detector en debiet datgeschikt zijn voor de steekproef van belang. <ol><li> Bereid de HPLC instrument 100% ultrazuiver water (bijvoorbeeld Milli-Q water) voor lijn A en 100% methanol gedurende lijn B als de mobiele fase en ontlucht de pompen volgens eis fabrikant. </li><li> Stel de UV-Vis detector 254 nm. </li><li> Kies ofwel een pre-injectie stroom split-modus van de set-up, of een dubbele pomp stroom set-up. Voor de split-flow-modus ga dan naar stap 2, voor de dubbele pomp mode verder met stap 3. </li></ol> 2. Split-flow System Setup <ol><li> Koppel de pomp lijn van de injector klep van de auto-sampler. </li><li> Bevestig een T-stuk aan de pomp lijn. </li><li> Bevestig een 15 cm stuk van 0,13 mm id slang aan op iedere haven van de T-stuk. </li><li> Sluit één buis van het T-stuk op de afsluiter van de auto-sampler injector. </li><li> Stel de pomp 1,0 ml min -1. </li><li> Alvorens pompleidingen naar de inlaat van de kolom CF Stem de segmentatie verhouding van de stroom tot 40%: 6<html> 0% (middellijn: perifere lijn) als volgt in stap 2.7. </li><li> Tuning van CF inlaat verhouding op de split-flow-systeem <ol><li> Meet de massa van twee lege verzameling schepen met behulp van een analytische balans en label een collectie vat centraal en de andere perifere (één voor de lijn van de auto-sampler naar de haven en een centrum voor de lijn van het T-stuk aan perifere poort) . </li><li> Gedurende 1,0 min, laat de uittredende mobiele fase uit de lijn vanuit de injector (op het punt dat wordt verbonden met de kolom) in het verzamelvat, waarvan de massa werd gemeten in 2.7.1. </li><li> Re-wegen de collectie vaartuig op de analytische schaal en het bepalen van de massa van de mobiele fase verzameld. </li><li> Herhaal stappen 2.7.2 tot 2.7.3 van het eluent verlaten van de lijn van het T-stuk dat moet worden aangesloten op de periferiepoort. </li><li> Bepaal het percentage stroom (ml min -1) van elke lijn van stroom volgens de volgende vergelijkingen: 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Stel de stroom ratio tot 40%: 60% (± 2%) (lijn van injector naar het centrum van de haven: lijn van T-stuk aan perifere poort). Als de lijn van de injector naar de centrale poort Uitstroompercentage boven 40%, verhoging van de drukval door het verlagen van de inwendige diameter van de buis, of verhoging van de lengte. Indien de lijn injector centrale poort Uitstroompercentage minder dan 40%, verhoging binnendiameter van de buis of de lengte van de buis afnemen. </li><li> Zodra de stroom verhoudingen zijn afgestemd draai het pompje uit. </li><li> Sluit de lijn van de injector naar de centrale poort van de kolominlaat en de lijn van het T-stuk naar de periferiepoort van de kolominlaat. </li><li> Oprit langzaam het debiet tot 1,0 ml min -1 bij 100% lijn B. </li><li> Equilibreren van de kolom (4,6 mm ID x 100 mm lengte) doordat100% Methanol (lijn B) mobiele fase stroomt door de kolom bij 1,0 ml min-1 gedurende 10 min. Deze tijd wordt geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker kan gebruiken. </li><li> Voor de afstemming van de CF uitlaat gaat u naar Stap 4. &quot;Tuning van CF uitlaat flow &#39;. </li></ol></li></ol> 3. Dual Pump System Setup <ol><li> Sluit het HPLC-systeem pomp naar de injector en sluit vervolgens de lijn van de injector naar de centrale inlaat van de kolom. </li><li> Sluit de extra pomp rechtstreeks aan de inlaat periferiepoort van de kolom. Merk op dat deze tweede pomp by-passeert de injector. </li><li> Ramp het debiet van de circulatiepomp aan de centrale poort 0,4 ml min-1 (representatief voor 40% van het totale debiet van 1,0 ml min-1) en 100% Methanol (lijn B). </li><li> Op hetzelfde moment als stap 3,3, helling het debiet van de perifere pomp 0,6 ml min-1 (representatief voor 60% van het totale debiet van1,0 ml min -1) en 100% Methanol (lijn B). </li><li> Equilibreren van de kolom (4,6 mm ID x 100 mm lengte) doordat 100% Methanol (lijn B) mobiele fase door de kolom te stromen bij 1,0 ml min-1 gedurende 10 min. Deze tijd wordt geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker kan gebruiken. </li><li> Voor de afstemming van de CF uitlaat gaat u naar Stap 4. &quot;Tuning van CF uitlaat flow &#39;. </li></ol> 4. Tuning van CF Outlet Flow <ol><li> Sluit de centrale uitlaatpoort aan de UV-Vis detector met behulp van een 15 cm stuk van 0,13 mm id slang. </li><li> Sluit een 15 cm stuk van 0,13 mm id slang aan op de perifere uitlaatpoort van de kolom CF. </li><li> Weeg de massa van twee lege collectie schepen op de analytische balans en label één vat centraal en de andere perifere. </li><li> Voor 1,0 min, het verzamelen van de uittredende mobiele fase van de UV-Vis detector (centrale flow) in de collectie vat label centrale, waarvan de massa werd gemeten in 4.2. </li><li> Re-wegen de collectie vat met de verzamelde eluens over de analytische schaal en het bepalen van de massa van de mobiele fase verzameld. </li><li> Herhaal stap 4,4-4,5 voor de eluent verlaten van de lijn uit het perifere uitlaatpoort. </li><li> Bepaal het percentage van de stroming van elke lijn van stroom volgens de volgende vergelijkingen: <img alt="vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/53471/53471eq2.jpg" /></li><li> Stel de stroom ratio tot 21%: 79% (± 2%) (centrale uitlaat flow uit UV-Vis: perifere uitlaat stroom van lijn). Als de centrale stroom percentage van de UV-Vis is boven de 21%, verhoging van de drukval door verlaging van de inwendige diameter van de buis aan de uitgang van de UV-Vis detector, of verhoging van de lengte. Als de centrale Uitstroompercentage van de UV-Vis is dan 21%, verhoging binnendiameter van de buis aan de uitgang van de UV-Vis detector, of de lengte van de buis afnemen. Telkens wanneer het buisstuk is gewijzigd, herhaaltstappen 4,3-4,7. Let op: De CF column in &#39;virtuele&#39; 2,1 mm id-modus is klaar voor analyse. </li></ol>

<ol><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+parallel+segmented+outlet+flow+columns+for+enhanced+mass+spectral+sensitivity+at+high+chromatographic+flow+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates.</a> Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology%3A+Parallel+segmented+outlet+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr. A. 1232 (0), 47-51 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology%3A+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr. A. 1270 (0), 204-211 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111 (0), 3-7 (2013).</li>
<li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803 (0), 154-159 (2013).</li>
<li>Kocic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+through-put+and+highly+sensitive+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+separations+of+essential+amino+acids+using+active+flow+technology+chromatography+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns.</a> J. Chromatogr. A. 1305 (0), 102-108 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography%3A+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr. A. 1335 (0), 122-135 (2014).</li>
<li>Shellie, R., Haddad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comprehensive two-dimensional liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 386 (3), 405-415 (2006).</li>
<li>Abia, J. A., Mriziq, K. S., Guiochon, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+heterogeneity+of+some+analytical+columns+used+in+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Radial heterogeneity of some analytical columns used in high-performance liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 1216 (15), 3185-3191 (2009).</li>
<li>Knox, J. H., Laird, G. R., Raven, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+radial+and+axial+dispersion+in+liquid+chromatography+in+relation+to+the+%26%2334%3Binfinite+diameter+effect%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the &#34;infinite diameter effect&#34.</a> J. Chromatogr. A. 122 (0), 129-145 (1976).</li>
<li>Miyabe, K., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+column+radial+heterogeneity+from+an+analysis+of+the+characteristics+of+tailing+peaks+in+linear+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).</li>
<li>Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+and+radial+diffusion+coefficients+in+a+liquid+chromatography+column+and+bed+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity.</a> J. Chromatogr. A. 994 (1-2), 1-12 (2003).</li>
<li>Gritti, F., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+thermal+heterogeneity+of+the+column+on+chromatographic+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of the thermal heterogeneity of the column on chromatographic results.</a> J. Chromatogr. A. 1131 (1-2), 151-165 (2006).</li>
<li>Shalliker, R. A., Wong, V., Broyles, B. S., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+bed+compression+in+an+axial+compression+liquid+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of bed compression in an axial compression liquid chromatography column.</a> J. Chromatogr. A. 977 (2), 213-223 (2002).</li>
<li>Tallarek, U., Albert, K., Bayer, E., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+transverse+and+axial+apparent+dispersion+coefficients+in+packed+beds%5BTitle%5D)+AND+%22AICHE+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of transverse and axial apparent dispersion coefficients in packed beds.</a> AICHE J. 42 (11), 3041-3054 (1996).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations%3A+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> J. Sep. Sci. 35 (3), 410-415 (2012).</li>
<li>Shalliker, R. A., Broyles, B. S., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+evidence+of+two+wall+effects+in+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 888 (1-2), 1-12 (2000).</li>
<li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns%3A+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+%27virtual%27+narrow+bore+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr. A. 1262 (0), 64-69 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+a+new+concept+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li>
<li>Foley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+Reliability%3A+an+Intercontinental+Study+of+Curtain+Flow+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Thermo+Scientific%22%5BJournal%5D)">Precision and Reliability: an Intercontinental Study of Curtain Flow Chromatography.</a> Thermo Scientific. , (2013).</li>
<li>Pravadali-Cekic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+Approaches+for+the+Analysis+of+Complex+Samples+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22University+of+Western+Sydney%22%5BJournal%5D)">Multidimensional Approaches for the Analysis of Complex Samples using HPLC.</a> University of Western Sydney. , PhD thesis (2014).</li>
<li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116 (0), 230-234 (2014).</li>
<li>Foley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curtain+flow+chromatography+%28%27the+infinite+diameter+column%27%29+with+automated+injection+and+high+sample+through-put%3A+The+results+of+an+inter-laboratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Curtain flow chromatography ('the infinite diameter column') with automated injection and high sample through-put: The results of an inter-laboratory study.</a> Microchem. J. 110 (0), 127-132 (2013).</li>
</ol>

Dit werk werd ondersteund door UWS en ThermoFisher Scientific.

Dit onderzoek betrof de inter-laboratoriumanalyse van CF chromatografiekolommen de analytische prestaties in termen van efficiency en gevoeligheid te testen. De CF-kolom werd opgezet met een dubbele pompsysteem zoals beschreven in paragraaf &quot;3. Dubbele pomp opgezet om een ​​stroom van 40:60 bereiken (midden: perifere) aan de inlaatzijde van de kolom CF. Het 40:60 (centrum: perifere) stroomverhouding werd bereikt door het debiet van elke pomp naar de waarde die 40% en 60% van de totale stroomsnelheid, wat overeenkom...

De laatste jaren kolomtechnologie voor High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is sterk gevorderd; piekvermogens aanzienlijk toegenomen dankzij grotendeels het gebruik van kleinere deeltjes en een efficiënter kern schildeeltjes. Aangezien scheidingen algemeen efficiënter is een stroom-effect een toename van de gevoeligheid sinds pieken nu scherper en dus groter 1-8. Niettemin radiale bed heterogeniteit is nog steeds een beperkende factor bij het uitvoeren van alle kolommen, maar dit is geen nieuw verhaal aangezien dit chromatographers zijn vele jaren bekend. Kolom bedden zijn heterogeen in zowel de radiale richting 9-12, en langs de kolomas 10,12-15. De wand-effect is vooral een belangrijke bijdrage aan het verlies van de scheiding prestaties 7,16-18. Shalliker en Ritchie 7 onlangs beoordeeld aspecten van de kolom bed heterogeniteit en dus dit hoeft niet discusse zijnd hier verder. Hoewel het volstaat om te zeggen, dat de variatie in kolom bed pakkingsdichtheid en de muur effecten leiden tot een verstoring van de opgeloste stof plug, zodanig dat bands elueren door de kolom in pluggen die lijken gedeeltelijk gevuld soepkommen in plaats van dunne platte massieve schijven 7 die meestal afgebeeld in de basis onderwijs teksten. Bij dergelijke experimenten werden uitgevoerd dat de opgeloste migratie door het bed kan worden gevisualiseerd de stekker profielen in de kolom waren gedeeltelijk hol en de staart deel van de band grotendeels wandcomponent van het monster plug. Het eindresultaat is dat het duurt veel meer platen om deze &#39;gedeeltelijk hol&#39; pluggen dan nodig zou zijn als de schijven waren solide en platte 12,14,17 scheiden. De band verbreding kwesties in verband met wandeffecten en de variatie in radiale pakkingsdichtheid overwinnen, een nieuwe vorm van kolomtechnologie zogenaamde Active Flow Technology (AFT) is gemaakt 7,19. Het doel van dit ontwerp waswandeffecten heffen door de fysieke scheiding van oplosmiddel eluerende langs het wandgebied, dat van de mobiele fase elueren in het radiale centrale gebied van de kolom 19. Er zijn twee hoofdtypen van AFT kolommen; Parallel Gesegmenteerde Flow (PSF) kolommen en Curtain Flow (CF) kolommen 7. Aangezien dit protocol is gericht op het gebruik en de optimalisatie van de CF columns, PSF kolommen worden niet verder besproken. Gordijn Flow (CF) Gordijn Flow (CF) kolomnotatie gebruik AFT end-fitting aan zowel de inlaat als de uitlaat van de kolom. AFT end-armaturen bestaan ​​uit een ringvormige frit zich in een multiport fitting. De frit bestaat uit drie delen: een poreus radiaal centraal gedeelte dat is uitgelijnd met de centrale poort van de eindfitting, een poreus buitengedeelte dat is uitgelijnd met de perifere poort (en) van het koppelstuk, en een ondoordringbare ring die scheidt de twee poreuze gedeelten voorkomen van kruis-Flow tussen de centrale en radiale buitengebieden van de frit 19. Figuur 1 illustreert het ontwerp van de AFT frit en figuur 2 illustreert het CF kolomformaat. In deze modus (CF) het monster wordt geïnjecteerd in de radiale centrale poort van de inlaatfitting, terwijl aanvullende mobiele fase wordt via de perifere poort van de inlaat &#39;gordijn&#39; de migratie van opgeloste stoffen door de radiale centrale gebied van de kolom. Vandaar het monster komt het bed in de radiale centrale gebied van de kolom met het buitenste gebied van de kolom met mobiele fase alleen doorleiden. Studies hebben aangetoond dat een volumestroom verhouding van ongeveer 40:60 (CV: periferiepoort) voor het inlaateinde-fitting van een kolom 4,6 mm inwendige diameter (id) optimaal 6,7,16. De AFT uitlaat van de CF kolom maakt de aanpassing van de centrale en perifere stroom naar hun relatieve aandeel en kunnen worden gevarieerd om bijna elke gewenste ratio door de druk management. Het optimaliseren van een CF kolom kan een aanzienlijke verbetering verschillende functionele aspecten van de kolomtechnologie, zoals scheidend vermogen of detectiegevoeligheid. Op deze wijze wordt een &#39;wall-less&#39;, &#39;oneindige diameter &quot;of kolom&#39; virtueel &#39;is gevestigd 6,10,18,20. Doel van CF kolommen actief te beheren de migratie van monster door de kolom te voorkomen dat het monster van het wandgebied bereiken. Aldus wordt de concentratie opgeloste stof bij het ​​verlaten van de detector gemaximaliseerd, verhogen van de gevoeligheid van ongeveer 2,5 maal groter dan de conventionele kolomindeling bij gebruik van ultraviolet (UV) detectie 16 en nog meer bij gebruik massaspectrale detectie 6. CF kolommen zijn ideaal voor lage concentratie monsters, aangezien detectiegevoeligheid toeneemt. Verder zijn ze ideaal wanneer gekoppeld aan snelheid beperkt detectoren, zoals de massaspectrometer (MS) 6 stromen. een AFT kolom in een 4,6 mm ID formaat, kan bijvoorbeeld worden afgestemd op dezelfde volume oplosmiddel leveren aan een detector als een standaard 2,1 mm id format kolom wanneer bedreven bij dezelfde lineaire snelheden, door instelling verlaten middenuitstromer tot 21%. Ook de AFT kolom kan ook worden afgestemd op dezelfde volumebelasting leveren aan een detector als 3,0 mm id kolom, door instelling verlaten middenuitstromer tot 43%. In feite kon geen &#39;virtuele&#39; kolom-formaat worden geproduceerd om de analytische eis 6,18,22 passen. Met deze speciaal ontworpen end-fitting aan de inlaat en de uitlaat, zodat een echte muur minder kolom vastgesteld. Er zijn twee manieren om het opzetten van het oplosmiddel levering systeem om de centrale en perifere havens van de inlaat. Split-flow systeem 6 en twee pompsysteem 6,7 Figuur 3 toont elk van deze CF-systeem set-ups. Split-flow-systeem ikna stroomsplitsingsproces (zie figuur 3A) het pompdebiet waardoor de injector split pre-injector met een nul-dood volume T-stuk, waarbij een vloeistofstroom mobiele fase is verbonden met de injecteur, die vervolgens wordt verbonden met de centrale poort van het inlaateinde-fitting van de kolom. De tweede stroom stroom eluens met de injector-passeert en is verbonden met de perifere poort op de inlaat van de kolom. Tijdens de splitsing van de stroom, wordt de vloeistofstroom percentage ingesteld op 40:60 (midden: perifere) voor de leidingen zijn verbonden met de kolom, dwz van injector centrum en pomp perifere. Twee pompsysteem De CF kolom vereist twee stromen aan het inlaateinde-fitting van de kolom. Afhankelijk van het type autosampler / Injecteur volgens de HPLC instrument stroomsplitsingsproces zetten niet altijd mogelijk, en dus CF kan dan worden bereikt door 2 pompen (Figuur 3B 21). Elke pomp is verdeeld en aangesloten op het centrale of perifere poort en de stroomsnelheid is ingesteld op 40% van de stroom voor de centrale poort en 60% voor periferiepoort vertegenwoordigen. Als bijvoorbeeld de totale stroomsnelheid 1,0 ml min -1, de centrale pompdebiet wordt ingesteld op 0,4 ml min-1 en de perifere pomp is ingesteld op 0,6 ml min -1. De keuze van de werkwijze is grotendeels afhankelijk van de HPLC instrumentatie en chromatografische werkwijze. Bijvoorbeeld in sommige autosamplers een verandering in druk tussen monster laadpositie en injecteer monster positie kan optreden verstoren van de stroomsplitsingsproces verhouding en dus in dit geval een dubbele pomp ingesteld voor optimale prestaties CF zou worden aanbevolen. Ongeacht het oplosmiddeltoevoersysteem opgezet gekozen voor de inlaat van de kolom CF, CF blijft de uitlaat optimalisatie hetzelfde. De uitlaat centrale poort van de kolom CF is bevestigd aan de Ultraviolet-Visible (UV-Vis) detector met de smalopdat volume mogelijk slang aan de effecten van post-kolom dode volume te minimaliseren. Aangezien CF kolommen emuleren nauwe boring kolommen dode volume tussen de kolomuitlaat en de detector is nadelig voor het scheidend vermogen van de kolom CF. Het is cruciaal om de kleinste hoeveelheid volume buis tussen de centrale poort en de UV-Vis detector om de effecten van dode volume zoals bandverbreding, rendementsverlies en gevoeligheid minimum wordt beperkt. Derhalve wordt het gebruik van smalle boring buis (0,1 mm id) aangeraden gemakkelijk druk aanpassingen mogelijk zonder toevoeging ongepaste dood volume. Slang is ook verbonden met de periferiepoort en gericht te verspillen. Bij de uitlaat van de kolom CF, kan de segmentering verhouding worden aangepast aan elke verhouding die het doel van de analist past. Wanneer een 4,6 mm id CF wordt gebruikt, bijvoorbeeld, is het vaak handig om de ratio of 43:57 of 21:79 (centrum: perifere) ingesteld op een &quot;virtueel&quot; 3,0 mm ID kolom of 2,1 mm kolom die emulerenrespectvol. Op die manier de scheiding prestaties is direct-bank gemarkeerd. De segmentatie verhouding wordt gemeten door wegen van de hoeveelheid stroom verlaten van de detector die is verbonden met de centrale poort en de stroom die uit de periferiepoort gedurende een periodetijd. Het percentage stroming door elke poort kan dan worden bepaald en de verhoudingen kunnen worden bijgesteld door het buisstuk bevestigd of via slangen met een andere inwendige diameter (id) heeft. Deze video protocol beschrijft de procedures van een CF-column voor verbeterde chromatografische prestaties werking en optimalisatie.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Additional Pump</td><td></td><td></td><td>Vereist als 2 pomp CF systeemconfiguratie wordt gebruikt.</td></tr><tr><td>Curtain Flow HPLC kolom</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Niet gedefinieerd</td><td>Binnenkort te commercialiseren</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Elk merk</td><td></td><td>HPLC kwaliteit</td></tr><tr><td>PEEK buis</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Verschillende lengtes en i.d. </td></tr><tr><td>PEEK buissnijder</td><td>Elk merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytische weegschaal</td><td>Elk merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stopwatch</td><td>Elk merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eluent verzamelvaten</td><td>Elk merk</td><td></td><td>1-2 ml monstervialen kunnen worden gebruikt als eluent verzamelvaten</td></tr><tr><td>T-stuk</td><td>Elk merk</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gordijn flow column: optimalisatie van efficiëntie en gevoeligheid

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is een vorm van kolomtechnologie die de scheidingsprestaties van een HPLC-kolom verhoogt door het gebruik van speciaal ontworpen multipoort-eindfitting(s). Curtain Flow (CF) kolommen behoren tot de AFT-suite van kolommen, specifiek is de CF-kolom zo ontworpen dat de monster wordt geïnjecteerd in de radiale centrale regio van het bed en een gordijnstroom van mobiele fase rond de injectie van opgeloste stof voorkomt dat het monster radiaal naar de wand verspreidt. De kolom functioneert als een kolom met een 'oneindige diameter'. Het doel van het ontwerp is om de radiale heterogeniteit van het kolombed te overwinnen en tegelijkertijd de monsterbelasting in de radiale centrale regio van het kolombed te maximaliseren, wat dient om de detectiegevoeligheid te verhogen. Het hier beschreven protocol schetst de systeem- en CF-kolomopstelling en het afstelpatroon voor een geoptimaliseerde 'virtuele' kolom met een oneindige diameter.

AFT kolommen werden ontwikkeld met behulp van een gespecialiseerde frit ontwerp (figuur 1) in de multipoort kolom end-fittingen aan de kolom bed heterogeniteit overwinnen en scheiding verbeteren. Een inter-laboratoriumonderzoek op de scheiding prestaties van CF chromatografiekolommen (figuur 2) werd uitgevoerd met een dubbele pomp opgezet (Figuur 3B), zoals beschreven in paragraaf 3 van dit protocol 23 uitgevoerd. Een drie com...

Hier presenteren we een protocol voor de werking en optimalisatie van Active Flow Technology (AFT) kolom in Curtain flow (CF) modus voor verbeterde scheidingsprestaties.

Gordijn Flow Column: Optimalisatie van efficiëntie en gevoeligheid

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Het algemene doel van deze methode is om de efficiëntie en gevoeligheid van een scheiding te verbeteren door de optimalisatie van een curtain flow-kolom. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de milieuwetenschappen, forensisch onderzoek en in gebieden waar sporenanalyse vereist is, waarbij een efficiënte en zeer gevoelige scheidingstechniek nodig is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de efficiëntie van een scheiding en de gevoeligheid van de analyse verhoogt in vergelijking met conventionele HPLC-scheidingsmethoden.Deze methode kan een middel bieden om de scheidingskracht, en daarmee de capaciteit van de snelheid, op een economisch en tijdsefficiënte manier te verhogen. De gordijnstroomkolom is een nieuw concept voor beoefenaars van HPLC, maar het gebruik ervan is niet ingewikkeld. Het vereist simpelweg de optimalisatie van de juiste stroomverhoudingen.Bereid eerst flessen met 100 procent ultrapuur water en 100% methanol voor als mobiele fasen A en B voor het HPLC-instrument. Spoel de pompen door volgens de vereisten van de fabrikant. Ontkoppel na het doorspoelen de pompleiding van het injectieventiel van de autosampler.Bevestig een T-stuk aan de losgekoppelde lijn. Bevestig aan elke poort van het T-stuk een slangetje met een binnendiameter van 0,13 millimeter en een lengte van 15 centimeter. Verbind één slangetje van het T-stuk met het injectieventiel van de autosampler.Stel tenslotte de pomp in op een debiet van 1 mL per minuut. Tareer twee lege opvangbakjes en label deze als centraal en perifeer. Gebruik gedurende 60 seconden het bakje met het label 'centraal' om de uitgaande mobiele fase op te vangen uit de lijn die van de injector komt.Weeg het centrale vat opnieuw en bepaal de massa van de opgevangen mobiele fase. Herhaal dit proces door de doorstroom van de perifere poort op te vangen in het vat met het label 'perifeer'. Bepaal het percentage van de stroom, of de milliliters per minuut, van elke lijn met behulp van de aangegeven vergelijkingen.De centrale poort moet ongeveer 40 procent bedragen en de perifere poort ongeveer 60 procent. Als de waarden met meer dan twee procent verschillen, pas dan de lengte of diameter van de slang aan om de stroomverhouding bij te stellen. Herhaal vervolgens de stappen voor de collectie en de berekening.Schakel vervolgens de pompstroom uit en verbind de injectielijn met de centrale poort van de kolomingang. Verbind daarnaast de lijn van het T-stuk met de perifere poort van de kolomingang. Verhoog de stroomsnelheid langzaam naar 1 mL/min van 100% mobiele fase B. Om het systeem verder af te stellen, wordt er gedurende 10 minuten 100% methanol met een snelheid van 1 mL/min gepompt om de kolom te equilibreren.Gebruik om te beginnen slang om de centrale uitlaatpoort met de UV-Vis-detector te verbinden. Verbind een slang van hetzelfde type en dezelfde lengte met de perifere uitlaatpoort van de CF-kolom. Stel vervolgens de pomp in op een stroomsnelheid van 1 ml/min.Taree twee lege opvangvaten en label er één voor centrale opvang en één voor perifere opvang. Gebruik gedurende 60 seconden het als centraal gelabelde vat om de uitgaande mobiele fase uit de UV-Vis-detector op te vangen. Weeg het opvangkvat opnieuw om de massa van de geëlueerde oplossing te bepalen.Herhaal dit proces met de perifere uitlaatpoort en het gelabelde opvangvat. Bepaal nu het percentage van de flow uit elke lijn, zoals eerder is gedaan bij de inlaatflow. De UV-Vis-lijn moet 21 procent zijn en de perifere uitlaatflow 79 procent.Als de stroomverhouding aanzienlijk afwijkt, pas dan de maat van de slang aan die aan de uitgang van de UV-Vis detector is bevestigd om het percentage van de centrale stroom te wijzigen. Het is belangrijk dat de stroomverhoudingen tussen de centrale en perifere stroom bij de inlaat en de uitlaat van de kolom dit protocol volgen om de optimale prestaties van de curtain flow-kolom te waarborgen. Kolommen met active flow-technologie zijn ontwikkeld met een gespecialiseerd frit-ontwerp in de multiport-kolomkoppelingen om heterogeniteit van het kolombed te overwinnen en de scheidingsprestaties te verbeteren.Een testmengsel bestaande uit fenetool, butylbenzeen en pentylbenzeen werd geanalyseerd op conventionele kolommen met een binnendiameter van 4,6 en 2,1 millimeter, en een curtain flow-kolom met een binnendiameter van 4,6 millimeter. De scheiding van het mengsel illustreert de verbeterde prestaties wat betreft efficiëntie en gevoeligheid van een curtain flow-kolom ten opzichte van standaardkolommen. Het gebruik van een curtain flow-kolom verhoogde het signaal voor butylbenzeen, ondanks het verminderde piekvolume.Zodra deze techniek onder de knie is, kan de opstelling in minder dan een half uur worden klaargemaakt, mits dit correct wordt uitgevoerd. De opstelling van de curtain flow-kolom kan herhaaldelijk worden hergebruikt, maar de debietverhoudingen moeten routinematig worden gecontroleerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er op te letten dat de voorgeschreven debietverhoudingen zo nauwkeurig mogelijk worden aangehouden.De curtain flow-kolom heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van HPLC om de grenzen van kolommen en UPLC-instrumenten te verleggen, zodat snellere monsteranalyse mogelijk is zonder dat dit ten koste gaat van de scheidingsprestaties. Na het bekijken van deze video zou u het belang van curtain flow-kolommen moeten begrijpen, aangezien zij een betere scheiding kunnen bieden dan conventionele HPLC-kolommen.

curtain-flow-column-optimization-of-efficiency-and-sensitivity

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Een automatische methode om geschikte hydrofobe interactie chromatografie (HIC) media te gebruiken in het proces van eiwitzuivering gepresenteerd. De werkwijze maakt gebruik van een medium-druk vloeistof chromatografie systeem met automatische buffer mengen dynamische monsterlus injectie opeenvolgende kolomselektiemiddelen, multi-golflengte analyse en split fractie eluaat collectie.

Geautomatiseerde hydrofobe interactiechromatografie Kolomselectieopties voor gebruik in Protein Purification

We beschrijven een methode om onder hechtende cellen aan laminaire stroming shear stress in een steriele continue stroom circuit. De cellen 'hechting, kan morfologie worden bestudeerd door de transparante kamer, monsters verkregen van het circuit voor de metaboliet-analyse en-cellen geoogst na afschuiving blootstelling voor toekomstige experimenten of cultuur.

Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning

Hier presenteren we een protocol voor de werking en afstemming van parallelle gesegmenteerde flow chromatografie kolommen om multiplexed detectie mogelijk te maken.

Tuning een parallelle gesegmenteerd Flow Column en Multiplexed Detection inschakelen

Een protocol voor het gebruik van reactieflow hoogprestatievloeistofchromatografie kolommen voor methoden die post-kolom derivatisatie (PCD) toepassen, wordt gepresenteerd.

Bericht Column Derivatisering behulp Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Thermische grenzen kunnen voorspellen de omgevingen organismen tolereren, dat is waardevolle informatie in het gezicht van de snelle klimaatverandering. Hier beschreven zijn high-throughput protocollen om kritische thermische minima en warmte knockdown tijd bij insecten te beoordelen. Beide protocollen maximaliseren de doorvoer en minimaliseren de kosten van de tests.

Hoge doorvoertesten van kritieke thermische grenzen bij insecten

Hier presenteren we een protocol voor de geoptimaliseerde FlashPack capillaire kolomverpakkingsprocedure. Toepassing van een geoptimaliseerd protocol op een gemeenschappelijke 100-bar drukbomopstelling maakt 10 keer snellere verpakking en productie van lange ultra-high performance capillaire kolommen mogelijk.

Eenvoudige in-house ultra-high performance capillaire kolomproductie met de FlashPack-aanpak

Hier presenteren we de bereikanalysemethode om de monsterpunten te optimaliseren die worden gegenereerd door een orthogonaal experimenteel ontwerp om ervoor te zorgen dat vers voedsel lange tijd in een geventileerde doos kan worden bewaard door het luchtstroompatroon te regelen.

Ontwerp- en optimalisatiestrategieën van een krachtige geventileerde doos

Hier presenteren we de adaptieve gesimuleerde gloeimethode (ASAM) om een benaderend kwadratisch responsoppervlaktemodel (QRSM) te optimaliseren dat overeenkomt met een stoffig, met deeltjes bedekt batterijwarmtebeheersysteem en om de temperatuurdalingen te compenseren door de combinatie van luchtstroomsnelheden van systeeminlaten aan te passen.

Optimalisatie van een op lucht gebaseerd warmtebeheersysteem voor met stoffige deeltjes bedekte lithium-ionbatterijpakketten

Kinesins worden gekenmerkt door nucleotide-afhankelijke interactie met microtubuli: een cyclus van ATP omzet gekoppeld met een cyclus van microtubule interactie. We beschrijven hier protocollen om de kinetiek van afzonderlijke nucleotide overgangen in de ATP omzet cyclus van een kinesine met fluorescent gemerkte nucleotiden en gestopte stroming fluorescentie geanalyseerd.

Gebruik van Stopped-flow fluorescentie en gelabelde nucleotiden aan de ATP omzet Cyclus van kinesins Analyseer

Oppervlakte-eigenschappen van een nanodeeltje zijn belangrijk voor hun interactie met het omringende medium. Daarom kan de oppervlaktemodificatie van koolstofnanobuizen cruciaal zijn voor hun transport en retentie door poreuze media. Hier worden kolomexperimenten op laboratoriumschaal gebruikt om het mogelijke transport en de retentie van deze nanodeeltjes te begrijpen.

Vervoer van oppervlakte-gemodificeerde koolstof nanobuisjes via een bodem Column

Leer hoe je een curtain flow kolom optimaliseert om efficiëntie en gevoeligheid van HPLC-scheidingen te verbeteren. Deze methode biedt een betrouwbare oplossing voor trace-analyse in milieuwetenschappen en forensisch onderzoek.

Gordijn Flow Column: Optimalisatie van efficiëntie en gevoeligheid

Meer video's verkennen