Melk Collection in de rat met behulp van capillaire buizen en Schatting van melk vetgehalte Creamatocrit
16 december 2015
Melk is een primaire voedingsbron voor de pasgeborene. Analyse van melkcomponenten kan inzicht geven in maternale factoren die de gezondheid van het nageslacht beïnvloeden. Dit protocol beschrijft een handmatige methode voor het verzamelen van melkmonsters van de lacterende rat, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor verdere downstream-analyse.
Het algemene doel van deze procedure is om te beschrijven hoe u melk handmatig kunt verzamelen van een lacterende rat voor laboratoriumanalyse van de melksamenstelling. Deze methode kan worden gebruikt om sleutelvragen op het gebied van moeder- en kindgezondheid te beantwoorden, zoals hoe de voeding van de moeder de melksamenstelling kan beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden uitgevoerd door een enkele onderzoeker zonder gespecialiseerde vacuüm- of zuigapparatuur.
Nr. Om te beginnen, scheidt u de dam van haar jongen gedurende minimaal vijf minuten voorafgaand aan het melken. Verzamel vervolgens alle materialen die nodig zijn voor de melprocedure zoals hier getoond. Plaats vervolgens een absorberend werkblad op een verwarmde operatietafel of gebruik een aparte verwarmingspad om warmteverlies van de dam tijdens de melprocedure te voorkomen.
Controleer vervolgens het anesthesiesysteem om ervoor te zorgen dat het systeem voldoende zuurstof en iso fluorine heeft voorafgaand aan de procedure. Bevestig vervolgens de masker die zal worden gebruikt voor de initiële anesthesie-inductie aan de machine en plaats de onderhoudsmasker in de buurt. Open de zuurstoftank en stel de stroom in op één liter per minuut.
Schakel vervolgens de stroom van isof fluorine in en stel de stroom in op 5%Eenmaal verdoofd, schakel de dam over naar de onderhoudsmasker. Bevestig een voldoende niveau van anesthesie door te controleren op het ontbreken van een peesreflex. Plaats vervolgens de dam in een rugligging op de absorberende werkblad.
Verlaag de stroom van isof fluorine tot twee tot 3%Bewaak de dam voortdurend tijdens de procedure en pas de stroom van isof fluorine aan zoals nodig is om pijn en respiratoire depressie te voorkomen. Gebruik vervolgens een steriele alcoholdoek of reinigingspad om een flesje oxytocine te desinfecteren met behulp van een een milliliter spuit uitgerust met een 25 gauge naald, trek 0,1 milliliter oxytocine op. Steek vervolgens de naald in het onderste rechterkwadrant van de buik van de dam met de naald gericht naar het hoofd onder een hoek van 15 tot 30 graden, ongeveer 0,5 centimeter diep.
Trek terug op de plunjer om negatieve druk te creëren voorafgaand aan de injectie. Als er geen vloeistof wordt aangezogen, injecteer dan de oxytocine en gooi de naald en spuit onmiddellijk in een biogevaarcontainer. Wacht ongeveer vijf tot 15 minuten tot de oxytocine de melk heeft gestimuleerd.
Laat tijdens deze tijd de tets kiezen waaruit melk wordt verzameld. Gebruik trimmers om voorzichtig het haar rond de geselecteerde tets te verwijderen, aangezien haar moeilijkheden kan veroorzaken bij het verzamelen van monsters. Reinig vervolgens de tets met lauwwarm water.
Bereid ten minste twee sites voor, aangezien meer dan één site mogelijk is vereist voor het verzamelen van melk. Zodra de melk is afgegeven, knijpt u zachtjes in de basis van de Tet om melk handmatig te verdrijven. Voor verzameling, verzamel de melkdruppels in een 50 microliter capillair buisje.
Zodra het volledig is, giet u de melk van het capillairbuisje in een steriele microcentrifugebuis door het uiteinde van de buis die werd gebruikt om melk uit de teat te trekken, aan de zijkant van de microcentrifugebuis aan te raken. Gebruik vervolgens een 18 gauge naald verbonden aan een een milliliter spuit om alle melk die niet in de buis is getrokken weg te blazen. Herhaal de melkverzameling en breng deze over in de microcentrifugebuis totdat er voldoende melk is verzameld.
Voor de gekozen analyse, probeer de totale tijd dat de dam onder anesthesie is te beperken tot minder dan een uur. Wanneer het melken voltooid is, schakel de stroom van isof fluorine en zuurstof uit en verwijder het masker van de dam. Blijf de dam controleren totdat deze voldoende bewustzijn heeft herwonnen om sternal recumbent te blijven.
Als er geen verdere analyses nodig zijn, brengt u de melk op negentig graden Celsius. Om voor te bereiden op CCR-meting, laadt u 15 tot 20 microliters melk direct vanuit de Tet in een microhematocrietbuis. Verzegeld vervolgens het uiteinde van de buis met een klei-afdichting.
Plaats de capillaire buis in de hematocriet spinner met de dichtende punt naar buiten gericht en zorg ervoor dat de centrifuge gebalanceerd is. Draai vervolgens het monster gedurende twee minuten met 13.700 keer G. Zodra het monster klaar is met draaien, verwijdert u de buis uit de centrifuge.
Observeer de monsterscheiding in een crèmelaag en een heldere laag. Meet en noteer de totale lengte van de vloeistof in de buis en de lengte van de vet- of crèmelaag met behulp van een liniaal of calliper. Gebruik deze informatie om de CCR te berekenen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol om te bepalen hoe voeding tijdens zwangerschap en lactatie de melksamenstelling beïnvloedt.
Melkmonsters werden verzameld bij het spenen van Worcester-dams die ofwel een hoog eiwit, een hoog prebiotisch vezel of een gecontroleerde voeding kregen. De melk die werd verzameld van dams op het hoog prebiotisch vezel dieet had de numeriek hoogste C hematocriet, vetconcentratie en energiewaarde. Deze verschillen waren echter niet statistisch significant als het gaat om eiwit.
Melk verzameld van de dams op het hoog eiwit dieet had echter de hoogste eiwitconcentratie. Hoewel dit verschil ook niet statistisch significant was. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in minder dan een uur worden uitgevoerd vanaf het begin van de verdoving van de dam als het correct wordt gedaan.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voortdurend de dam te controleren om ervoor te zorgen dat ademhalingsdepressie niet optreedt onder narcose na deze procedure. Andere methoden zoals massaspectrometrie kunnen worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden zoals de bepaling van de oligosaccharide samenstelling van de melk. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de handmatige verzameling van melk van een lacterende rat kunt uit
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een eenvoudige methode voor het handmatig verzamelen van melk bij lacterende ratten, waardoor laboratoriumanalyse van de melksamenstelling mogelijk wordt. Het protocol is ontworpen om door een enkele onderzoeker te worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde vacuüm- of zuigapparatuur en bevat een techniek voor het schatten van het melkvetgehalte met de creamatocrit-methode. Deze benaderingen vergemakkelijken studies naar hoe maternele factoren de melksamenstelling en bijgevolg de ontwikkeling van het nageslacht beïnvloeden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Onderzoek naar moeder- en kindgezondheid
- Nutritionele biochemie
- Dierfysiologie
Achtergrond
- Melk is de primaire voedingsbron voor pasgeboren zoogdieren en bevat essentiële voedingsstoffen en bioactieve verbindingen.
- Rattenmodellen worden veelvuldig gebruikt om de fysiologie van de moeder en de effecten daarvan op het nageslacht te bestuderen.
- Het analyseren van de melksamenstelling helpt bij het verduidelijken van de verbanden tussen de gezondheid van de moeder en de ontwikkeling van het nageslacht.
- Bestaande methoden voor melkverzameling vereisen vaak gespecialiseerde apparatuur of meerdere personeelsleden.
Doel van de studie
- Het beschrijven van een eenvoudige, handmatige methode voor het verzamelen van melk bij lacterende ratten.
- Het verstrekken van een protocol dat geen gespecialiseerde apparatuur vereist en door één onderzoeker kan worden uitgevoerd.
- Het demonstreren van het gebruik van de creamatocrit-methode voor het schatten van het vetgehalte in melk.
Gebruikte methoden
- Scheiding van de moeder van het nageslacht voorafgaand aan het melken.
- Inductie en instandhouding van anesthesie met isofluraan en zuurstof.
- Toediening van oxytocine om de melkuitscheiding te stimuleren.
- Handmatige expressie van melk uit de tepels en opvang in capillaire buisjes.
- Overdracht van melk naar microcentrifugebuisjes voor opslag of analyse.
- Creamatocrit-meting: centrifugeren van melk in hematocrietbuisjes om de room te scheiden en berekening van het vetgehalte.
Belangrijkste resultaten
- De handmatige verzamelmethode levert voldoende melk op voor downstream-analyses en kan in minder dan een uur worden voltooid.
- Melkmonsters van moeders met verschillende diëten (hoog eiwit, hoge hoeveelheid prebiotische vezels, controle) vertoonden variaties in creamatocrit, vetconcentratie en eiwitgehalte, hoewel de verschillen niet statistisch significant waren.
- Het protocol maakt een veilig anesthesiebeheer en minimale stress voor het dier mogelijk bij een correcte monitoring.
- De methode is aanpasbaar voor verdere analyses, zoals massaspectrometrie voor oligosacharide-profilering.
Conclusies
- Deze techniek voor handmatige melkverzameling is efficiënt, reproduceerbaar en toegankelijk voor de meeste laboratoria.
- Het maakt gedetailleerde studies mogelijk naar hoe het dieet en de fysiologie van de moeder de melksamenstelling en de gezondheid van het nageslacht beïnvloeden.
- De benadering ondersteunt een reeks downstream biochemische analyses om onderzoek naar de gezondheid van moeder en kind verder te bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Betrouwbare kwantificering van het vetgehalte in melk bij preklinische ratmodellen maakt mechanistische studies mogelijk naar de invloed van maternaal voedingspatroon en metabole interventies op de ontwikkeling van het nageslacht. Handmatige capillaire collectie en creamatocrit-analyse bieden een gestandaardiseerde, schaalbare workflow voor het evalueren van metabole verbanden tussen moeder en nageslacht in translationeel onderzoek. Deze benadering ondersteunt vroege ontdekking en target-validatie voor programma's voor moeder- en kindgezondheid in biofarmaceutische pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het toetsen van hypothesen over het dieet en het metabolisme van de moeder mogelijk in gecontroleerde preklinische modellen.
- Ondersteunt de functionele validatie van interventiedoelen bij de moeder door de samenstelling van de melk te koppelen aan uitkomsten bij het nageslacht.
- Faciliteert biologische risicoreductie door het verschaffen van kwantitatieve meetwaarden van het melkvetgehalte.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve metingen van het vetgehalte voor de standaardisatie van assays.
- Bereidt gevalideerde melkmonsters voor voor downstream biochemische en omics-analyses.
- Maakt schaalbare screening van nutritionele of farmacologische interventies in moederlijke modellen mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt preklinische gegevens over de melksamenstelling aan translationele biomarkers voor de gezondheid van moeder en pasgeborene.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van interventiestrategieën voor de moeder.
- Biedt mechanische risicoreductie voor metabole studies naar moeder en nakomeling.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het continuüm van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek en ondersteunt hypothesetoetsing, targetvalidatie en translationeel onderzoek naar de gezondheid van moeder en kind.
- Discovery Biology: Kwantitatieve creamatocrit-resultaten verduidelijken de impact van maternale interventies op de melksamenstelling.
- Screening: Gestandaardiseerde verzameling en analyse maken een reproduceerbare vergelijking tussen experimentele groepen mogelijk.
- Analytics: Biedt directe, kwantitatieve metingen van het vetgehalte voor statistische analyse en besluitvorming.
- Translational Research: Faciliteert de afstemming van preklinische bevindingen op klinische eindpunten voor de gezondheid van moeder en kind.
- Enterprise Reuse: De workflow is aanpasbaar voor diverse studies naar maternale interventies en downstream analytische platforms.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in metabole studies naar moeder-nakomeling en bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Maakt uitvoering door een enkele onderzoeker, standaardisatie en reproduceerbaarheid mogelijk zonder gespecialiseerde apparatuur.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde go/no-go-beslissingen voor programma's voor moederinterventies.
- Impact op portfolio: Biedt een herbruikbaar, schaalbaar platform voor het prioriteren van activa voor de gezondheid van moeder en kind.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van knaagdieren, anesthesie en monsterneming.
- Toegang tot basis laboratoriuminfrastructuur is noodzakelijk, inclusief centrifugatie en instrumenten voor capillaire meting.
- Standaardisatie van de anesthesie en het tijdstip van afname is essentieel voor de reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan diverse modellen voor moederlijke interventie en compatibel met daaropvolgende biochemische analyses.
- Zorgvuldige monitoring van het dierenwelzijn en de anesthesiediepte is gedurende de gehele procedure essentieel.
