Het kwantificeren van vissen zwemmen gedrag in reactie op acute blootstelling van Waterige Copper Met behulp van Computer Assisted Video en Digital Image Analysis

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe gedragsreacties bij witte stukken kunnen worden gekwantificeerd bij subletale blootstelling aan oplosbaar koper. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de ecotoxicologie te beantwoorden, zoals hoe subletale blootstelling aan verontreinigingen het zwemgedrag van vissen beïnvloedt. Deze methode kan belangrijke informatie verschaffen voor het behoud van witte stukken.

Het kan ook gemakkelijk worden toegepast op andere vissoorten, amfibieën en ongewervelde dieren. Het grote voordeel van deze techniek is dat de reactie zeer gevoelig is, een vroege indicatie van toxiciteit geeft en relevant is voor de overleving van het organisme. Aanvankelijk kan deze methode een uitdaging zijn als de persoon niet vertrouwd is met het maken van gedragsmetingen.

Het protocol wordt gedemonstreerd door mijn co-auteur Holly Puglis. Bereid eerst twee liter reagentiakwaliteit kopersulfaat pentahydraat. Equilibreer vervolgens het verdunningssysteem en de blootstellingstanks.

Plaats de inlaatbuis van de geautomatiseerde spuitdispenser in de voorraadoplossingskolven. Stel vervolgens het volume van de automatische pompspike in op één milliliter en zet de verdunning aan. Het systeem maakt een 50% verdunningsreeks van vijf concentraties en een controle.

Via een vierwegs splitter worden deze oplossingen geleverd aan de vier replicatieblootstellingskamers. Schakel vervolgens de pomp in voor de chiller die is ingesteld om het waterbad op 15 graden Celsius te houden. Stel het op de verdunning in op een cyclus elke 30 minuten.

Het waterniveau in de tanks wordt gehandhaafd door een staand pijpafvoer. Bereid de blootstellingskamers voor door een gat van vier centimeter in de zijkant te maken en het gat te bedekken met 30 micron roestvrijstalen gaas. Zorg ervoor dat u blootstellingskamers selecteert die minimaal één liter water per 10 gram vis bevatten.

Een witte stuk van 89 dagen oud weegt ongeveer 373 milligram en kan dus worden getest in een 28 centimeter bij 13 punt vijf centimeter bij 25 centimeter vierkante kamer. Verzamel bij het begin, midden en einde van een experiment 24 milliliter monsters van de testoplossing voor chemische analyse. Gebruik zuigbuisjes die aan plastic spuiten zijn bevestigd.

Vervang het zuigbuisje door een polyethersulfonfilter van nul punt vier vijf micron en giet vier milliliter testwater door het filter. Gooi dit water weg. Filtreer vervolgens de resterende 20 milliliter water in een met zuur gereinigde polyethyleenfles.

Zuur de monster met 16 molare salpeterzuur tot 1%volume per volume. Deze monsters kunnen maximaal drie maanden worden bewaard. Zodra de testblootstellingen zijn bevestigd, plaatst u drie stukken in elke replicatietestkamer voor ongeveer 172 milligram vis per kamerliter.

Verzamel de stukken met een niet-schurende net en breng ze over naar een kleine emmer. In totaal zijn er 144 vissen nodig om gegevens te verzamelen uit zes testoplossingen. Voer de vissen tijdens de 96 uur blootstelling niet.

Er moeten consistente dagelijkse waarnemingen worden gedaan om de mortaliteit en abnormaal gedrag te scoren. De ochtend is het beste tijdstip van de dag om dit te doen, en idealiter is de waarnemer blind voor de testomstandigheden. Verlies van evenwicht wordt gedefinieerd als het onvermogen van vissen om een rechtopstaande positie binnen de waterkolom te handhaven.

Onbeweeglijkheid wordt gedefinieerd als het onvermogen van vissen om te bewegen of te zwemmen, tenzij ze worden aangezet. Noteer ook andere afwijkingen, zoals lethargie, hyperactiviteit, toename of afname van de ademhaling, kleurveranderingen, trillingen, spasmen, opgeblazen buiken, positie in de waterkolom en andere ongebruikelijke zwempatronen. Dode vissen moeten altijd onmiddellijk worden verwijderd.

Meet elke dag ook de opgeloste zuurstofniveaus met een handmatige meter uit twee watermonsters. Aan het einde van de 96 uur blootstelling, maak video's voor zwemgedragsanalyse. Plaats de testarena binnen een blootstellingstank.

Zorg ervoor dat u een testarena selecteert die groot genoeg is voor de vissen om vrij te zwemmen. Plaats direct boven elke testarena een handmatige videocamera op een statief. Selecteer nu tot drie overlevenden willekeurig van de behandelde vissen.

Breng er drie over naar de testarena met behulp van een klein gaasnet. Laat de vissen ongeveer 30 minuten acclimatiseren naar de arena. Terwijl de vissen acclimatiseren, focus de afbeelding, minimaliseer de schitteringsverstoringen van bewegend water en maximaliseer het contrast van de vissen tegen de achtergrond, en pas het beeld aan zodat de vissen niet worden verduisterd.

Zodra de vissen zijn acclimatiseerd, start u de opname en verzamelt u twee minuten videogegevens. Nadat de video is gemaakt, moet u de vissen euthanaseren en weggooien. Na het converteren van de videobestanden naar het formaat dat nodig is voor de digitale analysesoftware, opent u de trackingsoftware en selecteert u een nieuw standaardexperiment onder de optie een nieuw experiment maken op het hoofdscherm.

Vul de prompts in en druk op oké. Ga vervolgens naar de optie experimentinstellingen onder instellen en kies videobestand onder videobron. Stel het aantal arena's in op een.

Stel het aantal proefpersonen per arena in op drie. Selecteer vervolgens middelpuntdetectie onder gevolgde functies en selecteer de gewenste eenheden. Kies nu onder instellen de optie proeflijst en klik bovenaan het scherm op video's toevoegen.

Kies alfabetische volgorde uit het dialoogvenster. Klik op bladeren. Navigeer naar de map waar de video's zich bevinden, markeer de relevante bestanden en klik op openen.

Nu de videobestanden zijn geselecteerd, gaat u verder met het definiëren van de reikwijdte van het experiment in de software. Klik eerst op variabele toevoegen bovenaan het scherm en voer concentratie in bij het labelvak. Voer koperconcentratie in microgram per liter in bij het beschrijvingsvak.

Kies vervolgens numeriek uit de vervolgkeuzelijst voor type. Klik op de vak voor voorgedefinieerde waarden en kies de optie individuele waarden definiëren uit het dialoogvenster. Voer de concentraties in die voor het experiment zijn gebruikt, klik op toevoegen tussen elke getalto