Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Het algemene doel van deze methode is om het celmembraanpotentieel te controleren bij stimulatie door zichtbare lichtpulsen. Het fototransductieproces wordt gemedieerd door een lichtgevoelig geconjugeerd polymeer. Deze methode biedt een nieuwe tool in het technologieveld, omdat het een waardevolle alternatief vertegenwoordigt voor bestaande methoden zoals optogenetiek en thermische stimulatie voor optische controle van de activiteit van levende cellen.

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de onmiddellijke integrabiliteit met elk type elektrofysioloog, de potentieel hoge speciale en temporele resolutie, ze verminderen de invasiviteit. Bovendien, het maakt het mogelijk om een genoverdracht te vermijden die vereist is door optogenetiek. Onze methode wordt hier beschreven voor fotostimulatie van in vitro celcultuur.

Maar het kan ook interessante kansen openen voor in vivo toepassingen. Het demonstreren van de procedure zullen Caterina Bossio en Susana Vaquero Morata zijn, post-docs uit onze laboratoria met respectievelijk biologische en fysische chemie achtergrond. Om te beginnen, bereid een oplossing van het lichtgevoelige geconjugeerde polymeer voor door P3HT en PCBM te mengen in chlorobenzeen met een relatieve concentratie van één op één.

Meng de oplossing met een magnetische roerder gedurende minimaal vier uur bij 60 graden Celsius. Reinig vervolgens met indium tin oxide beklede glazen platen met opeenvolgende 10-minuten baden van gedeïoniseerd water, aceton en isopropanol in een sonicator. Droog de deksels met een stikstofpistool en behandel vervolgens de substraten met een plasmareiniger.

Eenmaal schoon, plaats de plaat op de spanklem van een spincoater, met de ITO-gecoate kant naar boven. Voeg vervolgens 150 microliter van de P3HT PCBM-oplossing toe aan de plaat en spincoat het monster. Nadat de spincoater klaar is, verwijder het monster en gebruik een cleanroomdoekje gedrenkt in aceton om de achterkant van het substraat te reinigen.

Steriliseer de fotoactieve substraten door ze in een afgedekte, hittebestendige container te plaatsen en ze twee uur lang op 120 graden Celsius te verwarmen. Breng vervolgens de monsters over naar een steriele kap en laat ze afkoelen. Vanaf dit punt moet de steriliteit van de monsters worden gehandhaafd.

Plaats de fotoactieve substraten in een zeswelplaat. Gezien de hydrofobiciteit van de geconjugeerde polymeerlaag, maak een polydimethylsiloxaanwel om het monster te fixeren en de oplossingen te beperken zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats vervolgens de fotoactieve substraten in de putjes van de plaat en bedek het hele oppervlak van elk monster met 500 tot 750 microliter van een oplossing van twee milligram per liter fibronectine in PBS.

Incubeer de monsters gedurende minimaal een uur bij 37 graden Celsius. Na incubatie, gebruik een glazen pipet om de fibronectine-oplossing te verwijderen en was vervolgens de substraten eenmaal met twee milliliter PBS. Voeg eerst een totaal volume van 750 tot 1.000 microliter compleet groeimedium per putje toe.

Plaats vervolgens 15.000 AGK293-cellen per vierkante centimeter fotoactieve substraat in elk putje. Vervolgens incubeer de cellen gedurende 24 tot 48 uur. Cellen kunnen gemakkelijk op de fotoactieve substraten worden gekweekt, op voorwaarde dat een geschikte hechtingslaag, zoals fibronectine, wordt afgezet.

Om te beginnen, bereid zowel de extracellulaire als intracellulaire oplossingen voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Steriliseer de oplossingen door ze door een 0,2 micron filter te laten lopen. Verwarm vervolgens de extracellulaire oplossing door deze in een waterbad op 37 graden Celsius te plaatsen.

Vul ook een enkele milliliter spuit met de intracellulaire oplossing en uitrust met een 34-gauge naald. Houd de intracellulaire oplossing in contact met ijs om degradatie van het ATP te voorkomen. Neem vervolgens een celbeklede substraat uit de incubator en verwijder voorzichtig de PDMS-wel.

Verwijder vervolgens het groeimedium met een glazen pipet en spoel het monster langzaam met extracellulaire oplossing om celafscheiding te voorkomen. Voeg drie milliliter extracellulaire oplossing toe aan elk putje en breng vervolgens de plaat over naar de monsterhouder van de elektrofysiologie-installatie. Eenmaal op hun plaats, plaats de referentie-elektrode in de put die moet worden getest.

Bereid vervolgens een verse glazen micropipet voor patch clamp voor met behulp van een micropipettrekker. Vul de helft van de pipet met intracellulaire oplossing. Gebruik de micromanipulator om de patchpipet in de nabijheid van de geselecteerde celmembraan te positioneren.

Tijdens het positioneren, breng overdruk aan op de pipet om te voorkomen dat vuil op het uiteinde blijft kleven. Met de pipet enkele micrometers boven de cel, begin met het verlagen van de pipet naar het celmembraan terwijl u de pipetweerstand op de patch control software controleert. Wanneer de pipetweerstand ongeveer één megaohm toeneemt, verwijder de overdruk en breng een zachte zuiging aan om de gigaseal tussen de pipet en het celmembraan te vormen.

Breng vervolgens een negatief potentieel van negatief 40 millivolt aan op de pipet om de verzegeling te stabiliseren. Compenseer voor de capacitieve transientie als gevolg van de pipetcapaciteit met de relatieve commando's op de patch versterker en/of de patch control software. Breng een korte en intense zuiging aan op de pipet om de membraan te breken en elektrische toegang tot het celcytoplasma mogelijk te maken.

Stel vervolgens de patch versterker in op de stroomklemmodus zodat er geen stroom in de cel wordt geïnjecteerd. In de stroomklemmodus, volg het celmembraanpotentieel en wacht een paar minuten totdat het stabiel is. Zodra stabiel, pas het gewenste verlichtingsprotocol toe op de cel door de fotoactieve membraan onder de cel te verlichten met licht in het bereik van 450 tot 600 nanometer.

Neem het effect van het licht op het membraanpotentieel op. Korte lichtpulsen van ongeveer 10 tot 20 milliseconden resulteren in een tijdelijke depolarisatie van de cel, terwijl bij langdurige verlichting van honderden milliseconden een duurzame, hyperbolisatie wordt waargenomen totdat het licht wordt uitgeschakeld.