Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP
20 januari 2016
De identificatie van moleculen die geassocieerd zijn met specifieke genomische regio's van belang is vereist om de mechanismen van regulatie van de functies van deze regio's te begrijpen. Dit protocol beschrijft procedures om geëngineerde DNA-bindende molecuul-gemedieerde chromatine immunoprecipitatie (enChIP) uit te voeren voor de identificatie van eiwitten en RNA's die geassocieerd zijn met een specifiek genoomgebied.
Het algemene doel van deze procedure is om een specifiek genoomgebied te isoleren met behoud van moleculaire interacties voor de identificatie van moleculen die interageren met het genoomgebied. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van genoomfuncties zoals transcriptie en epigenetische regulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een directe identificatie mogelijk maakt van moleculen die interageren met een specifiek genoomgebied.
Demonstratie van de procedure zal worden gegeven door Toshitsugu Fujita, een assistent-professor uit mijn laboratorium. Volg het tekstprotocol om de DNA-bindende moleculen van belang te ontwerpen. Dit omvat het genereren van de gBlock-sequentie van belang en deze in een retrovirus in te voegen, bijvoorbeeld om het guide RNA te produceren dat is gecomplexeerd met drie FLAG-dCas9.
Alternatief kunnen drie FLAG-TAL-eiwitten worden gegenereerd die de doelsequentie herkennen. Vervolgens worden de cellen geïnfecteerd met het voorbereide retrovirus volgens het tekstprotocol. Bevestig de expressie van de ontworpen DNA-bindende moleculen en stel de cellijn vast.
Ga nu verder door de cellen te cross-linken met formaldehyde. Suspendeer 20 miljoen getransfecteerde cellen in 30 milliliter regelmatig kweekmedium en voeg 810 microliter 37% formaldehyde toe voor een eindconcentratie van 1%. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Na vijf minuten, stop de cross-linkreactie door 3,1 milliliter van 1,25 molair glycine toe te voegen.
Laat de cellen 10 minuten op kamertemperatuur staan voordat u verder gaat. Centrifugeer vervolgens de cellenbuis gedurende vijf minuten bij 300 G in een gekoelde centrifuge. Gooi voorzichtig het supernatant weg en was het cellenpellet in 30 milliliter PBS door te mengen en te centrifugeren.
Voer twee PBS-washes uit. Indien nodig kan het gewassen pellet van gefixeerde cellen worden bewaard bij min 80 graden Celsius. Vervolgens het chromatine van de cellen verzamelen.
Suspendeer ze in 10 milliliter lysisbuffer en incubeer ze gedurende 10 minuten op ijs. Verzamel vervolgens de cellen met een gekoelde centrifuge en gooi het supernatant voorzichtig weg. Suspendeer nu het cellenpellet in nucleaire lysisbuffer en incubeer het gedurende 10 minuten op ijs.
Elke paar minuten tijdens de incubatie kort het mengsel kort voorwerpen. Verzamel opnieuw de cellen door centrifugatie. Was nu het pellet met 10 milliliter PBS en verwijder de wasoplossing met een andere centrifugatie.
Dit produceert de chromatinefractie en kan, indien gewenst, worden snel bevroren en bewaard bij min 80 graden Celsius. Ga verder door het chromatinepellet op te schorsen in 800 microliter gemodificeerd lysisbuffer drie en breng de suspensie over naar een kleinere 1,5 milliliterbuis. Schakel nu een sonicatiesonde in op niveau drie met continue aandrijving.
Om het chromatine te fragmenteren, cycle handmatig tussen 10 seconden sonicatie en 20 seconden op ijs. Bij elke 5e of 6e cyclus verleng de ijsfase tot twee minuten zodat het monster niet oververhit raakt. Voer deze sonicatiecyclus 10 tot 18 keer uit, waarbij de punt van de sonde van de bodem van de buis wordt gehouden om het monster niet te laten schuimen.
Na de sonicatie, verzamel het monster met een snelle gekoelde centrifugatie. Breng vervolgens het supernatant met het gefragmenteerde chromatine over naar een nieuwe buis en gooi het pellet weg. Zie het tekstprotocol voor het evalueren van de fragmentatie.
Voor de voorbereiding van de immunoprecipitatie, conjugeer eerst de antilichamen aan Dynabeads. Deze immunoprecipitatie is geschaald voor monsters afkomstig van 20 miljoen cellen. Voeg een 1/5 volume van gewijzigde lysisbuffer drie met Triton X-100 toe aan het gefragmenteerde chromatine om een eindconcentratie van 1% Triton te verkrijgen.
Voeg vervolgens het mengsel toe aan de magnetische kralen geconjugeerd met normaal muis IgG. Incubeer de reactie gedurende een uur op een rotator met koeling. Trek vervolgens de kralen uit de oplossing voor drie minuten op een magneetstandaard.
Verzamel vervolgens het supernatant. Breng het supernatant over naar de buis met magnetische kralen geconjugeerd met anti-FLAG-antilichamen. Laat deze conjugatiereactie een nacht lang draaien op een rotator bij vier graden Celsius.
De volgende ochtend, breng een magneet aan op de buis gedurende drie minuten om de kralen te verzamelen. Pipet vervolgens het supernatant weg en gooi het weg. Was nu de kralen.
Suspendeer ze in één milliliter laag-zoutbuffer en incubeer ze gedurende vijf minuten op een rotator bij vier graden Celsius. Na de incubatie, isoleer de magnetisatie van de kralen en gooi het supernatant weg. Herhaal deze wasstap met laag-zoutbuffer nog een keer.
Voer met dezelfde techniek nog twee wasbeurten uit met hoge-zoutbuffer. Ga verder met de methode om de kralen twee keer te wassen in lithiumchloridebuffer. Was tenslotte de kralen met TBS-IGEPAL CA-630 slechts één keer.
Na de zeven wasstappen, schors de kralen in 200 microliter elutiebuffer en incubeer ze gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Trek vervolgens de kralen aan door magnetisatie en verzamel het supernatant in een nieuwe buis. Herhaal deze elutiestap om de opbrengsten te verhogen.
Zuiver vervolgens ongeveer 5% van het DNA om de opbrengst te schatten. Begin door het grootste deel van het eluaat te mengen in een precipitatiereactie. Precipiteer het chromatine een nacht lang bij min 20 graden Celsius.
De volgende dag, centrifugeer het monster en gooi het supernatant weg. Spoel het pellet af met een milliliter 70% ethanol en herhaal de centrifugatie gedurende 10 minuten. Gooi vervolgens het supernatant weg en suspendeer het pellet in 40 microliter 2x monsterbuffer.
Vortex nu de suspensie gedurende vijf minuten. Incubeer het vervolgens gedurende 30 minuten bij 100 graden Celsius om te denatureren en de cross-link te omkeren. Na het koken, zet 40 microliter van het monster op een SDS-PAGE-gel.
Gewoonlijk wordt een vier tot 20% gradiënt gebruikt. Laat de gel lopen totdat de kleurstof een centimeter onder de put reist. Kleur vervolgens de gel en snijd het in vijf stu
Overzicht
Dit protocol beschrijft de geëngineerde DNA-bindende molecuul-gemedieerde chromatine immunoprecipitatie (enChIP) techniek om eiwitten en RNA's geassocieerd met specifieke genomische regio's te identificeren. Het biedt een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van moleculaire interacties die cruciaal zijn voor het begrijpen van genomische functies.
Belangrijkste Studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Genomics
- Epigenetica
- Molecuulbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van moleculaire interacties met genomische regio's is essentieel voor het verduidelijken van regulerende mechanismen.
- enChIP maakt de directe identificatie van moleculen mogelijk die interageren met specifieke genomische gebieden.
- Deze methode is toepasbaar in studies van transcriptie en epigenetische regulatie.
- Het verbetert de mogelijkheid om complexe genomische functies te bestuderen.
Doel van het onderzoek
- Om specifieke genomische regio's te isoleren en interacterende moleculen te identificeren.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van transcriptionele en epigenetische regulatie.
- Om de enChIP-techniek effectief te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Het ontwerpen van DNA-bindende moleculen met behulp van gBlock-sequenties en retrovirussen.
- Het cross-linken van cellen en het isoleren van chromatine.
- Het fragmenteren van chromatine door middel van sonicatie.
- Het uitvoeren van immunoprecipitatie met geconjugeerde antilichamen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van chromatine uit getransfecteerde cellen.
- Identificatie van eiwitten en RNA's geassocieerd met specifieke genomische regio's.
- Demonstratie van effectieve zuivering van doel-genoomregio's met behulp van enChIP.
- Opbrengstschatting door massaspectrometrie-analyse.
Conclusies
- enChIP is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van moleculaire interacties op specifieke genomische locaties.
- De methode biedt inzicht in transcriptie- en epigenetische regulatie.
- Het kan worden gebruikt voor verschillende toepassingen in genomisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
enChIP enables direct, unbiased identification of proteins and RNAs interacting with specific genomic regions, supporting mechanistic de-risking in target validation. This approach enhances predictive confidence by linking genomic loci to functional molecular interactions in transcription and epigenetic regulation. It provides a scalable method for early discovery biology to inform portfolio triage and reduce late-stage biological risk.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying direct molecular interactors of genomic regions of interest.
- Operational Value: Enables functional target validation through unbiased proteomic and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying pathway context and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated chromatin inputs for downstream molecular interaction screening.
- Operational Value: Standardizes isolation of specific genomic regions with quantifiable yield (up to 10% purification efficiency).
- Scalability: Supports platform reuse across loci (e.g., promoters, telomeres) using TAL or CRISPR-dCas9 engineering.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-stage genomic findings to disease-relevant mechanisms via associated molecule identification.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned follow-up through mass spectrometry or RNA sequencing of isolated complexes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical target prioritization by revealing context-specific interactors (e.g., interferon gamma-specific IRF-1 associations).
Pipeline & Workflow Integration
enChIP fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing molecular interaction data that bridges genomic annotation and functional validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating genomic regions while preserving native molecular interactions.
- Screening: Generates assay-ready chromatin fractions for interaction profiling with chemical or genetic perturbations.
- Analytics: Enables quantitative comparison of associated molecules across conditions via mass spec or RNA-seq readouts.
- Translational Research: Connects genomic loci to phenotypic mechanisms through identified proteins and RNAs.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized capability for locus-specific interactome mapping across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in genomic function studies through direct interactor identification.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized isolation of tagged genomic regions using antibody-based immunoprecipitation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating target mechanism early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on molecular context of genomic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to engineer TAL or gBlock-CRISPR DNA-binding molecules.
- Needs access to sonication equipment, magnetic separation tools, and downstream analytics (mass spec, RNA-seq).
- Demands cross-team standardization for epitope tagging (e.g., FLAG) and antibody conjugation workflows.
- Must account for chromatin accessibility and epitope efficiency across diverse genomic regions and cell types.
- Practical limitation: Efficiency depends on successful tagging and expression of engineered DNA-binding molecules in target cells.
