Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture
January 11th, 2016
We beschrijven de fabricage van microgepatternde hydrogelvellen met behulp van een eenvoudig proces, dat kan worden geassembleerd en gemanipuleerd in een zelfstandige vorm. Met behulp van deze modulaire hydrogelvellen kan een eenvoudig macro-geschaald 3D-celkweeksysteem worden gegenereerd met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving.
Het algemene doel van deze procedure is om de eenvoudige fabricage, manipulatie en assemblage van modulaire hydrogelvellen voor een 3D-celcultuursysteem te demonstreren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van weefselengineering, zoals hoe meer in vivo-achtige functionele geëngend weefsels met gekweekte micro-omgevingen kunnen worden gemaakt. Het grote voordeel van deze techniek is dat cellulaire hydrogelconstructen kunnen worden gegenereerd zonder enige kostenpost.
De 3D-celcultuurcondities zullen afhangen van elke modulaire hydrogelvel. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar verbeterde celgebaseerde assays en biologische studies omdat de techniek verschillende geometrieën en samenstelling van 3D-cellulaire micro- en macro-omgevingen kan bieden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in in vitro celgebaseerde assays, kan deze ook worden toegepast op een ander systeem, zoals een transplanteerbaar scaffold van 3D-weefselmodel.
Begin met het produceren van de gewenste microschaalpatronen met behulp van standaard fotolitografietechnieken. Het voorbeeld dat in deze video wordt getoond, zal een leverlobule-achtig gaaspatroon gebruiken zoals hier getoond. Weeg vervolgens 2,5 gram PDMS en 2,5 gram van de uithardingsmiddeloplossing af en meng de componenten grondig door elkaar.
Ontgast de oplossing in een vacuümkamer en verspreid vervolgens de gemengde oplossing gelijkmatig op het micropatroonoppervlak van de siliciumwafer binnen een foliegietvorm. Genees vervolgens de PDMS door de schaal op het platte oppervlak van een verwarmde plaat van 65 graden Celsius te plaatsen gedurende 90 minuten. Eenmaal genezen, verwijdert u de PDMS uit de gietvorm en verwijdert u deze voorzichtig van de siliciumwafer.
Snijd de randen van de PDMS weg en plaats het bepatroonde gedeelte op een 100 millimeter diameter Petri-schaal zodat de micropatroonzijde naar boven wijst. Was vervolgens de micropatroon PDMS met 70%ethanol, gevolgd door gedistilleerd water, voor primaire sterilisatie. Droog daarna de opstelling volledig gedurende 10 minuten in een oven bij 65 graden Celsius.
Plaats vervolgens de micropatroon PDMS mal in een plasmareiniger en reinig ze gedurende één minuut om een hydrofiel oppervlak te creëren. Dit zal het laden van waterige vloeistoffen vergemakkelijken. Bekleed vervolgens het oppervlak van de PDMS met 100 milliliter van de oppervlakteactieve stoffenoplossing vermeld in de tabel van materialen.
Incubeer de monsters op een laboratoriumrotator gedurende ten minste drie uur. Was vervolgens de oppervlakteactieve stoffenoplossing van de PDMS mallen met steriel water en droog ze volledig in een oven bij 65 graden Celsius gedurende 10 minuten. Steriliseer vervolgens elke micropatroon mal door deze gedurende 30 minuten bloot te stellen aan ultraviolette straling.
Begin met het kweken van hepg2-cellen met behulp van standaardtechnieken. Zodra de cellen 70%tot 80%confluent zijn, was de cellen eenmaal met PBS. Haal vervolgens de cellen binnen door een milliliter 05%trypsine edta toe te voegen en ze gedurende vier minuten bij 37 graden Celsius te incuberen.
Eenmaal losgekoppeld, verzamel de cellen in een centrifugeerbuis en pellet ze bij 250 g gedurende drie minuten. Verwijder het supernatant en suspendeer vervolgens de cellen in een milliliter PBS. Tel het aantal enkele verdeelde cellen in PBS met behulp van een geautomatiseerde celteller.
Pellet vervolgens de cellen opnieuw bij 250 g gedurende drie minuten. Verwijder het PBS-supernatant en voeg voldoende van een een procent natriumalginaatoplossing toe aan de cellen, zodat de uiteindelijke zaaddichtheid tussen de vijf en tien miljoen cellen per milliliter is. Meng de celhydrogelsuspensie voorzichtig met een pipet en incubeer vervolgens de celhydrogelsuspensie in een met vijfenveertig procent CO2 bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius.
Terwijl de cellen incuberen, plaats de micropatroon PDMS mallen in een plasmareiniger en reinig ze gedurende één minuut bij 85 watt om een hydrofiel oppervlak te creëren. Meng de celhydrogelsuspensie door voorzichtig met een pipet op en neer te pipetteren en laad vervolgens 7,2 microliters van de suspensie aan de rand van het micropatroon in de mal. Bepaal vervolgens de celhydrogelsuspensie door een mist van het verknopingsreagens met de bevochtiger te produceren met een snelheid van 250 milliliter per uur en deze gedurende vijf minuten op het hydrogelvoorloper te spuiten.
Zorg ervoor dat deze procedure het topografische oppervlak van de PDMS mal binnen een bereik van vijf centimeter bedekt. Na het verknopingsproces, zet de bevochtiger uit en vul de PDMS mal met PBS. Gebruik een 200-microliter pipet om PBS voorzichtig rond de rand van de geharde hydrogelvellen te spuiten om elk van de hydrogels los te maken.
Pak vervolgens elk zwevende hydrogelvel op, met behulp van een eindgesneden, 1.000-microliter pipettip. Breng elk blad van de hydrogel over in afzonderlijke putjes van een 12-putjesplaat die een milliliter voorverwarmd DMEM bevat, zodat ze op het oppervlak van het medium zweven. Kweek de cellen op deze manier gedurende een week, waarbij het kweekmedium om de andere dag wordt ververst.
Maak vervolgens een PDMS-frame, dat 170-micron hoge pilaarstructuren aan de onderkant bevat, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Tijdens de fabricage, plaats een gespecialiseerde polycarbonaat mal op de siliciumwafer voor het PDMS-frame om een binnenframe te creëren met een breedte van acht millimeter, een hoogte van negen millimeter en een diepte van twee millimeter. Eenmaal gesteriliseerd, plaats het PDMS-frame op een kwart van een stuk nylon filterpapier in een 60-millimeter Petri-schaal.
Verwijder de hydrogelvellen uit de incubator en breng de eerste van de modulaire hydrogelvellen over in het binnenste van het PDMS-frame met behulp van een eindgesneden 1.000-microliter pipettip. Lijn de rand van de modulaire hydrogelvel uit met het PDMS-frame met behulp van een lege 200-microliter pipettip. Herhaal dit proces met aanvullende hydrogelvellen totdat een stapel van vier tot zes lagen is
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het fabriceren van modulaire hydrogelvellen die kunnen worden gemanipuleerd en samengesteld in een 3D-celcultuursysteem. De techniek maakt de creatie van gecontroleerde cellulaire micro-omgevingen mogelijk, wat vooruitgang in weefselengineering vergemakkelijkt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Weefselengineering
- Celcultuur
- Hydrogeltechnologie
Achtergrond
- Hydrogelvellen kunnen in vivo-omstandigheden nabootsen.
- 3D-celcultuursystemen zijn essentieel voor biologische studies.
- Modulaire ontwerpen maken aanpassing van cellulaire omgevingen mogelijk.
- Kosteneffectieve methoden zijn nodig in weefselengineering.
Doel van het onderzoek
- Om de fabricage van hydrogelvellen te demonstreren.
- Om hun toepassing in het creëren van functionele geëngineerde weefsels te verkennen.
- Om cel-gebaseerde tests en biologische studies te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van microgepatternde hydrogelvellen.
- Assembleren en manipuleren van hydrogelconstructies.
- Creatie van macro-geschalde 3D-celcultuursystemen.
- Aanpassing van hydrogelvellen voor specifieke cellulaire micro-omgevingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fabricage van modulaire hydrogelvellen.
- Bewezen vermogen om diverse 3D-cellulaire omgevingen te creëren.
- Mogelijke toepassingen in verbeterde biologische tests.
- Inzichten in in vitro cel-gebaseerde tests en transplanteerbare scaffolds.
Conclusies
- De methode biedt een kosteneffectieve aanpak voor weefselengineering.
- Modulaire hydrogelvellen kunnen de studie van cellulaire gedragingen verbeteren.
- Deze techniek kan leiden tot vooruitgang in de functionaliteit van geëngineerde weefsels.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Modular hydrogel sheet fabrication enables precise control over cellular microenvironments in 3D culture systems, supporting more physiologically relevant models for drug screening and mechanistic studies. This approach reduces reliance on animal testing by providing scalable, reproducible in vitro platforms for tissue-level functional assessments. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing systematic interrogation of tissue architecture effects on cellular behavior.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how tissue-level geometry influences cellular function and pathway activity in a controlled microenvironment.
- Operational Value: Provides a reproducible system for validating targets within complex 3D contexts that better reflect in vivo conditions.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking micro- and macrostructural features to phenotypic outcomes in disease-relevant models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, micropatterned hydrogel sheets with consistent thickness (100–200 µm) for reliable compound screening in 3D.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through modular assembly using PDMS frames, enabling scalable multi-layer constructs for high-content screening.
- Translational Value: Supports phenotypic screening in liver lobule-like architectures, improving relevance for hepatotoxicity and metabolic disease models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables co-culture of heterogeneous cell types (e.g., hepatocytes and fibroblasts) in spatially defined 3D arrangements to study intercellular signaling.
- Operational Value: Allows detachment and transfer of hydrogel constructs to multi-well plates for longitudinal culture and medium exchange, supporting preclinical-like workflows.
- Predictive Value: Provides a bridge from discovery to preclinical validation by modeling tissue-level organization and function in human-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where 3D microenvironmental control improves the translatability of cellular phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how tissue architecture modulates drug response and cellular phenotype in engineered microenvironments.
- Screening: Enables reproducible, quantitative readouts in 3D culture via standardized hydrogel sheet fabrication and assembly.
- Analytics: Generates measurable outputs such as layer-specific cell distribution and fluorescence signals for comparative condition analysis.
- Translational Research: Promotes continuity from discovery to preclinical by modeling tissue-scale organization relevant to human pathophysiology.
- Enterprise Reuse: Positions the hydrogel sheet platform as a reusable, adaptable system across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation through mechanistic de-risking of tissue-context effects on drug response.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via micropatterned sheets and mist-based crosslinking for uniform thickness and geometry.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing biological false positives through more predictive 3D models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on performance in complex, tissue-like microenvironments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photolithography, PDMS molding, and hydrogel crosslinking techniques.
- Depends on access to plasma cleaners, humidifiers, and precision liquid handling for mist-based gelation.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel composition, patterning, and assembly protocols for reproducibility.
- Involves adaptation considerations when extending the system to non-hepatic cell types or alternative micropatterns.
- Limited by the need for careful handling during sheet manipulation and assembly to prevent structural damage.
