Name: Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-11T10:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Leer de fabricage en assemblage van modulaire hydrogel sheets voor 3D celcultuur in weefselengineering. Deze kosteneffectieve methode creëert gecontroleerde cellulaire micro-omgevingen voor verbeterde biologische studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door een National Leading Research Laboratory Program (Grant NRF-2013R1A2A1A05006378) via de National Research Foundation of Korea, gefinancierd door het Ministerie van Wetenschap, ICT en Toekomstplanning. De auteurs erkennen ook een KAIST Systems Healthcare Program.

1. Voorbereiding van de micropatterned Vormen en Hydrogelen <ol><li> Het gewenste micro-schaalpatronen via SU-8 op het oppervlak van een siliciumwafel via een standaard tweestaps fotolithografietechniek 15,17 PDMS mallen voor het gieten. De getoonde voorbeeld wordt een lever melkklier-achtige mesh patroon (Figuur 1). </li><li> Weeg PDMS en een hardingsmiddel oplossing met een verhouding van 1: 5 (dat wil zeggen 12,5 g PDMS en 2,5 g hardingsmiddel). </li><li> Meng 15 g van de oplossing grondig ontgas de bellen in een vacuümkamer, en vervolgens verspreid de gemengde oplossing op een micropatterned oppervlak van de siliciumwafel gelijkmatig bij een folie gegoten schotel. </li><li> Plaats de siliciumwafel op een 65 ° C verwarmde plaat gedurende 90 minuten op een vlak oppervlak aan het PDMS harden. </li><li> Verwijder de uitgeharde PDMS van het gietstuk schaal en de siliciumwafel. </li><li> Snijd de randen van de PDMS en plaats het op een 100-mm diameter petrischaal metde micropatterned kant naar boven. </li><li> Was de micropatterned uitgeharde PDMS op de petrischaal met behulp van 70% ethanol en gedestilleerd water voor de primaire sterilisatie. Vervolgens volledig gedurende 10 min drogen in een oven bij 65 ° C. </li><li> Los op en meng O / N 3 g poedervormig ionogene oppervlakteactieve stof in 100 ml gedestilleerd water, waardoor een 3% (w / v) bekledingsoplossing. </li><li> Plaats de micropatterned PDMS mallen in een plasma schoonmaken en hen 1 min (85 W, 0,73 mbar) op een hydrofiel oppervlak te creëren, de toevoeging van waterige vloeistoffen te vergemakkelijken. Vervolgens laag het oppervlak van het PDMS met 100 ml surfactansoplossing ten minste 3 uur (ORO / N) met een laboratorium rocker. </li><li> Was de surfactantoplossing van de PDMS mallen en volledig drogen in een oven bij 65 ° C gedurende 10 min. Vervolgens steriliseren elk micropatterned vorm door blootstelling aan ultraviolet (UV) straling dan 30 min. </li></ol> 2. Bereid de celsuspensie in een Hydrogel Precursor <ol><li> Naarbereiden hydrogel voorloper los 0,1 g natriumalginaat poeder in 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), waardoor een 1% (w / v) alginaat precursor. Om het poeder volledig op te lossen, broeden en meng ze O / N. </li><li> Filtreer de oplossing door een 0,22 urn filter verbonden met een injectiespuit 1 ml. </li><li> Cultuur van de HepG2-cellen in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine op een gebruikelijke weefselkweekschaal tot 70% - 80% confluentie in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C . </li><li> Was de cellen eenmaal met behulp PBS, en vervolgens trypsinize ze door toevoegen van 1 ml 0,05% trypsine-EDTA gedurende 4 min in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. Centrifugeer de geoogst uit de kweekschaal bij 250 xg gedurende 3 min en resuspendeer gebruik 1 ml PBS na verwijdering van de supernatant cellen. </li><li> Tel het aantal losse cellen verdeeld in PBS met gebruikmaking van een automatische celoogsterteller. </li><li> Na centrifugatie bij 250 xg gedurende 3 min en PBS verwijderen, voeg 1 ml van de 1% (w / v) natriumalginaat oplossing voor de resterende celpellet en meng zachtjes met pipetteren. De uiteindelijke zaaidichtheid van de cellen moet 5 x 10 6 - 10 7 cellen / ml. Incubeer de cellen / hydrogel suspensie in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. </li></ol> 3. Laden en verknoping van Cell / Hydrogel Suspension <ol><li> Ontbinden 1,47 g calciumchloride uitdrogen in 100 ml van DDH 2 O tot een verknopingsreagens produceren (dat wil zeggen, 100 mM CaCl2 · 2 H 2 O in DDH 2 O). </li><li> Spoel de binnenkant van een luchtbevochtiger met ultrasone transducer met 70% ethanol, en vul het met 200 ml verknopingsreagens. De luchtbevochtiger is 110 mm breed, 300 mm lang en 170 mm diep (dat wil zeggen, 110 mm x 300 mm x 170 mm (B x H x D)). </li><li> Plaats de micropatterned PDMSmatrijzen in een plasma schoner en reinigen gedurende 1 minuut bij 85 W met een hydrofiel oppervlak te creëren. </li><li> Geleidelijk belasting 7,2 gl van de goed gemengde cellen / hydrogel suspensie aan de rand van de micropatroon in de matrijs. De getoonde voorbeeld wordt een lever melkklier-achtige mesh patroon (Figuur 1). Het volume van de suspensie hangt af van het topografisch patroon. </li><li> Gelering van de cel / hydrogel vering te bereiken, zet de luchtbevochtiger en controleer of de luchtbevochtiger produceert een nevel van de verknopingsreagens. Spuit de verknopingsreagens op de hydrogel voorloper van 5 min, die het topografisch oppervlak van het PDMS vormen binnen een bereik van 5 cm. Opmerking: Afstanden langer en korter dan 5 cm zouden onvolledig en ongelijk geleren, respectievelijk. Controleer of de bevochtiger een sproei snelheid van 250 ml / uur, produceren 20 ml nevel van de verknopingsreagens in 5 min. </li><li> Na de cross-linking proces, schakelt de bevochtiger en vul de PDMS molds met PBS. </li></ol> 4. Behandeling van Single Modulaire Hydrogel Sheets <ol><li> Losmaken elke geharde hydrogel vel uit de micropatterned mallen via pipetteren PBS zachtjes rond de hydrogel plaat met behulp van een 200 ul pipet tip. </li><li> Pick-up elke zwevende hydrogel plaat met behulp van een end-cut 1000 ul pipetpunt einde. Elke lever lobule-achtige mesh hydrogel plaat heeft afmetingen van 8 mm x 8,7 mm, en wees 100-200 micrometer dik. </li><li> Breng een enkele laag van de hydrogel plaat in 1 ml DMEM in een 12-well plaat, en de cultuur van de cellen in vitro in een zwevende wijze met de hydrogel construct als componenteenheid in de 12-well plaat gedurende een week in een 5 % CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. Wisselen het kweekmedium om de andere dag. </li></ol> 5. Montage van multi-layered Hydrogel Sheets <ol><li> Herhaal stap 1,1 tot 1,5 op een PDMS frame met afmetingen van 18 mm x 18 mm x 4 mm produceren (B xH x D), en die 170 urn hoog zuil structuren ten het onderoppervlak. Gebruik 42 g van het mengsel van PDMS en verharder, met dezelfde verhouding als in stap 1,2. Plaats een gespecialiseerde polycarbonaat schimmel op het silicium wafer voor het PDMS frame een interieur frame met afmetingen van 8 mm x 9 mm x 2 mm te maken (B x H x D). </li><li> Steriliseer de PDMS frame 180 um porie nylon filterpapier ondergedompeld in gedestilleerd water en pincet in een autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 ° C. </li><li> Plaats het gesteriliseerde PDMS lijst op een kwart van een stuk nylon filterpapier (met een diameter van 5 cm) in een 60-mm petrischaal. </li><li> Breng een modulair vel hydrogel in het inwendige van het frame met behulp van een PDMS-end cut 1000 ul pipetpunt. De hydrogel platen gebruikt voor montage worden gekweekt gedurende ten minste één dag nadat ze werden gefabriceerd. </li><li> Lijn de rand van elke modulaire hydrogel blad met de PDMS frame met behulp van een lege 200 ul pipetpunt. </li><li> Herhaal de stappen 5.4 en 5.5 met behulp van modulaire hydrogel sheets om een ​​stapel te vormen 4 - 6 lagen. </li><li> Verwijder het kweekmedium door uitstromende het door de zuil structuren op de bodem van de PDMS frame. Voeg vervolgens 2 pl alginaatoplossing (2% w / v) bij een hoek van de meerlaagse constructie. </li><li> Spuit een nevel van de verknoping reagens voor 30 sec op de meerlaagse constructie aan de randen van elke laag vast met die van een andere. Gebruik 2 ml nevel van de verknopingsreagens (bij sproeisnelheid van 250 ml / uur). </li><li> Spoel de multi-layered constructie voorzichtig met 400 ul DMEM en verwijder het PDMS frame met behulp van een pincet. </li><li> Maak de multi-layered constructie van de filter papier door het voorzichtig af te vegen met een mobiele tillift na de toevoeging van 4 ml DMEM. </li><li> Breng de meerlaags construct een 6-wells plaat met 3 ml DMEM gebruik filtreerpapier en cultuur van de cellen in vitro op een zwevende wijze, met de hydrogel construct alseen meerschalige cellulaire scaffold in de 6-well plaat gedurende een week in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. Wisselen het kweekmedium om de andere dag. </li></ol>

<ol><li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (Supplement), 18-23 (2012).</li>
<li>Lan, S., Starly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+based+3D+hydrogels+as+an+in+vitro+co-culture+model+platform+for+the+toxicity+screening+of+new+chemical+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).</li>
<li>Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+bioengineered+tumors+based+on+collagen+I+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).</li>
<li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li>
<li>Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molding+of+hydrogel+microstructures+to+create+multiphenotype+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays.</a> Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Hydrogel+Capable+of+Cell+Preservation+without+Perfusion+Culture+under+Cell-Based+Assay+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions.</a> Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).</li>
<li>Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+generation+of+hydrogel+beads+and+encapsulation+of+biological+materials+using+a+microfluidic+droplet-merging+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel.</a> Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).</li>
<li>Lee, D. H., Lee, W., E, U. m, Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbridge+structures+for+uniform+interval+control+of+flowing+droplets+in+microfluidic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 034117(2011).</li>
<li>Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+heterogeneity+in+the+lipid+content+of+single+green+microalgae+in+alginate+hydrogel+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).</li>
<li>Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+chemically+and+physically+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+guided+cell+growth+and+networking%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking.</a> Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+formation+of+heterotypic+hepatic+micro-organoids+in+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+long-term+preservation+of+liver-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions.</a> Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+Biocompatible+Fabrication+of+Chemically+Sol%E2%88%92Gel+Transitional+Hydrogel+Free-Standing+Microarchitectures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol−Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures.</a> 12 (1), 14-18 (2011).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+hydrogel+biopaper+for+patterned+3D+cell+culture+and+modular+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction.</a> Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).</li>
<li>Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+effect+of+the+hydrogel+grid+structure+on+in+vitro+formation+of+homogeneous+MIN6+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters.</a> Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).</li>
<li>Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+modular+tissue+construct+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).</li>
<li>Choi, S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+photolithography+to+fabricate+multilevel+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels.</a> Biomicrofluidics. 4 (4), 046503(2010).</li>
<li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+formation+and+collagen-alginate+composite+encapsulation+of+pancreatic+islet+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids.</a> Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).</li>
<li>Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A microfluidic biomaterial.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (40), 13788-13789 (2005).</li>
<li>Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Microfluidic scaffolds for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol verschaft een eenvoudige werkwijze voor het vervaardigen van modulaire hydrogel vellen en assembleren 3D cellulaire scaffolds vormen. Om duidelijke patroon structuren alginaat construeren korte tijd moeten we een verknoping proces dat voldoende stijf structuren kunnen creëren om het complex micropatterns houden van de matrijs, alsmede de levensvatbaarheid en metabolisme cellen behouden identificeren. We hebben een verknoping proces ontwikkeld met een sol-gel overgang naar een ve...

Hydrogels zijn bijzonder veelbelovend biomaterialen en waarschijnlijk belangrijke in basisbiologie, farmacologische assays en geneesmiddel. 1 Biofabrication van hydrogel gebaseerde cellulaire constructen is voorgesteld om het gebruik van dierproeven verminderen, 2,3 vervangt transplanteren weefsels, 4 en verbeteren celgebaseerde proeven. 5,6 waterbevattende (hydro-) visco-elastische stoffen (gels) maken een groot aantal cellen worden ingekapseld en in een steigerstructuur de 3D ​​cellulaire micro-omgeving regelen. In combinatie met de begeleiding van microfluïdische of micropatterning technologieën, kan de geometrie van de hydrogel constructen nauwkeurig worden gecontroleerd op het celniveau. Tot op heden diverse vormen van hydrogels, waaronder deeltjes, 7 - 9 vezels, 10 - 12 en vellen, 13 - 15 zijn gebruikt als bouweenheden in bottom-up voorkomendpijn aan de fabricage van macro-schaal meercellige architecturen. Zowel hydrogel gebaseerde deeltjes en vezels zijn gemakkelijk en snel vervaardigd voor toepassingen microschaal cellulaire omgevingen met fluïde besturing via microfluïdische inrichtingen. Aangezien de basiseenheden van gekweekt weefsel, zou ingewikkeld om te herschikken en hun volume macroschaal constructen vergroten. 16 Het is moeilijker om macro-schaal constructen bereiken dan micronafmetingen basismodules te produceren. Velvormige eenheden van hydrogel gebaseerde constructen kunnen worden gebruikt om het volume van de steigers te verhogen via een eenvoudige montage. Als gevolg daarvan, gestapelde lagen van hydrogel platen bieden niet alleen een volumetrische toename ook een geometrische extensie in een 3D-ruimte. We hebben eerder vermeld een werkwijze voor het vervaardigen micropatterned hydrogel sheets, 13 - 15 met hun constructie in multi-layEred cellulaire architecturen. De techniek maakt complex micropatterning en modulaire opbouw van cellulaire constructen via een stapeling proces van meerlaagse structuren. Door de fabricage van gestapelde modulaire hydrogel platen, die micropatterned kan een 3D celcultuur systeem met gecontroleerde macroschaal cellulaire micromilieu gerealiseerd. Deze video protocol beschrijft een eenvoudige maar krachtige fabricagemethode die gebruikt kan worden om modulaire hydrogel vellen construeren op basis van de menselijke lever carcinoom cellijn (HepG2). We tonen hierin eenvoudige manipulatie van deze gevormde modulaire hydrogel platen en hun montage in een multi-gelaagde structuur.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Poederachtige niet-ionogene oppervlakteactieve stof&nbsp;</td></tr><tr><td>Alginic acid sodium salt, low viscosity</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic humidifier</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>Gemodificeerd apparaat, Maximale verstuikingssnelheid: 250 ml/uur</td></tr><tr><td>Nylon net filter hydrofilic, 180 &mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate mold</td><td></td><td></td><td>Aangepaste mal voor het maken van een PDMS frame patroon</td></tr></tbody></table>

bouw van modulaire hydrogel sheets voor micropatterned macro-schaal 3d cellular architecture

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels kunnen worden gevormd op micro-schaal met behulp microfluidic of micropatterning technologieën om een in vivo-achtige drie-dimensionale (3D) weefsel geometrie te verschaffen. Het resulterende 3D-hydrogel gebaseerde cellulaire constructen geïntroduceerd als alternatief voor dierproeven voor geavanceerde biologische studies, farmacologische testen en orgaantransplantatie toepassingen. Hoewel hydrogel gebaseerde deeltjes en vezels gemakkelijk kunnen worden vervaardigd, is het moeilijk om ze te manipuleren voor weefselreconstructie. In deze video, beschrijven we een fabricage methode voor micropatterned alginaat hydrogel lakens, samen met hun vergadering van een macro-schaal 3D celcultuur met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving vormen. Met een nevel vorm van calcium geleermiddel, worden dunne platen hydrogel gemakkelijk gemaakt met een dikte in het bereik van 100 - 200 urn en met nauwkeurige micropatterns. Cellen kunnen daarna worden gekweekt met geometrische leiding van de hydrogel vellenvrijstaande omstandigheden. Bovendien kan de hydrogel vellen gemakkelijk worden gemanipuleerd met een micropipet met een end-cut tip en in meerlagige structuren kan worden samengesteld door ze te stapelen met een patroon polydimethylsiloxaan (PDMS) frame. Deze modulaire hydrogel platen, die kunnen worden vervaardigd met behulp van een gemakkelijk proces hebben potentiële toepassingen in vitro assays geneesmiddelen en biologische studies, met inbegrip van functionele studies van micro- en macrostructuur en weefselreconstructie.

We hebben de fabricage en manipulatie van vrijstaande cellulaire hydrogel bladen beschreven. Zoals getoond in figuur 1, we gefabriceerd micropatterned PDMS mallen en celbevattende hydrogel werd op het hydrofiele oppervlak van deze schimmels en geladen verknoopt met een luchtbevochtiger tot een aërosol nevel geleermiddel genereren. Na afgifte uit de mallen, HepG2-cellen werden gekweekt in vrijstaande hydrogel platen met verschillende patronen (figuur 2). ...

We beschrijven de fabricage van microgepatternde hydrogelvellen met behulp van een eenvoudig proces, dat kan worden geassembleerd en gemanipuleerd in een zelfstandige vorm. Met behulp van deze modulaire hydrogelvellen kan een eenvoudig macro-geschaald 3D-celkweeksysteem worden gegenereerd met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving.

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Het algemene doel van deze procedure is om de eenvoudige fabricage, manipulatie en assemblage van modulaire hydrogelvellen voor een 3D-celcultuursysteem te demonstreren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van tissue engineering, zoals de vraag hoe er functionele engineered weefsels met gecultiveerde micro-omgevingen kunnen worden gecreëerd die meer lijken op in vivo-omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat cellulaire hydrogelconstructen kunnen worden gegenereerd zonder dat dit gepaard gaat met aanzienlijke kostenverhogingen.De 3D-celkweekcondities zijn afhankelijk van elk modulair hydrogelvel. De implicaties van deze techniek reiken tot verbeterde celgebaseerde assays en biologische studies, omdat de techniek diverse geometrieën en samenstellingen van 3D cellulaire micro- en macro-omgevingen kan bieden. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in in vitro celgebaseerde assays, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals een transplanteerbaar steunstructuur (scaffold) van een 3D-weefselmodel.Begin met het produceren van de gewenste microscale patronen met behulp van standaard fotolithografische technieken. Het voorbeeld in deze video maakt gebruik van een mazenpatroon dat lijkt op een leverlobulus, zoals hier getoond. Weeg vervolgens 2,5 gram PDMS en 2,5 gram van de hardeningsoplossing af en meng de componenten grondig met elkaar.Ontgas de oplossing in een vacuümkamer en verdeel de gemengde oplossing vervolgens gelijkmatig over het micropatroonoppervlak van de siliciumwafer binnen een folie-gietbakje. Hard vervolgens de PDMS uit door het bakje gedurende 90 minuten op het vlakke oppervlak van een warmteplaat van 65 °C te plaatsen. Verwijder na uitharding de PDMS uit het gietbakje en pel deze voorzichtig los van de siliciumwafer.Snijd de randen van de PDMS weg en plaats het gepatronde gedeelte op een Petrischaal met een diameter van 100 millimeter, zodanig dat de zijde met het micropatroon naar boven is gericht. Was vervolgens de micropatroon-PDMS met 70% ethanol, gevolgd door gedestilleerd water, voor de primaire sterilisatie. Droog de opstelling daarna gedurende 10 minuten volledig in een oven bij 65 °C.Plaats vervolgens de micropatroon-PDMS-mal in een plasmareiniger en reinig deze gedurende één minuut om een hydrofiel oppervlak te creëren. Dit zal het laden van waterige vloeistoffen vergemakkelijken. Bedek vervolgens het oppervlak van de PDMS met 100 milliliters van de surfactantoplossing die vermeld staat in de materialentabel.Incubeer de monsters op een laboratoriumschudder gedurende ten minste drie uur. Was vervolgens de surfactantoplossing uit de PDMS-vormen met steriel water en droog deze volledig in een oven bij 65 °C gedurende 10 minuten. Steriliseer daarna elke micropatroonvorm door deze 30 minuten bloot te stellen aan ultraviolette straling.Begin met het kweken van HepG2-cellen met behulp van standaardtechnieken. Wanneer de cellen 70% tot 80% confluent zijn, worden de cellen eenmaal gewassen met PBS. Oogst vervolgens de cellen door één milliliter 0,5% trypsine-EDTA toe te voegen en deze gedurende vier minuten te incuberen bij 37 °C.Zodra de cellen zijn losgekomen, worden deze verzameld in een centrifugebuis en gecentrifugeerd bij 250 g gedurende drie minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen vervolgens in één milliliter PBS. Tel het aantal individueel verdeelde cellen in PBS met behulp van een automatische celteller.Pellet de cellen vervolgens opnieuw bij 250 g gedurende drie minuten. Verwijder het PBS-supernatans en voeg voldoende een procentige natriumalginaatoplossing toe aan de cellen, zodat de uiteindelijke zaaidichtheid tussen de vijf en tien miljoen cellen per milliliter ligt. Meng de celoplossing voorzichtig met een pipet en incubeer de celhydrogel-suspensie vervolgens in een bevochtigde incubator met vijf procent CO2 bij 37 graden Celsius.Terwijl de cellen incuberen, plaatst u de micropatroon PDMS-vormen in een plasmareiniger en reinigt u deze gedurende één minuut bij 85 watt om een hydrofiel oppervlak te creëren. Meng de cel-hydrogelsuspensie door voorzichtig met de pipet op en neer te zuigen en breng vervolgens gestaag 7,2 µL van de suspensie aan aan de rand van het micropatroon in de vorm. Laat de cel-hydrogelsuspensie vervolgens geleren door met de bevochtiger een nevel van het cross-linking reagens te produceren met een snelheid van 250 mL per uur en deze vijf minuten lang op de hydrogel-precursor te spuiten.Zorg ervoor dat deze procedure het topografische oppervlak van de PDMS-mal beslaat binnen een bereik van vijf centimeter. Schakel na het crosslinking-proces de bevochtiger uit en vul de PDMS-mal met PBS. Gebruik een 200-microliter pipette om voorzichtig PBS rond de rand van de uitgeharde hydrogel-sheets aan te brengen om elke hydrogel los te maken.Pak vervolgens elke drijvende hydrogelplaat op met een afgeknipt pipetpuntje van 1 000 µL. Breng elke hydrogelplaat over naar individuele putjes van een 12-wellplaat die 1 mL voorverwarmd DMEM bevat, zodat ze op het oppervlak van het medium drijven. Kweek de cellen op deze manier gedurende één week, waarbij het kweekmedium om de dag wordt ververst.Produce vervolgens een PDMS-frame dat aan het onderste oppervlak pilaarstructuren van 170 micron hoog bevat, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats tijdens de fabricage een gespecialiseerde polycarbonaatmal op de siliciumwafer voor het PDMS-frame om een intern frame te creëren met een breedte van acht millimeter, een hoogte van negen millimeter en een diepte van twee millimeter. Plaats het gesteriliseerde PDMS-frame op een kwart van een stuk nylon filterpapier in een Petrischaal van 60 millimeter.Haal de hydrogelvellen uit de incubator en breng het eerste van de modulaire hydrogelvellen met een afgeknipt 1.000-microliter pipetpuntje over naar de binnenzijde van het PDMS-frame. Lijn de rand van het modulaire hydrogelvel uit met het PDMS-frame met behulp van een leeg 200-microliter pipetpuntje. Herhaal dit proces met extra hydrogelvellen totdat een stapel van vier tot zes lagen is bereikt.Verwijder vervolgens het kweekmedium door het door de pilaarstructuren aan de onderkant van het PDMS-frame te laten stromen. Voeg daarna twee microliters van een twee procent alginaatoplossing toe aan één hoek van het meerlaagse construct. Gebruik een bevochtiger om een nevel van het cross-linking reagens met een snelheid van 250 milliters per uur gedurende dertig seconden op het meerlaagse construct te spuiten om de randen van elke laag aan elkaar te bevestigen.Spoel vervolgens het meerlaagse construct voorzichtig met 400 µL DMEM en verwijder het PDMS-frame met een pincet. Voeg daarna nog eens vier mL DMEM toe. Los het meerlaagse construct los van het filterpapier door het voorzichtig af te vegen met een cell lifter en gebruik vervolgens filterpapier om het over te brengen naar een six-well plate met drie mL DMEM.Kweek de cellen in een drijvende vorm met een hydrogelconstruct als een multi-schaal cellulaire steiger in de zes-wells plaat gedurende ten minste één week. Verschoon het kweekmedium om de dag. Het resultaat van een laag-voor-laag assemblage van hydrogelvellen met micropatronen die lijken op leverlobuli wordt hier getoond, waarbij groen fluorescerende menselijke levercarcinoomcellen en rood fluorescerende NIH-3T3 fibroblasten samen in co-kweek zijn gegroeid op een gecombineerd gaas.Met de hier gepresenteerde techniek kunnen veel patroonvariaties worden gecreëerd, waaronder hexagonale pilaren, dunne mazen, volledige arrays en meerdere microkam-achtige microvezels in de vorm van een dun hydrogelconstruct van ongeveer 100 tot 200 micrometers. Deze structuren bieden een rijke 3D-kweekomgeving voor veel verschillende celtypen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellulaire hydrogelvellen kunt creëren voor het bottom-up engineeren van in vivo-achtige 3D-kweeksystemen.

construction-modular-hydrogel-sheets-for-micropatterned-macro-scaled

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Eenvoudige technieken worden beschreven voor de snelle productie van microfabricated neurale cultuur systemen met behulp van een digitale microspiegeltjes voor dynamische masker projectie lithografie op regelmatige celcultuur substraten. Deze cultuur systemen kunnen meer representatief zijn voor natuurlijke biologische architectuur, en de beschreven technieken kan worden aangepast voor tal van toepassingen.

Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.

Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

Dit artikel introduceert een eenvoudige benadering aan het verstrekken van niet-continu verlopende statische spanningen op een concentrische cel-beladen hydrogel te reguleren celuitlijning voor weefselengineering.

Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel

We beschrijven een sequentieel proces voor lichtgemedieerde vorming en daaropvolgende biochemische patroonvorming van synthetische hydrogelmatrices voor toepassingen in driedimensionale celcultuur. De constructie en modificatie van hydrogels met cytocompatibele fotoclick-chemie wordt gedemonstreerd. Bovendien worden eenvoudige technieken gepresenteerd om patronen te kwantificeren en observeren en de celviabiliteit binnen deze hydrogels te bepalen.

Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications

Dit rapport beschrijft een eenvoudige, gemakkelijk uit te voeren techniek, met behulp van lagedrukvacuüm, om microfluïdische kanalen te vullen met cellen en substraten voor biologisch onderzoek.

Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Verschillende methoden voor het manipuleren van driedimensionale architectuur in hydrogels op basis van eiwitten zijn hier geëvalueerd met betrekking tot de eigenschappen van het materiaal. De macroporeuze netwerken zijn matiemaatschappij met een peptide cel-lijm, en hun haalbaarheid in celkweek wordt geëvalueerd met behulp van twee verschillende model cellijnen.

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Presenteren we een procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen van een herhaalbare patroonformatie. Een kubieke apparaat met twee verschillende hydrogels wordt gebruikt om verschillende richtingen imaging voor weefsel patroonformatie.

Beheer van de clusters van de eerste 3D-cel in een hybride Gel kubus apparaat voor herhaalbare patroon formaties

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Microgelstaven met complementaire reactieve groepen worden geproduceerd via microfluïdica met het vermogen om in waterige oplossing met elkaar te verbinden. De anisometrische microgels binden en verbinden zich tot stabiele constructies met grotere poriën in vergelijking met op bolvormige systemen gebaseerde systemen. Microgels gemodificeerd met GRGDS-PC vormen macroporeuze 3D-constructies die kunnen worden gebruikt voor celkweek.

Onderling verbonden macroporeuze 3D-steigers van Microgel-staven

Dit werk beschrijft een protocol voor de vrije vorm ingebed 3D-printen van neurale stamcellen in zelfherstellende gloeibare deeltjes-extracellulaire matrixcomposieten. Het protocol maakt het mogelijk om met hoge getrouwheid patronen te maken van onderling verbonden menselijke neurale weefselconstructies.

Microgel-extracellulaire matrixcomposietondersteuning voor het ingebed 3D-printen van menselijke neurale constructies

Leer de fabricage en assemblage van modulaire hydrogel sheets voor 3D celcultuur in weefselengineering. Deze kosteneffectieve methode creëert gecontroleerde cellulaire micro-omgevingen voor verbeterde biologische studies.

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Meer video's verkennen