Name: Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Leer de enChIP-techniek om specifieke genomische regio's te isoleren en bijbehorende eiwitten en RNA's te identificeren. Deze methode biedt inzicht in transcriptie- en epigenetische regulatiemechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Takeda Science Foundation (TF); de Asahi Glass Foundation; de Uehara Memorial Foundation (HF); de Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation (TF en HF); Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (# 25.830.131), Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek (C) (# 15K06895) (TF); en een Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek inzake innovatieve Areas &#39;transcriptie Cycle&#39; (# 25.118.512 &amp; # 15H01354), Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek (B) (# 15H04329), Grant-in-Steun voor Verkennend onderzoek ( # 26650059) en &#39;Genome Support&#39; (# 221S0002) (HF) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan.

1. Ontwerp van Engineered DNA-bindende moleculen bewust van de Target Locus <ol><li> Voor enChIP gebruik CRISPR complexen, gebruik dan de CRISPRdirect webtool (http://crispr.dbcls.jp) voor kandidaat gRNA doelwit sequenties in de genomische regio van belang beschreven, zoals eerder 18 identificeren. Deze webtool keert 23 bp genomische plaatsen van de vorm 5&#39;-N 20 NGG-3 &#39;binnen het doelgebied. </li><li> Synthetiseren een gBlock inclusief U6 promotersequentie en de sequentie van 5&#39;-N 20 in 5&#39;-N 20 NGG-3 &#39;met andere voorzieningen (zie figuur 2) 19,20. Voor subklonering doeleinden, onder meer geschikte restrictie-enzym plaatsen buiten de gBlock. </li><li> Plaats de gBlock in een geschikte vector zoals eerder beschreven 16. Verscheidene retrovirale vectoren voor gBlocks zijn beschikbaar (zie Materials). </li><li> Voor enChIP gebruik TAL eiwitten, ontwerpen TAL eiwitten herkennen van de target loci. Genereren van plasmiden die coderen TAL eiwitten met behulp van commerciële diensten. Genereer expressievectoren die de TAL eiwitten gefuseerd met één of meer tags zoals 3 x FLAG zoals eerder beschreven 15. </li></ol> 2. Vaststelling van Cellen voor de enChIP Analyse <ol><li> Versneld 3 × FLAG-dCas9 en de gRNA (CRISPR-gebaseerde procedure) of 3 × FLAG-TAL (TAL basis van eiwitten procedure) in de cellen worden geanalyseerd zoals eerder beschreven 14-17. <ol><li> Gebruik transiënte transfectie wanneer de transfectie efficiency hoog. Een expressievector die 3 × FLAG-dCas9 en de CMV-promotor is beschikbaar (zie Materials). </li><li> Overwegen om stabiele transformanten met gebruikelijke werkwijzen wanneer de transiënte transfectie-efficiëntie is laag. Naast de eerder genoemde retrovirale vectoren voor gBlock, retrovirale vectoren van 3 x FLAG-dCas9 beschikbaar (zie Materialen). </li></ol></li><li&gt; Bevestig de expressie van de 3xFLAG-dCas9 of 3xFLAG TAL-eiwit in de getransfecteerde cellen door immunoblot analyse met een anti-FLAG-antilichaam (Ab) zoals eerder 14-17 beschreven. Opmerking: Expressie van deze gemerkte eiwitten kunnen ook worden bevestigd door intracellulaire kleuring met anti-FLAG-FITC en een daaropvolgende FACS-analyse. Een protocol voor intracellulaire kleuring kan worden gedownload van onze homepage (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). </li><li> Bevestigt expressie van het gRNA van standaard RT-PCR-techniek. </li><li> Voor kwantitatieve identificatie van eiwitten interactie met de genomische regio van belang, overweeg dan het gebruik van een stabiele isotoop labeling van aminozuren in celcultuur (SILAC) analyse gecombineerd met enChIP (enChIP-SILAC). Opmerking: middelen voor het SILAC analyse kan worden gekocht bij commerciële leveranciers. SILAC is krachtig in het opsporen van specifieke interacties. <ol><li> Cultuur cellen in SILAC zwaar medium. Bereid cellen Culturood in SILAC licht medium als een negatieve controle. Gebruik minimaal 5 x 10 7 cellen per SILAC medium (zwaar of licht). Voor een efficiënte labeling, voeg zowel L-lysine-2HCl, 13 C 6 en L-arginine-HCl, 13 C 6, 15 N 4 in de SILAC Heavy media. Opmerking: Minstens vijf celdelingen noodzakelijk label eiwitten. <ol><li> Zo cultuur menselijke fibrosarcoom HT1080 cellen die stabiel tot expressie 3xFLAG-dCas9 en gRNA bij 37 ° C en 5% CO2 in DMEM media SILAC en gedialyseerd foetaal runderserum met Lysine-2HCl plus L-Arginine-HCl (Light gemiddeld) of 13 C 6 L-lysine-2HCl plus 13 C 6 15 N 4 L-Arginine-HCl (Heavy gemiddeld) (zie Materials) 16. Voeg 50 mg lichte of zware L-Lysine en L-2HCl-Arginine-HCl in 500 ml medium. </li><li> Trypsinize en replate cellen voordat ze confluent, zodat de cellen te behouden exponentiële growth. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. verknoping van cellen met Formaldehyde <ol><li> Voor cellen in suspensie cultuur, overdracht 2 x 10 7 cellen die 3xFLAG-TAL eiwitten of 3xFLAG-dCas9 plus gRNA en schorten in 30 ml van de reguliere kweekmedium in een 50 ml centrifugebuis. Wanneer er meer cellen worden gebruikt, stijgen de volumes en hoeveelheden reagentia proportioneel. Voor SILAC experimenten, meng de cellen gekweekt in zware medium of licht middel (5 x 10 7 cellen elk) en verdeel de in totaal 1 x 10 8 cellen in 5 buisjes die 2 x 10 7 cellen. </li><li> Voeg 810 ul van 37% formaldehyde aan 30 ml van de celsuspensie (eindconcentratie 1%) en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min. Voor hechtende cellen rechtstreeks cellen in kweekschalen lossen door het toevoegen van 810 pi 37% formaldehyde aan 30 ml kweekmedium. </li><li> Stop de verknoping door toevoeging van 3,1 ml van 1,25 M glycine-oplossing (eindconcentratie 127 mM), enincuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Verzamel cellen door centrifugatie (300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C). Gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof, waaronder formaldehyde en bewaar het op een passende fles afval. <ol><li> Voor hechtende cellen los cellen met een cel schraper en oogst in een 50 ml buis en verzamel cellen zoals beschreven in deze stap. </li><li> Voor SILAC experimenten, meng de losgemaakte cellen gekweekt in zwaar medium of licht middel (5 x 10 7 cellen elk), verdeel het totaal van 1 x 10 8 cellen in 5 buisjes die 2 x 10 7 cellen en verzamel cellen zoals beschreven in dit stap. </li></ol></li><li> Was de celpellet met 30 ml PBS twee keer per buis. Gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof, waaronder formaldehyde en bewaar het op een geschikte afval bottle.Handle de formaldehyde afval volgens chemische veiligheidsrichtlijnen. De gefixeerde cellen kunnen worden ingevroren en opgeslagen bij -80 ° C. </li></ol> 4. Voorbereiding van chromatine (per 2 x 107 cellen) <ol><li> Suspendeer de cellen gefixeerd in 10 ml cellysis buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630 en 1 x proteaseremmers) en incubeer op ijs gedurende 10 min. </li><li> Centrifugeer het monster (830 x g bij 4 ° C gedurende 8 minuten) en de bovenstaande vloeistof voorzichtig. </li><li> Suspendeer de pellet in 10 ml van nucleaire lysis buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,5% lauroylsarcosine en 1x proteaseremmers). Incubeer op ijs gedurende 10 min en vortex elke 2-3 min. </li><li> Centrifugeer het monster (830 × g bij 4 ° C gedurende 8 minuten) en de bovenstaande vloeistof voorzichtig. </li><li> Was de pellet in 10 ml PBS. De pellet (chromatine fractie) kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C onmiddellijk na invriezen in vloeibare stikstof. </li></ol> 5. Sonicatie van chromatine (per 2 x 10 7 cellen) <ol><li> Hang de chromatine fractie in 800 plgemodificeerde lysis buffer 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) en overbrengen in een 1,5 ml buis. </li><li> Ultrasone trillingen het chromatine met een sonicator (zie Materials) en de volgende voorwaarden: output: 3; duty: 100% (permanent); en tijd: gratis. Voer 10-18 cycli van sonicatie gedurende 10 seconden en koelen op ijs gedurende 20 sec. Om oververhitting te voorkomen, incubeer de monsters op ijs gedurende 2 minuten elke 5-6 cycli. Om schuimvorming te voorkomen, houdt de positie van de tip van de sonde ultrasoonapparaat 0,5 cm boven de bodem van de buis. </li><li> Centrifugeer het monster (16.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 min) en de supernatant over in een 1,5 ml buis. De gesoniceerd chromatine kan worden opgeslagen bij -80 ° C na onmiddellijke bevriezing in vloeibare stikstof. </li></ol> 6. Evaluatie van chromatine fragmentatie <ol><li> Meng 10 ul van de gefragmenteerde chromatine met 85 pl gedestilleerd water. </li><li> Voeg 4 pivan 5 M NaCl en incubeer bij 65 ° CO / N. </li><li> Voeg 1 pl van 10 mg / ml RNase A en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 min. </li><li> Voeg 2 pl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 pi 1 M Tris (pH 6,8) en 1 pi 20 mg / ml Proteinase K, en incubeer bij 45 ° C gedurende 1,5 uur. </li><li> Afzonderlijke 10 gl van het monster door elektroforese in een 1% agarose gel die kleuring kleurstoffen zoals SYBR Green bevat. </li><li> Vlekken op de gel om de verdeling van de lengtes van de gefragmenteerde chromatine evalueren. Omstandigheden die een gemiddelde lengte van 0,5-2 kbp (bereik van 0,2-4 kbp) genereren aanbevolen. </li><li> Zuiver DNA van de overige monsters met fenol-chloroform extractie of door een DNA-extractie kit (zie Materialen). Het gezuiverde DNA kan worden gebruikt als input DNA schatting van de opbrengsten aan enChIP analyses (zie 8,11). </li></ol> 7. Bereiding van Dynabeads met geconjugeerde antilichamen (per 2 x 10 7 cellen) <ol><li> Prepare twee 1,5 ml buizen, één voor pre-maaien met normale muis IgG en de andere voor incubatie met het anti-FLAG Ab. Voeg 150 ul Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels (zie Materials) aan elke buis. </li><li> Plaats de buizen op een magneet stand en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren. </li><li> Suspendeer de kralen in 1 ml PBS met 0,01% Tween-20 (PBS-T). Plaats de buizen op een magnetische standaard en wacht 2 min. Verwijder het supernatant door pipetteren, en herhaal de stap. </li><li> Suspendeer de kralen in 1 ml van PBS-T met 0,1% BSA. </li><li> Voeg 15 ug normale muis IgG of anti-FLAG Ab en roteren bij 4 ° CO / N. </li><li> Spin down kort en plaats de buizen op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren. </li><li> Suspendeer de kralen in 1 ml PBS-T. Omkeren het monster meerdere malen en spin down kort. Plaats de buizen op een magneet staan ​​en wacht 3 minuten, dan is de bovenstaande vloeistof door pipetteren. Herhaal het wassentwee keer met PBS-T (totaal drie wasstappen). </li></ol> 8. Chromatine Immunoprecipitatie (per 2 x 10 7 cellen) <ol><li> Meng de gefragmenteerde chromatine bereid in 5,3) (ongeveer 800 ui) met een-vijfde van het volume (ongeveer 200 pl) van gemodificeerde lysisbuffer 3 met 5% Triton X-100 (eindconcentratie van 1% Triton X-100). </li><li> Voeg de chromatine oplossing voor de buis waarin Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels geconjugeerd met normale muis IgG werden bereid. Roteren bij 4 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min. </li><li> Breng de bovenstaande vloeistof in de buis waarin Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels geconjugeerd met anti-FLAG Ab bereid. Draai bij 4 ° CO / N. </li><li> Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren. </li><li> Suspendeer de korrels in 1 ml buffer met laag zoutgehalte (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) en roteren bij 4 ° C gedurende 5 min. Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren en herhaal het wassen stap. </li><li> Was de kralen met hoge zout buffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) tweemaal. </li><li> Was de kralen met LiCl buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% natriumdeoxycholaat en 1x proteaseremmers) tweemaal. </li><li> Was de kralen met TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630 en 1x proteaseremmers) eenmaal. </li><li> Suspendeer de kralen in 200 ui elutiebuffer (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x proteaseremmers, en 500 ug / ml 3 x FLAG peptide) en incubeer bij 37 ° C 20 min. Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Breng de bovenstaande in een nieuwe 1,5 ml buis en herhaal de elutkolomion stap. </li><li> Zuiver DNA van klein gedeelte (bijvoorbeeld 5%) van het eluaat door middel van fenol-chloroform extractie of door een DNA-extractie kit (zie Materialen). Het gezuiverde DNA kan worden gebruikt voor PCR met specifieke primer sets voor het schatten van de opbrengst aan enChIP analyses door vergelijking met input-DNA bereid in Stap 6,7 zoals eerder beschreven 14,16. </li></ol> 9. SDS-PAGE, kleuring en massaspectrometrische analyse <ol><li> Meng het eluaat (400 pl) met 1 ml 2-propanol, 50 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 5 ui 20 mg / ml glycogeen. Neerslaan van de chromatine bij -20 ° CO / N. </li><li> Centrifugeer het monster (16.000 xg bij 4 ° C gedurende 30 minuten) en de bovenstaande vloeistof. Spoel het pellet met 1 ml 70% ethanol en opnieuw centrifugeren (16.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 min). Verwijder het supernatant volledig door pipetteren. </li><li> Suspendeer de pellet in 40 ul 2x monsterbuffer (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% sucrose, en 0,004% broomfenolblauw). Vortex gedurende 5 min op de korrel volledig op te lossen, en incubeer bij 100 ° C gedurende 30 min om de eiwitten te denatureren en omgekeerde verknoping. </li><li> Voor SDS-PAGE, run 40 ul van het monster op de gel totdat de kleurstof bereikt 1 cm onder de put. Opmerking: We gebruiken meestal 4-20% gradiënt gelen, maar andere% gels worden gebruikt. </li><li> Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue of zilver vlek. </li><li> Snijd de gel in vijf stukken (2 mm hoogte). </li><li> Voeren in gel spijsvertering en massaspectrometrische analyse zoals eerder 13-16 beschreven. </li><li> Voor SILAC experimenten met 5 x 10 7 cellen elk (totaal 1 x 10 8 cellen), schorsen pellet van de eerste vijf buizen 40 ui 2x monsterbuffer (het is niet nodig op te schalen). </li></ol> 10. Zuivering van RNA en RNA-Seq Analysis <ol><li> Om het RNA na enChIP zuiveren, voeg 5 U / ml RNase Inhibitor (see Materials) om alle bufferoplossingen, behalve gemodificeerde lysisbuffer 3 en elutiebuffer, waaraan 40 U / ml RNase Inhibitor voegen. </li><li> Meng het eluaat (400 pl) met 16 pl 5 M NaCl en incubeer bij 65 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Voeg 1 ml zuur guanidinium-fenol gebaseerde reagens (zie Materials) aan het monster. Vortex gedurende 15 seconden en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 5-15 min. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 12.000 x g en kamertemperatuur. </li><li> Breng het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 5 ul p-broomanisool. Vortex gedurende 15 seconden en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 3-5 min. Centrifugeer het monster gedurende 10 min bij 12.000 xg en RT. </li><li> Breng de bovenstaande vloeistof (ongeveer 1 ml) in een nieuwe 2 ml buis en voeg 1 ml 2-propanol. Keer de buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Laad het mengsel op een kolom in een RNA-zuivering kit (zie Materials). Centrifugeer de kolom gedurende 1 min bij 12.000 x g en RT. </li><li> Wassende kolom met 400 ui wasbuffer RNA in een RNA zuiveringskit (zie Materialen). </li><li> Voeg 80 ul DNase I cocktail (mengsel van 5 gl DNase I (1 U / pl), 8 pi 10 x DNase I Reaction Buffer, 3 gl DNase / RNase-vrij water en 64 ui RNA Wash Buffer in een RNA zuiveringskit (zie Materialen)) naar de kolom. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 15 minuten en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 12.000 x g en kamertemperatuur. </li><li> Was de kolom met 400 ul van RNA voorwas buffer in een RNA-zuivering kit (zie Materials) tweemaal. </li><li> Elueer het RNA met 50 ui DNase / RNase-free water. De geëlueerde RNA kan worden gebruikt voor RNA-sequencing. </li></ol>

<ol><li>Zhang, X. Y., Horz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+highly+purified+satellite+DNA+containing+chromatin+from+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse.</a> Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).</li>
<li>Workman, J. L., Langmore, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoprotein+hybridization%3A+a+method+for+isolating+specific+genes+as+high+molecular+weight+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemstry%22%5BJournal%5D)">Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin.</a> Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).</li>
<li>Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+active+genes+containing+CAG+repeats+by+DNA+strand+invasion+by+a+peptide+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).</li>
<li>Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+initial+characterization+of+primate+satellite+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Purification and initial characterization of primate satellite chromatin.</a> Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).</li>
<li>Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+specific+chromatin+segments+from+chromosomal+loci+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast.</a> Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).</li>
<li>Ghirlando, R., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+studies+on+defined+heterochromatin+fragments+support+a+30-%C2%B5m+fiber+having+six+nucleosomes+per+turn%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn.</a> J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li>
<li>Hoshino, A., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+chromatin+immunoprecipitation%3A+a+method+for+isolating+specific+genomic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions.</a> J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+idenification+of+insulator+components+by+insertional+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation.</a> PLoS One. 6, e26109(2011).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+specific+genomic+regions+by+insertional+chromatin+immunoprecipitation+%28iChIP%29+with+a+second-generation+tagged+LexA+DNA-binding+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biosci.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain.</a> Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+biochemical+epigenetics+%2F+chromatin+biochemistry+by+insertional+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Biochem%22%5BJournal%5D)">Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation.</a> ISRN Biochem. 2013, 913273(2013).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+specific+genomic+regions+retaining+molecular+interactions+by+the+iChIP+system+using+recombinant+exogenous+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins.</a> BMC Mol. Biol. 15, 26(2014).</li>
<li>Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+the+Thy28-MYH9+axis+in+B+cell-specific+expression+of+the+Pax5+gene+in+chicken+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells.</a> PLoS One. 10, (2015).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+specific+genomic+regions+and+identification+of+associated+proteins+by+engineered+DNA-binding+molecule-mediated+chromatin+immunoprecipitation+%28enChIP%29+using+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).</li>
<li>Fujita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+telomere-associated+molecules+by+engineered+DNA-binding+molecule-mediated+chromatin+immunoprecipitation+%28enChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP).</a> Sci. Rep. 3, 3171(2013).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+associated+with+an+IFN%CE%B3-responsive+promoter+by+a+retroviral+expression+system+for+enChIP+using+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR.</a> PLoS One. 9, e103084(2014).</li>
<li>Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+non-coding+RNAs+associated+with+telomeres+using+a+combination+of+enChIP+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing.</a> PLoS One. 10, e0123387(2015).</li>
<li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRdirect%3A+software+for+designing+CRISPR%2FCas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. , (2014).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
<li>Esvelt, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+Cas9+proteins+for+RNA-guided+gene+regulation+and+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing.</a> Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+binding+of+the+CRISPR+endonuclease+Cas9+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).</li>
<li>Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+characteristics+of+off-target+sites+bound+by+the+Cas9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease.</a> Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).</li>
<li>Cencic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protospacer+adjacent+motif+%28PAM%29-distal+sequences+engage+CRISPR+Cas9+DNA+target+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage.</a> PLoS One. 9, 109213(2014).</li>
<li>O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+analysis+of+Cas9+binding+specificity+using+ChIP-seq+and+targeted+sequence+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).</li>
<li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shelterin%3A+the+protein+complex+that+shapes+and+safeguards+human+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres.</a> Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben een octrooi aangevraagd op enChIP (Octrooi naam: 'Methode voor het isoleren van specifieke genomische regio's met behulp van DNA-bindende moleculen die endogene DNA-sequenties herkennen'; Octrooi nummer: PCT/JP2013/74107). H.F. is lid van de Adviesraad van Addgene.

Hier beschrijven we de zuivering van specifieke genomische regio's met behulp van gemanipuleerde DNA-bindende moleculen zoals het CRISPR-systeem en TAL-eiwitten, en de identificatie van eiwitten en RNA's die gebonden zijn aan deze genomische regio's. Binding van gemanipuleerde DNA-bindende moleculen aan het genoom kan de chromatinestructuur beïnvloeden, inclusief de positionering van nucleosomen, en kan genomische functies afschaffen, zoals beschreven in CRISPR-interferentie-experimenten21. Om deze potentiële afwijkende effecten te vermijden, stellen we specifieke richtlijnen voor voor het kiezen van doelgenomen regio's. Ten eerste, om potentiële remming van de rekrutering van RNA-polymerasen en transcriptiefactoren te voorkomen, evenals verstoring van de positionering van nucleosomen rond de transcriptiestartplaats, moeten de doelregio's voor analyses van promotorregio's enkele honderden basenparen stroomopwaarts van (5' tot) de transcriptiestartplaats zijn. Daarentegen, bij het analyseren van genomische regio's met duidelijke grenzen, zoals enhancers en silencers, kunnen genomische regio's die direct naast deze regio's liggen, worden getipt omdat het minder waarschijnlijk is dat de binding van gemanipuleerde DNA-bindende moleculen hun functies zal beïnvloeden. Verder is het het beste om doelregio's te vermijden die onder verschillende soorten geconserveerd zijn, omdat belangrijke DNA-bindende moleculen vaak binden aan evolutionair geconserveerde regio's en remming van hun binding kan de functies van de doelgenomen regio's verstoren. In dit opzicht is het altijd noodzakelijk om te controleren of de functie van de doelgenomen regio in de gevestigde cellen die worden gebruikt voor enChIP-analyses behouden blijft. Omdat meerdere gRNA's gemakkelijk kunnen worden getest en het vervelend en duur is om meerdere versies van TAL of zinkvingereiwitten te genereren die verschillende doelgenomen regio's herkennen, is enChIP met behulp van CRISPR voordeliger dan enChIP met behulp van andere eiwitten.
Het is aangetoond dat dCas9 bindt aan off-targetlocaties, hoewel de affiniteit voor die locaties zwakker kan zijn dan voor de doellocaties22-25. Er zijn verschillende manieren om de besmetting van moleculen die aan die off-targetlocaties zijn gebonden, te beheersen. Ten eerste wordt het gebruik van verschillende, ten minste twee, verschillende gRNA's aanbevolen. Die moleculen die vaak worden waargenomen in enChIP met verschillende gRNA's zouden echte positieven zijn. Ten tweede zou vergelijking van verschillende omstandigheden voor enChIP effectief zijn in het opheffen van besmetting van niet-specifieke moleculen en moleculen die aan off-targetlocaties zijn gebonden. Voorbeelden van die vergelijkingssets zouden zijn (i) stimulatie (-) en (+), of (ii) verschillende celtypen zoals T-cellen versus B-cellen. Ten slotte moet een kwantitatieve analyse van de binding van kandidaatmoleculen worden uitgevoerd om hun specifieke binding aan de doellocaties te bevestigen. Het is wenselijk om cellen te bereiden die alleen dCas9 tot expressie brengen maar geen gRNA als negatieve controle.
Met behulp van enChIP-analyses konden we met succes een aantal bekende en nieuwe moleculen identificeren die interageren met specifieke genomische regio's (Tabellen 1-3)14-17. Deze techniek slaagde er echter niet in om enkele andere bekende eiwitten te detecteren die met deze regio's interageren. Bijvoorbeeld, STAT1 zou volgens meldingen associëren met de IRF-1 promotor bij IFNγ stimulatie8, maar onze enChIP-SILAC-analyse detecteerde STAT1 niet als een eiwit geïnduceerd om te interageren met deze genomische regio16. Bovendien, in de enChIP-MS-analyse van telomeren, detecteerden we geen shelterine-eiwitten bestaande uit TRF-1 en TRF-215, die zijn aangetoond om met telomeren te interageren26. Er zijn een paar mogelijke redenen voor deze discrepanties. Ten eerste, de stoichiometrie van de binding van Stat1 aan de IRF-1 promotor zou erg laag kunnen zijn. Het is redelijk dat enChIP-MS, inclusief enChIP-SILAC, eiwitten detecteert die meer abundant geassocieerd zijn met doelgenomen regio's; daarom kan de analyse van meer cellen nodig zijn om deze eiwitten te detecteren. Toename van de gevoeligheden van MS-instrumenten zou ook bijdragen aan de efficiënte detectie van eiwitten met lage stoichiometrische binding. Ten tweede, sommige eiwitten, mogelijk inclusief Stat1 en shelterinen, zouden moeilijke doelen kunnen zijn voor MS-analyses. Ten derde, in onze analyse van telomeren-bindende eiwitten15, zouden de 3×FLAG-TAL-eiwitten die telomeren herkennen (3×FN-Tel-TAL) mogelijk de binding van shelterinen aan telomeren op een competitieve manier hebben geblokkeerd.
In tegenstelling tot de relatieve moeilijkheid om transcriptiefactoren te detecteren die aan specifieke genomische regio's binden met behulp van enChIP, hebben we met succes epigenetische regulatoren zoals histonmodificatie-enzymen geïdentificeerd met behulp van enChIP-analyses. Het succes van deze techniek kan te wijten zijn aan het feit dat epigenetische regulatoren aan een breed scala van genomische regio's binden; daarom zijn er meer eiwitten per genomische regio beschikbaar voor MS. Omdat epigenetische regulatoren steeds meer worden erkend als belangrijke doelen voor geneesmiddelen tegen onhandelbare ziekten zoals kanker, zou enChIP een nuttig hulpmiddel zijn voor de identificatie van epigenetische geneesmiddeldoelen.

De identificatie van moleculen geassocieerd met specifieke genomische gebieden van belang is vereist om de regulatiemechanismen van genomische functies zoals transcriptie en epigenetische regulering begrijpen. Hoewel verschillende technieken ontwikkeld voor biochemische analyse van specifieke genomische gebieden 1-7, zijn deze niet op grote schaal gebruikt in dit stadium vanwege hun intrinsieke problemen zoals beperkte toepassing (bijvoorbeeld alleen bij hoge kopieaantal loci of loci met herhalingen) en te veel tijd en inspanningen nodig. Om de biochemische analyse van specifieke genomische gebieden gemakkelijk uit te voeren, hebben we twee locus-specifieke chromatine immunoprecipitatie (ChIP) technologieën, namelijk insertionele chip (ichip) 8-13 en gemanipuleerde DNA-bindende-molecuul bemiddelde chip (enChIP) ontwikkeld 14-17 . In ichip, wordt een meetkundige plaats gelabeld door het inbrengen herkenningssequenties van een exogeen DNA-bindend eiwit zoals LexA. De locus wordt vervolgens geïsoleerd door affiniteitszuivering met de gelabeld DNA-bindend eiwit. In enChIP, gemanipuleerde DNA-bindende moleculen, zoals zinkvinger eiwitten, transcriptie-activator-achtige (TAL) proteïnen, en geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom repeats (CRISPR) complexen worden gebruikt om een meetkundige plaats taggen (figuur 1). Vervolgens wordt het genomische regio geïsoleerd door affiniteitszuivering van het gelabelde DNA-bindende moleculen. Een van de voordelen van enChIP dan ichip is dat insertie van herkenningssequenties van een exogeen DNA-bindende eiwit niet noodzakelijk. Targeting loci met CRISPR complexen bestaande uit een katalytisch inactieve vorm van Cas9 (dCas9) en een gids RNA (gRNA) is veel gemakkelijker dan de gerichtheid van deze regio&#39;s door ichip of enChIP met TAL en zink-vinger eiwitten. Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol voor enChIP gecombineerd met massaspectrometrie en RNA-sequencing (RNA-Seq) naar locus-vereniging te identificerented eiwitten en RNAs, respectievelijk.

<table><tbody><tr><td>gBlock-syntheseservice</td><td>Life Technologies</td><td>Genesynthese door GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>gBlock-syntheseservice</td><td>IDT (Integrated DNA Technologies)</td><td>gBlocks Gene Fragments</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-neo</td><td>Addgene</td><td>51128</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-GFP</td><td>Addgene</td><td>51134</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-DsRed-Express2</td><td>Addgene</td><td>51135</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-hCD2</td><td>Addgene</td><td>51143</td><td></td></tr><tr><td>TAL-syntheseservice</td><td>Life Technologies</td><td>GeneArt Precision TALs</td><td></td></tr><tr><td>3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1</td><td>Addgene</td><td>47948</td><td></td></tr><tr><td>3&times;FLAG-dCas9/pMXs-puro</td><td>Addgene</td><td>51240</td><td></td></tr><tr><td>3&times;FLAG-dCas9/pMXs-IG</td><td>Addgene</td><td>51258</td><td></td></tr><tr><td>3&times;FLAG-dCas9/pMXs-I2</td><td>Addgene</td><td>51259</td><td></td></tr><tr><td>3&times;FLAG-dCas9/pMXs-neo</td><td>Addgene</td><td>51260</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 Ab</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4049</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-medium voor SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89985</td><td>Ander medium kan worden gekocht bij Life Technologies</td></tr><tr><td>Gedialyseerd FBS voor SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89986</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine-2HCl voor SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89987</td><td>Voor Light medium</td></tr><tr><td>L-Arginine-HCl voor SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89989</td><td>Voor Light medium</td></tr><tr><td>L-Lysine-2HCl, 13C6 voor SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89988</td><td>Voor Heavy medium</td></tr><tr><td>L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 voor SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89990</td><td>Voor Heavy medium</td></tr><tr><td>Complete, mini, EDTA-vrij</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4693159</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoon Disruptor UD-201</td><td>Tomy Seiko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChIP DNA Clean &amp; Concentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D5205</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads-Protein G</td><td>Life Technologies</td><td>DB10004</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Isogen II</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Een onderdeel van een nanoLC-MS/MS-systeem voor MS-analyse</td></tr><tr><td>nanoLC</td><td>Advance, Michrom Bioresources</td><td></td><td>Een onderdeel van een nanoLC-MS/MS-systeem voor MS-analyse</td></tr><tr><td>HTC-PAL autosampler</td><td>CTC Analytics</td><td></td><td>Een onderdeel van een nanoLC-MS/MS-systeem voor MS-analyse</td></tr></tbody></table>

isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enchip

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

De identificatie van moleculen geassocieerd met specifieke genomische regio's van belang is vereist om de mechanismen van regulatie van de functies van deze regio's te begrijpen. Om de niet-bevooroordeelde identificatie van moleculen die interageren met een specifiek genomisch gebied van belang mogelijk te maken, hebben we onlangs de door ingenieurs ontwikkelde DNA-bindende molecuul-gemedieerde chromatine-immunoprecipitatie (enChIP) techniek ontwikkeld. Hier beschrijven we hoe enChIP te gebruiken om specifieke genomische regio's te isoleren en de geassocieerde eiwitten en RNA's te identificeren. Eerst wordt een genomisch gebied van belang getagd met een transcriptie-activator-achtige (TAL) eiwit of een geclusterde regelmatig geïnterlinieerde korte palindromische herhalingen (CRISPR) complex bestaande uit een katalytisch inactieve vorm van Cas9 en een geleide RNA. Vervolgens wordt het chromatine gecrosslinked en gefragmenteerd door sonicatie. Het getagde locus wordt vervolgens geïmmunoprecipiteerd en de crosslinking wordt omgekeerd. Ten slotte worden de eiwitten of RNA's die geassocieerd zijn met het geïsoleerde chromatine onderworpen aan massaspectrometrische of RNA-sequencing analyses, respectievelijk. Deze aanpak maakt de succesvolle identificatie van eiwitten en RNA's geassocieerd met een genomisch gebied van belang mogelijk.

Kortom, kan 1-30% van het doel genoomgebieden worden gezuiverd met enChIP. Figuur 3 omvat representatieve data die de opbrengst van enChIP analyses richten telomeren en de promotor van de interferon (IFN) regulerende factor-1 (IRF-1) gen. Als voorbeelden van de typische resultaten, tabel 1 staan ​​de eiwitten in verband met de IRF-1 promotor in een IFNy-specifieke wijze geïdentificeerd door enChIP-SILAC, Tabel 2 geeft de telomeer bindende eiwitten geïdentificeerd door enChIP gecombineerd met massaspectrometrie (enChIP-MS) en Tabel 3 vermeldt de RNA&#39;s geassocieerd met telomeren geïdentificeerd door enChIP-RNA-Seq. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig1.jpg" /> Figuur 1. Overzicht van enChIP. enChIP met CRISPR (A, B) en TAL (C, D, E </strong&gt;) wordt weergegeven. Een locus van belang wordt gelabeld met gemanipuleerde DNA-bindende moleculen zoals TAL eiwit of CRISPR bestaande uit een katalytisch inactieve vorm van Cas9 (dCas) en geleiden RNA (gRNA). De moleculaire interacties worden gefixeerd met formaldehyde of andere verknopingsmiddelen, indien nodig. Vervolgens wordt vastgesteld chromatine gefragmenteerd door sonificatie of enzymatische digestie. De tag genomische gebieden worden gezuiverd door affiniteitszuivering. Tenslotte wordt verknoping omgekeerd, en interactie moleculen (genomische regio&#39;s, RNA en eiwitten) worden geïdentificeerd met behulp van next generation sequencing en massaspectrometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53478/53478fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig2.jpg" /> Figuur 2. Volgorde van gBlock. De U6 promotor (in het zwart), de G nucleotide before de gids sequentie (in het blauw), de gids sequentie (gRNA spacer) (in het rood), het schavot volgorde (in het groen), en de terminatorsequentie (oranje) getoond. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig3.jpg" /> Figuur 3. Opbrengsten van representatieve enChIP analyses. (A) Percentage ingangen voor het doel IRF-1 locus en de niet-target Sox2 locus. (B) Percentage ingangen voor het doel telomeren en non-target γ-satellieten. De cijfers zijn aangepast en gewijzigd ten opzichte van eerdere publicaties 15,16. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Categorieën </td><td> Eiwitten </td></tr><tr><td> Transcriptie </td><td> DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homoloog, PURβ, geactiveerde RNA polymerase II transcriptie-activator p15, BTF3, Myb bindendeiwit 1A </td></tr><tr><td> Histondeacetylering, corepressor componenten </td><td> RBBP4, PA2G4, TBL3 </td></tr><tr><td> Acetyltransferase </td><td> Protein arginine N-methyltransferase 1 </td></tr><tr><td> DNA topoisomerase </td><td> DNA topoisomerase 2α </td></tr><tr><td> Histonen </td><td> Histon H2A.Z, histon H3.2 </td></tr></tbody></table> Tabel 1:. Voorbeelden van eiwitten geassocieerd met het humane IRF-1 promotorgebied in een IFNy-specifieke wijze geïdentificeerd door enChIP-SILAC is de tabel aangepast van een voorgaande publicatie 16. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Categorieën </td><td> Eiwitten </td></tr><tr><td> Zoogdieren telomeren bindende eiwitten </td><td> PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 </td></tr><tr><td> Telomeer-binding eiwitten in gist of andere organismen </td><td> IMAP4 </td></tr><tr><td> Eiwitten interactie met telomeren bindend eiwitten [geassocieerd-telomeer bindend eiwit] </td><td> DNA polymerase α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1] exportin-5 [TERT] GNL3L [TRF1], exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] </td></tr><tr><td> Eiwitten te lokaliseren heterochromatine </td><td> BEND3 </td></tr><tr><td> Eiwitten die epigenetische merken </td><td> KDM5C </td></tr><tr><td> Eiwitten waarvan mutaties invloed telomeer functie </td><td> DNA polymerase α (POLA1), hat1, Nup133, Cdk7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutamaat-cysteïne ligase, glutaredoxin, SMRC1 </td></tr></tbody></table> Tabel 2:. Voorbeelden van eiwitten in verband met de muis telomeren geïdentificeerd door enChIP-MS De tafel heeft adapte geweestd uit een eerdere publicatie 15. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Categorieën </td><td> RNA&#39;s </td></tr><tr><td> Telomerase componenten </td><td> TERC, Rmrp </td></tr><tr><td> Telomerische RNA&#39;s </td><td> Terras </td></tr><tr><td> scaRNAs </td><td> Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 </td></tr><tr><td> H / ACA snoRNAs </td><td> Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a </td></tr><tr><td> C / D snoRNAs </td><td> Snord17, Snord15a, Snord118 </td></tr><tr><td> lncRNA </td><td> Neat1 </td></tr></tbody></table> Tabel 3: Voorbeelden van RNA geassocieerd met muis telomeren geïdentificeerd door enChIP-RNA-Seq tabel werd aangepast van een voorgaande publicatie 17..

De identificatie van moleculen die geassocieerd zijn met specifieke genomische regio's van belang is vereist om de mechanismen van regulatie van de functies van deze regio's te begrijpen. Dit protocol beschrijft procedures om geëngineerde DNA-bindende molecuul-gemedieerde chromatine immunoprecipitatie (enChIP) uit te voeren voor de identificatie van eiwitten en RNA's die geassocieerd zijn met een specifiek genoomgebied.

Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van een specifieke genomische regio met behoud van moleculaire interacties, om moleculen te identificeren die met deze genomische regio interageren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van genomische functies, zoals transcriptie en epigenetische regulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de directe identificatie mogelijk maakt van moleculen die interageren met een specifieke genomische regio.Toshitsugu Fujita, een universitair docent uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Ontwerp de gewenste DNA-bindende moleculen volgens het tekstprotocol. Dit omvat het genereren van de gewenste gBlock-sequentie en het inbrengen ervan in een retrovirus om bijvoorbeeld het guide RNA te produceren in complex met drie FLAG-dCas9.Als alternatief kunnen drie FLAG-TAL-eiwitten worden gegenereerd die de doelsequentie herkennen. Infecteer vervolgens de cellen met het geprepareerde retrovirus volgens het tekstprotocol. Bevestig de expressie van de gemodificeerde DNA-bindende moleculen en vestig de cellijn.Vervolgens worden de cellen gecrosslinkt met formaldehyde. Suspendeer 20 miljoen getransfecteerde cellen in 30 milliliters regulier kweekmedium en voeg 810 microliters 37% formaldehyde toe voor een eindconcentratie van 1%. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten bij 37 degrees Celsius. Stop na vijf minuten de crosslinking-reactie door 3,1 milliliters 1,25 molar glycine toe te voegen.Laat de cellen 10 minuten bij kamertemperatuur staan voordat u verdergaat. Centrifugeer vervolgens de cellenbuis gedurende vijf minuten bij 300 G in een gekoelde centrifuge. Verwijder voorzichtig het supernatant en was de celpellet in 30 milliliters PBS door middel van mengen en centrifugatie.Voer twee PBS-wasstappen uit. Indien nodig kan het gewassen pellet van gefixeerde cellen worden bewaard bij -80 °C. Ga vervolgens verder met het isoleren van het chromatine uit de cellen.Suspendeer deze in 10 milliliters lysisbuffer en incubeer ze 10 minuten op ijs. Verzamel vervolgens de cellen met behulp van een gekoelde centrifuge en verwijder voorzichtig het supernatant. Suspendeer de celpellet nu in nucleaire lysisbuffer en incubeer deze 10 minuten op ijs.Vortex het mengsel elke paar minuten kortstondig tijdens de incubatie. Verzamel de cellen vervolgens opnieuw door middel van centrifugatie. Was nu de pellet met 10 milliliters PBS en verwijder de wasoplossing met een volgende centrifugatiestap.Dit levert de chromatinefractie op, die indien gewenst flash-frozen kan worden en bewaard kan worden bij -80 °C. Ga verder door het chromatinepellet te suspenderen in 800 µL gemodificeerde lysisbuffer drie en breng de suspensie over naar een kleinere buis van 1,5 mL. Zet nu een sonicatieprobe aan op vermogensniveau drie met een continue cyclus.Om het chromatine te fragmenteren, schakelt u handmatig tussen 10 seconden sonicatie en 20 seconden op ijs. Bij elke 5e of 6e cyclus verlengt u de fase op ijs naar twee minuten om oververhitting van het monster te voorkomen. Voer deze sonicatiecyclus 10 tot 18 keer uit, waarbij u de tip van de probe van de bodem van de buis afhoudt om schuimvorming in het monster te vermijden.Verzamel na de sonicatie het monster via een snelle gekoelde centrifugatie. Draag vervolgens het supernatant dat het gefragmenteerde chromatine bevat over naar een nieuwe buis en gooi de pellet weg. Raadpleeg het tekstprotocol voor informatie over het evalueren van de fragmentatie.Ter voorbereiding op de immunoprecipitatie worden de antilichamen eerst geconjugeerd aan Dynabeads. Deze immunoprecipitatie is geschaald voor monsters afgeleid van 20 miljoen cellen. Voeg een 1/5 volume van gemodificeerde lysisbuffer drie met Triton X-100 toe aan het gefragmenteerde chromatine om een eindconcentratie van 1%Triton te verkrijgen.Voeg vervolgens het mengsel toe aan de magnetische beads geconjugeerd met normale muis IgG. Incubeer de reactie gedurende een uur op een rotator met koeling. Trek daarna de beads gedurende drie minuten uit de oplossing met behulp van een magneetstatief.Verzamel vervolgens de supernatant. Breng de supernatant over naar de buis met magnetische beads die geconjugeerd zijn aan anti-FLAG-antilichamen. Laat deze conjugatiereactie een nacht lang draaien op een rotator bij vier graden Celsius.Breng de volgende ochtend gedurende drie minuten een magneet aan op de buis om de beads te verzamelen. Pipetteer vervolgens het supernatant uit de buis en gooi dit weg. Was nu de beads.Suspendeer ze in één milliliter laag-zoutbuffer en incubeer ze gedurende vijf minuten op een rotator bij vier graden Celsius. Isoleer na de incubatie de kralen via magnetisatie en verwijder het supernatant. Herhaal deze wasstap nogmaals met laag-zoutbuffer.Voer met dezelfde techniek nog twee wasbeurten uit met hoog-zoutbuffer. Ga verder met deze methode om de beads twee keer te wassen in lithiumchloridebuffer. Was de beads tot slot eenmaal met TBS-IGEPAL CA-630.Na de zeven wasstappen worden de kraaltjes gesuspendeerd in 200 µL elutiebuffer en gedurende 20 minuten geïncubeerd bij 37 °C. Trek vervolgens de kraaltjes aan via magnetisatie en verzamel het supernatant in een nieuwe buis. Herhaal deze elutiestap om de opbrengsten te verhogen.Zuiver vervolgens ongeveer 5% van het DNA om de opbrengst te schatten. Begin met het mengen van het grootste deel van het eluaat in een precipitatiereactie. Precipiteer het chromatine gedurende de nacht bij -20 °C.Centrifuge de volgende dag het monster en verwijder het supernatant. Spoel de pellet met een milliliter 70% ethanol en herhaal de centrifugatie gedurende 10 minuten. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de pellet in 40 µL 2x monsterbuffer.Vortex de suspensie nu gedurende vijf volledige minuten. Incubeer deze vervolgens 30 minuten bij 100 °C om de cross-linking te denatureren en ongedaan te maken. Draai na het koken 40 µL van het monster op een SDS-PAGE gel.Meestal wordt een gradiënt van 4 tot 20% gebruikt. Laat de gel lopen totdat de kleurstof één centimeter onder de well is gemigreerd. Kleur de gel vervolgens en snijd deze in vijf stukken van ongeveer 2 millimeter lang.Verdun het eiwit uit de gelstukjes en gebruik dit voor massaspectrometrie-analyse. De zuivering van het RNA, gevolgd door sequencing-analyse, wordt beschreven in het tekstprotocol. In totaal kan tot 10% van de doelgenomische regio's worden gezuiverd met behulp van enChIP.Hier zijn de opbrengsten te zien van analyses gericht op de promoterregio van het IRF-1-gen vergeleken met de aspecifieke Sox2-locus. Een ander voorbeeld is het targeten van telomeren versus de aspecifieke gamma-satellietlocus. enChIP SILAC identificeerde verschillende eiwitten die op een interferon gamma-specifieke manier geassocieerd zijn met de IRF-1-promoter.Telomeerbindende eiwitten werden eveneens geïdentificeerd door enChIP in combinatie met massaspectrometrie. Vervolgens werd enChIP RNA-sequencing gebruikt om de RNA's te identificeren die geassocieerd zijn met de telomeren. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van transcriptie en epigenetische regulatie om dergelijke mechanismen in diverse biologische systemen te bestuderen.

isolation-specific-genomic-regions-identification-associated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier presenteren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) procedure voor genoom-brede locatie analyse van eiwit-isovormen die verschillen in een histon-bindend domein. We zijn toe te passen op ChIP-Seq analyse om de doelstellingen van het KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase te identificeren.

Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

Een stap voor stap-protocol om het isoleren en identificeren van RNA bijbehorende complexen door middel van RIP-Chip.

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

In this video, we demonstrate the chromatin immunoprecipitation technique to identify protein binding sites on specific regions of the genomic DNA of oligodendrocyte precursor cells via the selective immunoprecipitation of protein-bound chromatin fragments. This method helps to study the interaction of several regulatory proteins, including transcription factors involved in gene regulation.

Chromatin Immunoprecipitation to Identify Target Protein Binding Sites on Genomic DNA

Deze video artikel beschrijft een in vitro microarray gebaseerde methode om het gen doelstellingen en bindingsplaatsen bepalen voor twee componenten systeem respons toezichthouders.

DNA-affiniteit-gezuiverd Chip (DAP-chip) methode om Gene Doelen bepalen voor bacteriële Twee componenten Regulatory Systems

Hier presenteren we een protocol om een resolutie van bijna base-paar te bereiken van eiwit-DNA-interacties. Dit wordt verkregen door exonuclease-behandeling van DNA-fragmenten die selectief zijn verrijkt door chromatine-immunoprecipitatie (ChIP-exo) gevolgd door high-throughput sequencing.

De chip-exo Methode: Het identificeren van eiwit-DNA interacties met Near basenparen Precision

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

De identificatie van de fysieke interacties tussen genen en regelgevende elementen is uitdagend maar heeft bevorderd door chromosoom conformatie opname methoden. Deze wijziging van het 4C-seq-protocol PCR bias vermindert door het minimaliseren van de over-amplificatie van PCR sjablonen en maximaliseert de mappability van leest door het opnemen van een toevoeging restrictie-enzym digest stap.

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

Hier presenteren we een protocol voor de in vitro selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren (ETR's) met een hoge, langdurige, stabiele, on-target uitschakelingsefficiëntie en een lage genoombrede, off-target activiteit. Deze workflow maakt het mogelijk om een initieel, complex repertoire van kandidaat-ETR's terug te brengen tot een shortlist, geschikt voor verdere evaluatie in therapeutisch relevante settings.

In vitro Selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren voor gerichte epigenetische uitschakeling

De iChip-techniek maakt gebruik van een goedkoop en eenvoudig in-situ isolatieapparaat dat de snelheid van de ontdekking van nieuwe micro-organismen uit de bodem verhoogt. Nieuwe micro-organismen kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek met betrekking tot onder meer het bodemmicrobioom of de ontdekking van natuurlijke producten.

Isolatie van bodemmicro-organismen met behulp van iChip-technologie

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode om directe interacties tussen lncRNA en eiwitten te identificeren.

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode voor de verifieerbare identificatie van eiwitten die direct interageren met LncRNA: van gekweekte cellen tot muistestikels

Leer de enChIP-techniek om specifieke genomische regio's te isoleren en bijbehorende eiwitten en RNA's te identificeren. Deze methode biedt inzicht in transcriptie- en epigenetische regulatiemechanismen.

Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

Meer video's verkennen