Stamcelachtige

Het algemene doel van dit protocol is het gebruik van blastocoel-dak- of animal-cap-explantaten van x laevis voor het testen van de moleculaire mechanismen en cellulaire processen die ten grondslag liggen aan de neurale ontwikkeling in vitro en in vivo. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de ontwikkelingsbiologie en stamcelbiologie over lotbepaling, celmigratie en de celautonome en niet-autonome eigenschappen van neurale cellen. De gepresenteerde technieken bieden eenvoudige, goedkope, veelzijdige en efficiënte instrumenten voor het onderzoeken van het fundamentele mechanisme van het gedrag van cruciale neurale cellen.

Deze assays maken het mogelijk om neurale lotbepalers te testen voor de herprogrammering van geïnduceerde pluripotente stamcellen en de rijpe generatie van neurale afgeleide cellijnen voor verdere screening. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, aangezien de technieken handige vaardigheden vereisen. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methoden toen ik nadacht over het analyseren van celsegregatiegedrag.

Om een anterior neurale buis van xenopus laevis plat te mounten, gebruikt u een plastic transferpipet om een gefixeerd, gedehydrateerd en gehydrateerd embryo over te brengen naar een petrischaal van 60 millimeter die tot de rand is gevuld met PBT. Plaats vervolgens een pincet tussen de ogen en de neurale buis ter hoogte van de optic stalk en verwijder de ogen. Breng daarna het pincet voorzichtig aan onder het ectoderm dat de neurale buis achter de kop bedekt en pel het ectoderm voorzichtig af.

Na het uitvoeren van de juiste NC2-hybridisatemarkering brengt u het embryo over naar een nieuwe petrischaal van 60 milliliter gevuld met PBT en gebruik fijne pincetten om de anterieure neurale buis grofweg uit het embryo te isoleren. Verwijder vervolgens voorzichtig de losjes vastzittende chorda dorsalis onder de neurale buis. Indien nodig verwijdert u ook de otische vesikels en de overige delen van het mesoderm.

Wanneer alle aanhangsels van de neurale buis zijn doorgesneden, scheidt u de anterieure neurale buis van het embryo. Draag de geïsoleerde neurale buis vervolgens over naar een conische buis van 1,5 milliliter gevuld met 50% glycerol en PBS voor een behandeling van een nacht bij vier graden Celsius. Na een tweede behandeling van een nacht in 90% glycerol draagt u de neurale buis over naar een objectglas in een kleine hoeveelheid glycerol en gebruikt u wolfraamnaalden om de neurale buizen langs de dorsale en ventrale middellijnen te dissekeren.

Gebruik vervolgens versterkingsringen bedekt met een glazen dekglas om de twee zijden van de neurale buis te monteren in 90% glycerol en PBS. Om de bolletjes voor de inductie van het animal cap-explantaat voor te bereiden, gebruikt u een P200 micropipet om de helft van een aliquot BSA-behandelde harsbolletjes over te brengen naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Vervang vervolgens het steriele gedestilleerde water in de nieuwe buis door 200 microliters medium dat het experimentele molecuul van belang bevat, gedurende twee uur bij vier graden Celsius.

Breng aan het einde van de incubatie de blastula- of zeer vroege gastrula-embryo's over naar PBS met calcium en magnesium, aangevuld met 0,2% BSA. Knijp vervolgens, onder een stereomicroscoop, in het vitellijnvlies met de zijkant van één pincet en gebruik een tweede pincet om het vlies voorzichtig vanaf de vegetatieve zijde van het embryo af te pellen, waarbij u er op moet letten de animatorische zijde niet te beschadigen. Snijd daarna met een fijn pincet een klein vierkantje uit de animatorische pool van elk embryo.

Breng met een BSA-gecoate pipetpunt de doppen over naar individuele putjes van een Terasaki-multiwellplaat in 0,5X gemodificeerde Barth-zoutoplossing, waarbij de gepigmenteerde dierzijde in contact wordt gebracht met de ronde bodem van het putje. Selecteer met een P20-micropipet de donkerste roze kralen uit de behandelbuis en plaats één kraal op elke dop, waarbij pincetten worden gebruikt om de kralen in het midden van de doppen te centreren. Wanneer de laatste kraal is geplaatst, wordt de plaat op met water verzadigde papieren gezet en wordt de plaat afgedekt met een plastic container vóór de incubatie.

Om gedissocieerde en gereaggregeerde animal cap-explantaten voor te bereiden, isoleert u 15 tot 30 animal caps zoals zojuist gedemonstreerd. Gebruik een fijne pincet om een klein vierkant stukje weefsel uit de animalpolen te snijden. Verplaats de animal caps naar een met agarose gecoate put die is gevuld met calciumvrij Holtfreter-saline, met de gepigmenteerde zijde naar boven gericht.

Na enkele minuten moet desaggregatie waarneembaar zijn. Gebruik een fijne pincet om de gepigmenteerde lagen van de rest van het weefsel te scheiden. Gebruik vervolgens een P20-micropipet om het pigment te verwijderen.

Wanneer de meeste gepigmenteerde lagen zijn verwijderd en de cellen volledig zijn gedissocieerd, wordt de plaat rondgedraaid om de cellen te centreren en wordt een P1000 micropipet gebruikt om zoveel mogelijk van het medium te verwijderen, waarbij men erop let de cellen niet aan te raken. Voeg vervolgens één milliliter Holtfreter's zoutoplossing met calcium toe aan de put. Draag de gedissocieerde animal caps over naar een 1,5 milliliter buisje.

Nadat de cellen zijn gecentrifugeerd, gebruikt u een P1000-micropipet om het supernatant voorzichtig te verwijderen en de pellet opnieuw te suspenderen in 20 µL Holtfreters zoutoplossing met calcium. Laat de cellen drie tot zes uur bij kamertemperatuur reaggregeren. Voeg vervolgens langzaam één mL 3/4 NAM toe om de explantaten voorzichtig van de bodem van de buis los te maken en gebruik een plastic transferpipet om de explantaten over individuele ongecoate platen te verdelen.

Om animal cap-explantaten op neural plates van xenopus laevis te enten, worden eerst petri-schalen van 60 millimeter gecoat met 3% agarose en 3/4 NAM, waarin kleine gaatjes zijn gemaakt. Vervolgens worden vroege neurula-embryo's overgebracht naar PBS met calcium en magnesium, aangevuld met 0,2% BSA, voor verwijdering van het vitellijnmembraan. Vul daarna de met agarose gecoate dissectieschaal met verse 3/4 NAM en breng de embryo's met de dorsale zijde naar boven over naar de dissectieschaal.

Breng nu een gereaggregeerd explantaat van de animal cap over naar de dissectieplaat, waarbij het explantaat langzaam door zwaartekracht in het schaaltje zakt zodra de pipetpunt het oppervlak van het NAM heeft doorbroken. Gebruik vervolgens onder een stereomicroscoop afgeronde pincetten om het embryo op zijn plaats te houden, terwijl u met een wolfraamnaald een incisie in de neurale plaat maakt voor het explantaat. Snijd een klein stukje van het gereaggregeerde animal cap explantaat uit met behulp van afgeronde pincetten en een wenkbrauwmes.

Gebruik het weefselfragment om een stuk explantaat voor het transplantaat op maat te maken. Deze figuur toont flat-mounted anterieure neurale buizen van X laevis en X tropicalis, zoals zojuist gedemonstreerd in stadia 30, 32 en 35 na whole mount dubbele NC2-hybridisatie. Zoals in deze afbeeldingen te zien is, wordt de expressie van xenopus sonic hedgehog gedetecteerd in cellen die in contact staan met beads gedrenkt in geconditioneerd medium aangevuld met het eindterminus van het sonic hedgehog-gen, maar niet in cellen die in contact staan met beads behandeld met controlemedium.

Na dissociatie en reaggregatie, zoals zojuist gedemonstreerd, werden deze explantaten met geanterioriseerde animal cap-cellen gemengd met geanterioriseerde animal cap-cellen die Otx2 tot expressie brachten. Zoals waargenomen, segregeerden deze Otx2-exprimerende cellen niet van de niet-Otx2-exprimerende cellen. Beide celtypen mengden zich vrij door het gehele explantaat.

In tegenstelling hiermee vormden de multigene-expresserende cellen in explantaten waarin Otx2-expresserende cellen waren gemengd met BAR HL-2- en IRX3-expresserende cellen cohesieve vlekken die zich niet uniform verspreidden binnen het geaggregeerde explantaat. Wanneer deze, zoals zojuist gedemonstreerd, werden gegraft in de anterieure neurale plaat van x laevis-embryo's, vertoonden gemengde explantaten bestaande uit cellen die BAR HL-2, Otx2 en IRX3 co-expresseren en gemengd waren met N-terminus sonic hedgehog-expresserende cellen endogene sonic hedgehog-expressie en segregeerden zij van de anterieure neurale epitheelcellen. Daarentegen, wanneer gemengde explantaten bestaande uit Otx2- en N-terminus sonic hedgehog-expresserende cellen in de neurale plaat van x laevis werden gegraft, vertoonden de gegrafte cellen noch sonic hedgehog-expressie, noch segregeerden zij van hun buren.

Zodra de techniek onder de knie is, kan het enten van het animal cap-explantaat op embryonale neurale platen in twee tot drie uur worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal geënte embryo's. Het is een zeer robuuste en zeer lonende techniek. Bij het uitvoeren van deze procedure is het van groot belang om uiterst voorzichtig te zijn met bacteriële en schimmelcontaminatie.

Na de transplantatieprocedures kunnen andere methoden, zoals whole mount in situ hybridisatie, worden uitgevoerd om het lot en het gedrag van de getransplanteerde cellen te volgen. De ontwikkelingsprogramma's die ten grondslag liggen aan de organogenese van de neurale buis zijn grotendeels geconserveerd, vooral bij gewervelden. Daardoor heeft informatie verkregen bij amfibieën ons begrip van de cellulaire en moleculaire processen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van gewervelden vergroot.