Name: Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer optische controle van celmembraanpotentiaal met lichtgevoelige geconjugeerde polymeren als alternatief voor optogenetica. Deze niet-invasieve methode biedt hoge ruimtelijke en temporele resolutie zonder gentransfer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd ondersteund door de EU via project FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA, 
Telethon - Italië (grants GGP12033 en GGP14022), Fondazione Cariplo (grant ID 2013-0738).

1. Voorbereiding van Fotoactieve Substrates <ol><li> Bereid een P3HT: PCBM oplossing (1: 1 w / w) in chloorbenzeen bij een P3HT concentratie van 20 g / l. Meng de oplossing met een magnetische roerder gedurende ten minste 4 uur bij 60 ° C. Beschouw een volume van 150 ul oplossing voor elk substraat te bereiden. </li><li> Clean-ITO beklede objectglaasjes (Rs = 10 Ω / vierkant, 18x18 mm 2, dikte 170 pm) met opeenvolgende baden gedeïoniseerd water, aceton en isopropanol in een sonicator (10 min voor elke stap). Droog de dekglaasjes met een stikstof pistool. Doe de monsters in een plasma cleaner bij 100 W vermogen gedurende 10 min. </li><li> Deponeren van een dunne film van de actieve laag op de gereinigde substraten via spin-coating. <ol><li> Met een diamantpunt, snijd een microscoop glasplaatje, (≈ dikte 1 mm) aan dezelfde laterale afmetingen van de ITO-beklede substraten. Verwijder de P3HT: PCBM oplossing van de verwarmingsplaat en laat het afkoelen tot omgevingstemperatuur. </li><li> Stel een twee-steps spin-coater programma: i) 30 sec bij 800 rpm; ii) 30 sec bij 1600 rpm. Plaats de dia op de boorkop van de spin-coater en start de stofzuiger om het te repareren. Een druppel van aceton op de dia en het gereinigde substraat met de ITO-gecoate zijde naar boven. Start de spin-coater draaien om zich te ontdoen van de overtollige aceton. </li><li> Put 150 ui P3HT: PCBM oplossing op de substraten en opnieuw beginnen de spin-coater (hetzelfde protocol in 1.3.2). </li><li> Na de spin-coater is voltooid, verwijdert u het monster en voorzichtig los te maken van de gecoate substraat van het glaasje. Reinig de achterkant van het substraat met een cleanroom doekje gedrenkt in aceton. Opmerking: De fotoactieve substraten kunnen worden bewaard paar dagen in een donkere doos tot gebruik. Voor langere periodes, bewaar ze in een dashboardkastje met een inert gas. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding van celcultuurmedium en Elektrofysiologie Solutions <ol><li> Bereid de volledige groeimedium (CGM) voorHEK-293-cellen: Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) niet warmte geïnactiveerd, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Steriliseer het medium met een 0,2 urn filtratie en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bereid de extracellulaire oplossing in ultrapuur water (concentraties in mm): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 Glucose, 1,8 CaCl2, 1 MgCl2. Stel de pH tot 7,4 met NaOH. Steriliseer de oplossing met een 0,2 urn filtratie en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bereid de intracellulaire oplossing in ultrazuiver water (concentraties in mM): 12 KCl, 125 K-gluconaat, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na2. Merk op dat ATP-Na 2 is warmtegevoelig en voeg deze laatste. Stel de pH tot 7,4 met NaOH. Steriliseer de oplossing met een 0,2 urn filtersysteem, aliquot in 1 ml buizen en bewaar bij -20 ° C. </li></ol> 3. Plating HEK-293 cellende actieve substraten <ol><li> Plaats de fotoactieve substraat in een glazen beker bedekt met aluminium of een afgesloten petrischaal en in een oven bij 120 ° C gedurende 2 uur voor sterilisatie. Vanaf dit moment, voeren alle bewerkingen in steriele omstandigheden. Zet de monsters in een steriele kap en laat ze afkoelen. </li><li> Coat de fotoactieve substraat een hechtlaag aan het oppervlak hydrofobiciteit verminderen en celadhesie bevorderen. <ol><li> Plaats de actieve substraten in een P35 petrischaal of een 6 multiwell plaat. Gezien de hydrofobiciteit van het geconjugeerde polymeerlaag, maak een polydimethylsiloxaan (PDMS) en het monster vast en beperken de oplossingen. <ol><li> Meng PDMS en katalysator in een 10: 1 verhouding met een glazen staaf naar een viskeuze slurry te verkrijgen. </li><li> Giet de slurry in een 6 multiwell plaat, het afgeven van een hoeveelheid die voldoende is om de helft van iedere afdekken. </li><li> Wacht PDMS polymerisatie bij kamertemperatuur. </li><li> Snijd de uitgeharde PDMS in het midden voor obtaining een vierkante vorm van dezelfde afmeting van het polymeer monster. </li><li> Steriliseer de PDMS putten door onderdompeling in een 70% ethanol-water mengsel gedurende tenminste 30 minuten. </li></ol></li><li> Bij gebruik van de PDMS goed, krassen op de fotoactieve laag langs de gehele rand van de put met spitse pincet, zodat losraken van de gehele laag te voorkomen bij het verwijderen van PDMS lang na celkweek. </li><li> Bedek het gehele oppervlak van elk monster met een fibronectine-oplossing (2 mg / l in PBS). Een volume tussen 500-750 ul per monster is meestal voldoende als een PDMS goed wordt gebruikt (helder oppervlak van de put: 15x15 mm 2). Zonder de PDMS goed, ongeveer 2 ml van fibronectine oplossing nodig is om het monster volledig ondergedompeld zijn; let dat de ondergrond niet zweven, terwijl het toevoegen van de oplossing. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende tenminste 1 uur. </li><li> Verwijder de fibronectine-oplossing met een glazen pipet en eenmaal wassen met 2 ml PBS. </li></ol></li><li> Plat HEK-293-cellen op de fibronectine-behandelde monsters bij een dichtheid van 15.000 cellen / cm2 in compleet groeimedium. Gebruik een volume van 750-1000 pl van CGM voor elk monster als een PDMS goed gebruikt, anders 2-3 ml CGM nodig. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24-48 uur. </li></ol> 4. Optische Stimulatie Protocol en elektrofysiologische metingen <ol><li> Zet de extracellulaire oplossing in een waterbad bij 37 ° C te thermaliseren; dooi de intracellulaire oplossing, zet het in een 1 ml spuit met een 34 gauge naald en houd het in contact komt met ijs om degradatie van de ATP te voorkomen. </li><li> Neem een ​​cel-gecoate substraat uit de incubator, zorgvuldig verwijderen van de PDMS goed indien aanwezig. Verwijder het groeimedium met een glazen pipet en spoel het monster met extracellulaire oplossing. Overgaan langzaam naar cel onthechting te voorkomen. </li><li> Zet het apparaat in de monster-houder van de elektrofysiologie station met extracellulaire solution en de referentie-elektrode. Bereid vers glas micropipetten voor patch-klem met een trekker (ideaal weerstand in het bereik 2-4 MQ). Vul de helft van de pipet met intracellulaire oplossing en monteren op de micromanipulator. </li><li> Kijk voor een gezonde cel te patchen op het apparaat. Om ongewenste excitatie van de fotoactieve substraat te voorkomen, gebruikt IR verlichting voor beeldvorming, het plaatsen van een lange-golflengte doorlaatfilter (bijvoorbeeld een cut golflengte λ = 750 nm worden gebruikt voor polymeren absorberen in het zichtbare) voor de microscoop belichtingstoestel. </li><li> Patch de geselecteerde cel en het gewenste protocol voor optische stimulatie toepassing leveren licht op het monster via de fluorescentie excitatie weg van de microscoop (Figuur 1). Een gedetailleerde beschrijving van de patch-clamp-protocol is te vinden in referentie 20. <ol><li> Plaats de patch pipet in de nabijheid van het celmembraan een micrometrische manipulator. Tijdens het positioneren van toepassing overpressure de pipet om vuil kleven aan het uiteinde te voorkomen. De pipet moet enkele microns boven de cel. </li><li> Start verlagen van de pipet naar het celmembraan, terwijl het regelen van de pipet weerstand op de patch besturingssoftware. Wanneer de pipet weerstand van 1 MQ is toegenomen, verwijdert de overdruk uit de pipet onder toepassing van een zachte zuiging, om de gigaseal tussen de pipet en het celmembraan te vormen (dat wil zeggen de gemeten weerstand moet toenemen met waarden groter dan 1 GQ) . </li><li> Breng een negatieve potentiaal op de pipet dicht bij de verwachte cel rustpotentiaal (voor HEK293 cel een potentiaal van -40 mV worden gebruikt) om de afdichting te stabiliseren. Compenseren capacitieve transiënten vanwege de pipet capaciteit met relatief opdrachten op de patch versterker en / of de pleister besturingssoftware. </li><li> Breek het membraan elektrisch toegang tot het cytoplasma toe door een korte, intense afzuiging pulsede pipet. Stel de patch clamp versterker actuele stand (I = 0, dat wil zeggen zonder stroom geïnjecteerd in de cel) het celmembraanpotentiaal volgen. Wacht enkele minuten om te zien of de celpotentiaal stabiel. </li><li> Breng de gewenste belichting protocol naar de cel en neem het effect op de membraanpotentiaal. Opmerking: De verlichting kan worden afgegeven aan het monster ofwel van onderen of van boven, afhankelijk van de microscoop architectuur. <ol><li> Selecteer een excitatiegolflengte die goed wordt geabsorbeerd door het actieve materiaal; de P3HT: PCBM mengsel, kan een golflengte 450-600 nm worden gebruikt. Geschikte foto-excitatie dichtheden in het bereik van 10-100 mW / mm2. Opmerking: Korte lichtpulsen (hierna 10-20 msec) leiden tot een tijdelijke depolarisatie van de cel, terwijl bij langdurige belichting (honderden milliseconden of meer pulsen) een aanhoudende hyperpolarisatie wordt waargenomen tot het licht wordt uitgeschakeld. </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

<ol><li>Alivisatos, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotools+for+Neuroscience+and+Brain+Activity+Mapping%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping.</a> ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).</li>
<li>Spira, M. E., Hai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-electrode+array+technologies+for+neuroscience+and+cardiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology.</a> Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li>
<li>Bareket-Keren, L., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+interfaces+for+light+directed+neuronal+stimulation%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges.</a> Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).</li>
<li>Antognazza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+Light+on+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Shedding Light on Living Cells.</a> Adv. Mater. , (2014).</li>
<li>Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+semiconductors+for+artificial+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Organic semiconductors for artificial vision.</a> J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).</li>
<li>Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic-based+tristimuli+colorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Organic-based tristimuli colorimeter.</a> Appl. Phys. Lett. 90 (16), 163509(2007).</li>
<li>Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+Organic+Electronics+in+Biology%3A+Materials+and+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices.</a> Adv. Mater. , (2014).</li>
<li>Khodagholy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroGrid%3A+recording+action+potentials+from+the+surface+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain.</a> Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).</li>
<li>Campana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocardiographic+Recording+with+Conformable+Organic+Electrochemical+Transistor+Fabricated+on+Resorbable+Bioscaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold.</a> Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).</li>
<li>Bonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Lysinated+Thiophene-Based+Semiconductor+as+a+Multifunctional+Neural+Bioorganic+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22+Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2015).</li>
<li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+organic+transistor+structure+for+bidirectional+stimulation+and+recording+of+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons.</a> Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).</li>
<li>Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rise+of+Organic+Bioelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">The Rise of Organic Bioelectronics.</a> Chem. Mater. 26 (1), 679-685 (2014).</li>
<li>Pires, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+differentiation+by+electrical+stimulation+using+a+cross-linked+PEDOT+substrate%3A+Expanding+the+use+of+biocompatible+conjugated+conductive+polymers+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Gen.+Subjects%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering.</a> BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).</li>
<li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+bioorganic+interface+for+neuronal+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation.</a> Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).</li>
<li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymer+optoelectronic+interface+restores+light+sensitivity+in+blind+rat+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas.</a> Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).</li>
<li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photostimulation+of+Whole-Cell+Conductance+in+Primary+Rat+Neocortical+Astrocytes+Mediated+by+Organic+Semiconducting+Thin+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films.</a> Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).</li>
<li>Martino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+cellular+stimulation+in+functional+bio-polymer+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces.</a> Sci. Rep. 5 (8911), (2015).</li>
<li>Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+solid-liquid+polymer+photodiode+for+the+bioenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment.</a> Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501(2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essentials+of+Neuroscience.+Patch+Clamp+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).</li>
<li>Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+Studies+of+Functionalized+Regioregular+Poly%283-hexylthiophene%29+Layers+for+Sensing+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications.</a> Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).</li>
<li>Bellani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+P3HT%2FOxygen+Charge+Transfer+Complex+Identification+in+Thin+Films+Exposed+to+Direct+Contact+with+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).</li>
<li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+neural+tissue+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of neural tissue in vivo.</a> Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).</li>
<li>Duke, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+selective+suppression+of+neural+activity+with+infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Transient and selective suppression of neural activity with infrared light.</a> Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kritische stappen van de gerapporteerde protocol voor in-vitro optische stimulatie van cellen voornamelijk betrekking op de keuze van de lichtgevoelige polymeer, de thermische sterilisatie parameters, de intensiteit en de duur van het licht stimuli. Een P3HT: PCBM dunne film werd hier gekozen, omdat het garandeert een goede tijd en elektrochemische stabiliteit. Echter, men moet opmerken dat niet alle lichtgevoelige polymeren analoge optredens meer specifiek kan bieden, 22 bij belichting. Bovendien, i...

De mogelijkheid om de cellulaire activiteit een nauwkeurige ruimtelijke en temporele resolutie manipuleren is een belangrijke strategie neurowetenschappelijk onderzoek en bij de behandeling van neurologische en psychiatrische stoornissen. 1 traditionele methoden berusten op elektrische stimulatie van cellen met behulp positioneringen nabijheid of in contact met het beoogde systeem 2 die kunnen van verschillende complexiteit (enkele cel, cellulair netwerk hersencoupes in-vivo hersenweefsel). Tijdens de afgelopen eeuw, hebben het gebruik van de patch-clamp, metaal en substraat geïntegreerde elektroden een gedetailleerd beeld van de fysiologie en pathofysiologie van enkele neuronen en van de werkingsmechanismen van neurale netwerken voorzien. Echter, elektrische stimulatie lijdt aan belangrijke beperkingen. De eerste heeft betrekking op een algemeen slechte ruimtelijke resolutie door de fysieke afmetingen van de elektroden en hun vaste geometrie, die niet gemakkelijk kan worden aangepastcomplexe bestuurde achtige biologische weefsels. Ook kunnen problemen met de elektroden impedantie en overspraak tussen stimulatie en opnamesystemen de uiteindelijke signaal-ruisverhouding van de meting afnemen. 3 Aan de andere kant kan het gebruik van licht voor het stimuleren helpen vele beperkingen te overwinnen van de elektrische benadering. Ten eerste biedt het ongekende ruimtelijke (&lt;1 um) en temporele resolutie (&lt;1 msec), waardoor specifieke celtypen of zelfs sub-celcompartimenten richten. Bovendien is sterk niet-invasief aangezien het vermijdt contact komen met het weefsel van belang en ontwart stimulatie van opname. Bovendien kunnen zowel lichtsterkte en de golflengte nauwkeurig worden geregeld en daarmee diverse stimulatie protocollen kunnen worden toegepast. 3,4 Echter, de meeste dierlijke cellen geen specifieke lichtgevoeligheid presenteren. Verschillende strategieën voor optische stimulation zijn dus voorgesteld, hetzij benutten lichtgevoelige moleculaire mediatoren nabij of binnen de cellen of middels fotoactieve extern apparaat geplaatst nabij de cel. De eerste categorie betreft endogene mechanismen zoals stimulatie via zichtbaar of infrarood (IR) licht, alsmede het gebruik van hetzij fotoisomeriseerbare / splitsbare verbindingen of de genetische expressie van lichtgevoelige moleculaire actuators (optogenetics). De laatste klasse omvat technieken exogene stimulering bereikt met het gebruik van anorganische nano / micro-deeltjes of fotogeleidende siliciumsubstraten. 5 Desalniettemin, al deze systemen lichte kanten en nadelen. Vooral endogene opname van cellen in het zichtbare gebied zwak en onbetrouwbaar, en de gelijktijdige vorming van reactieve zuurstofsoorten kan schadelijk zijn voor de cel. In het algemeen wordt IR gebruikt voor het induceren van lokale thermische opwarming door waterabsorptie, maar de extinctiecoëfficiënt van water klein is, waardoor het nodig strong infrarood licht (van tientallen tot honderden W / mm 2) dat moeilijk te leveren via standaardmicroscoop optica en kunnen veiligheidsoverwegingen in vivo toepassingen opleveren. Anderzijds, foto-schakelbare kooien verbindingen hebben een tijd beperkte werking en vereisen vaak UV licht dat moeilijk te leveren als gevolg van beperkte weefselpenetratie. Verder zij lijden aan diffusieprobleem van de geactiveerde verbindingen bij fotolyse buiten de verlichte zone. Tenslotte hebben optogenetic hulpmiddelen mogen wetenschappers subpopulatie specifieke cellulaire en sub-compartimenten targeten en worden sterk opkomende als een van de belangrijkste technologieën neurowetenschappelijk onderzoek. Echter, het inbrengen van een exogeen DNA-segment via een virale vector roept belangrijke veiligheidskwesties, met name met het oog op goedkeuring op menselijke patiënten. 5,6 Om deze redenen, onderzoek naar nieuwe materialen en apparaten staat cel optische manipulatie is een zeer hot topic. Onlangs is een nieuwaanpak gebaseerd op het gebruik van lichtgevoelige geconjugeerde polymeren, efficiënt kunnen transduceren optische stimulus in een modulatie van cel elektrische activiteit, is voorgesteld. De cel stimulatie door Polymer fotoexcitatie (CSPP) techniek maakt gebruik van een groot aantal key-enabling typische kenmerken van organische halfgeleiders: ze zijn intrinsiek gevoelig voor licht in het zichtbare gebied, 7 ze zijn biocompatibel, zacht en gelijkvormig en hun mechanische flexibiliteit maakt een intieme-interface met weefsel zowel in-vitro en in-vivo 8-10. Daarnaast, kunnen zij gemakkelijk worden gefunctionaliseerd om beter aan te passen aan de interface met levende cellen en specifieke excitatie schakelen indringende en sensing capaciteiten. 11,12 Bovendien ondersteunen zij zowel elektronische als ionentransport, waardoor ze ideaal voor de combinatie Elektronica ad biologie. 13,14 Interessant is dat ze werken in fotovoltaïsche modus, het vermijden van de noodzaak een extern voorspanning f toepassingof efficiënte cel optische stimulatie. 15 De betrouwbaarheid van CSPP techniek is eerder aangetoond in diverse systemen, waaronder primaire neuronen, 15,16 astrocyten, 17 secundaire cellijnen 18 en geëxplanteerd netvlies weefsels. 16 In dit werk, alle stappen die nodig zijn om een lichtgevoelige bio-polymeer fabriceren -interface 19 voor optische stimulatie van in vitro-systemen worden beschreven. Als een studie geval een prototypische organische fotovoltaïsche mix van regio-reguliere poly (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), functioneren als het elektron donor, en fenyl-C61-boterzuur-zuur-methyl ester (PCBM), als de elektronenacceptor wordt toegepast. Als het biologische systeem, zijn humane embryonale nier (HEK-293) cellen gebruikt. Een voorbeeld van een fotostimulering protocol met de relatieve opname van celactiviteit via elektrofysiologische metingen wordt geleverd. De beschreven platformechter algemene geldigheid, en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar het gebruik van andere geconjugeerde polymeren (door juiste instelling van de oplossing voorbereidingsproces en de depositie parameters), verschillende celtypen (door naar behoren het veranderen van de celkweek protocol, plating procedure en de gevraagde voor mobiele zaaien en proliferatie) en verschillende stimulatie protocollen (licht golflengte, stimuli frequentie en duur, foto-excitatie dichtheid).

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITO-gecoate substraten</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>chlorobenzeen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C</td><td>Nano-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>aceton&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HEK-cellen</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8008-</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybride interfaces tussen organische halfgeleiders en levende weefsels vertegenwoordigen een nieuwe tool voor in-vitro en in-vivo toepassingen. Met name geconjugeerde polymeren vertonen verschillende optimale eigenschappen als substraten voor biologische systemen, zoals goede biocompatibiliteit, uitstekende mechanische eigenschappen, goedkope en eenvoudige verwerkingstechnologie en de mogelijkheid om te worden afgezet op lichte, dunne en flexibele substraten. Deze materialen zijn gebruikt voor cellulaire interfaces zoals neurale sondes, transistors voor excitatie en registratie van neurale activiteit, biosensoren en actuatoren voor medicijnafgifte. Recente experimenten hebben ook de mogelijkheid aangetoond om geconjugeerde polymeren te gebruiken voor volledig optische modulatie van de elektrische activiteit van cellen. Verschillende in-vitro studie gevallen zijn gerapporteerd, inclusief primaire neuronale netwerken, astrocyten en secundaire lijncellen. Bovendien is aangetoond dat signaalfoto-transductie gemedieerd door organische polymeren de lichtgevoeligheid in gedegenereerde netvliezen kan herstellen, wat suggereert dat deze apparaten in de toekomst kunnen worden gebruikt voor kunstmatige retinale prothesen. Kortom, lichtgevoelige geconjugeerde polymeren vertegenwoordigen een nieuwe aanpak voor optische modulatie van cellulaire activiteit.
In dit werk worden alle stappen beschreven die nodig zijn om een bio-polymeerinterface voor optische excitatie van levende cellen te fabriceren. De functie van de actieve interface is om het lichtstimulus om te zetten in een modulatie van het celmembraanpotentiaal. Als studie geval, nuttig voor in-vitro studies, wordt een polythiofeendunne film gebruikt als de functionele, lichtabsorberende laag, en Human Embryonic Kidney (HEK-293) cellen worden gebruikt als de biologische component van de interface. Praktische voorbeelden van succesvolle controle van het celmembraanpotentiaal bij stimulatie met lichtpulsen van verschillende duur worden geboden. In het bijzonder wordt aangetoond dat zowel depolariserende en hyperpolariserende effecten op het celmembraan kunnen worden bereikt, afhankelijk van de duur van het lichtstimulus. Het gerapporteerde protocol is van algemene geldigheid en kan eenvoudig worden uitgebreid naar andere biologische preparaten.

Cellen kunnen eenvoudig worden gekweekt op P3HT: PCBM substraten, mits er een geschikte hechtlaag is aangebracht (zoals fibronectine gebruikt in stap 3.2 van de beschreven protocol). P3HT: PCBM optische absorptie pieken in het groene deel van het zichtbare spectrum; maar andere lichtgevoelige geconjugeerde polymeren kunnen worden geselecteerd volgens de gewenste fotostimule- golflengte bereik (figuur 2). Biocompatibiliteit van deze substraten is aangetoond niet alleen ce...

Een methode voor stimulatie van in-vitro celcultuur elektrische activiteit met zichtbaar licht, gebaseerd op het gebruik van organische halfgeleidende polymeren, wordt beschreven.

Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Het algemene doel van deze methode is om het celmembraanpotentiaal te regelen bij stimulatie door pulsen van zichtbaar licht. Het fototransductieproces wordt gemedieerd door een lichtgevoelig geconjugeerd polymeer. Deze methode biedt een nieuw instrument in het technologische veld, aangezien het een waardevol alternatief vormt voor bestaande methoden zoals optogenetica en thermische stimulatie voor de optische controle van de activiteit van levende cellen.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de snelle integreerbaarheid met elk type elektrofysiologische opstelling, de potentieel hoge ruimtelijke en temporele resolutie en de vermindering van de invasiviteit. Bovendien kan hiermee een gentransfer, die bij optogenetica vereist is, worden vermeden. Onze methode voor fotostimulatie van in vitro celculturen wordt hier beschreven.Maar het zou ook interessante mogelijkheden kunnen openen voor in vivo toepassingen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Caterina Bossio en Susana Vaquero Morata, postdocs uit onze laboratoria met respectievelijk een achtergrond in de biologie en de fysische chemie. Begin met het bereiden van een oplossing van het lichtgevoelige geconjugeerde polymeer door P3HT en PCBM te mengen in chloorbenzeen bij een relatieve concentratie van één op één.Meng de oplossing gedurende ten minste vier uur bij 60 °C met een magnetische roerder. Reinig vervolgens met indiumtinoxide gecoate glazen objectglaasjes door ze opeenvolgend 10 minuten in gedemineraliseerd water, aceton en isopropanol in een sonicator te baden. Droog de dekglasjes met een stikstofpistool en behandel de substraten vervolgens met een plasmareiniger.Zodra deze schoon is, plaatst u de slide op de houder van een spincoater, met de ITO-gecoate zijde naar boven gericht. Voeg vervolgens 150 µL van de P3HT PCBM-oplossing toe aan de slide en spincoat het monster. Nadat de spincoater klaar is, verwijdert u het monster en gebruikt u een cleanroom-wattenstaafje gedoopt in aceton om de achterzijde van het substraat te reinigen.Steriliseer de fotoactieve substraten door ze in een afgedekte hittebestendige container te plaatsen en twee uur lang te verhitten bij 120 °C. Verplaats de monsters vervolgens naar een steriele zuurkast en laat ze afkoelen. Handhaaf vanaf dit punt de steriliteit van de monsters.Plaats de fotoactieve substraten in een plaat met zes putjes. Gezien de hydrofobiciteit van de geconjugeerde polymeerlaag, maak een polydimethylsiloxaan-putje om het monster te fixeren en beperk de oplossingen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats vervolgens de fotoactieve substraten in de putjes van de plaat en bedek het gehele oppervlak van elk monster met 500 tot 750 µL van een 2 mg/L oplossing van fibronectine in PBS.Incubeer de monsters gedurende ten minste één uur bij 37 °C. Verwijder na incubatie de fibronectine-oplossing met een glazen pipet en was de substraten vervolgens één keer met 2 mL PBS. Voeg daarna een totaal volume van 750 tot 1.000 µL compleet groeimedium per well toe.Plat vervolgens 15.000 AGK293-cellen per vierkante centimeter fotoactief substraat uit in elke put. Incubeer de cellen daarna gedurende 24 tot 48 uur. Cellen kunnen gemakkelijk worden gekweekt op de fotoactieve substraten, mits er een geschikte adhesielaag, zoals fibronectine, is aangebracht.Bereid eerst zowel de extracellulaire als de intracellulaire oplossingen voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Steriliseer de oplossingen door ze door een 0,2 micron filter te leiden. Voorverwarm vervolgens de extracellulaire oplossing door deze in een waterbad bij 37 °C te plaatsen.Vul daarnaast een spuit van één milliliter met de intracellulaire oplossing en bevestig hieraan een naald van 34 gauge. Houd de intracellulaire oplossing in contact met ijs om degradatie van het ATP te voorkomen. Neem vervolgens een met cellen gecoat substraat uit de incubator en verwijder voorzichtig de PDMS-well.Verwijder vervolgens het groeimedium met een glazen pipet en spoel het monster langzaam met extracellulaire oplossing om celdetachering te voorkomen. Voeg drie milliliter extracellulaire oplossing toe aan elke put en plaats de plaat vervolgens in de monsterhouder van het elektrofysiologische station. Zet de referentie-elektrode in de put die getest moet worden zodra deze op zijn plaats staat.Bereid vervolgens een nieuwe glazen micropipet voor patch clamp met behulp van een micropipet-trekker. Vul de helft van de pipet met intracellulaire oplossing. Gebruik de micromanipulator om de patchpipet in nauwe nabijheid van het geselecteerde celmembraan te positioneren.Oefen tijdens het positioneren overdruk uit op de pipet om te voorkomen dat er vuil aan de tip hecht. Terwijl de pipet zich enkele microns boven de cel bevindt, begint u de pipet richting het celmembraan te laten zakken, terwijl u de pipetweerstand controleert via de patch-controlsoftware. Wanneer de pipetweerstand met ongeveer één megaohm toeneemt, neemt u de overdruk weg en past u een lichte zuigkracht toe om de gigaseal tussen de pipet en het celmembraan te vormen.Breng vervolgens een negatief potentiaal van -40 millivolt aan op de pipet om de seal te helpen stabiliseren. Compenseer de capacitieve overgang door de pipetcapaciteit met de betreffende commando's op de patch-versterker en/of de patch-controlsoftware. Pas een korte en intense zuigimpuls toe op de pipet om het membraan te doorbreken en elektrische toegang tot het cytoplasma van de cel mogelijk te maken.Stel vervolgens de patch-versterker in op de current-clampmodus, zodat er geen stroom in de cel wordt geïnjecteerd. Volg in de current-clampmodus het celmembraanpotentiaal en wacht enkele minuten tot dit is gestabiliseerd. Zodra het stabiel is, past u het gewenste verlichtingsprotocol toe op de cel door het fotoactieve membraan onder de cel te verlichten met licht in het bereik van 450 tot 600 nanometer.Registreer het effect van het licht op de membraanpotentiaal. Korte lichtpulsen van ongeveer 10 tot 20 milliseconden resulteren in een kortstondige depolarisatie van de cel, terwijl bij langdurige bestraling in de orde van honderden milliseconden een aanhoudende hyperpolarisatie wordt waargenomen totdat het licht wordt uitgeschakeld. Optische stimulatie van cellen via de fotoactieve substraten kan leiden tot verschillende effecten op het celmembraan, afhankelijk van de duur van de lichtstimulus.Een snelle piek, zoals hier getoond, wordt gevolgd door een voorbijgaande depolarisatie in de orde van tientallen milliseconden. Bij korte lichtpulsen wordt een tegenovergesteld gedrag waargenomen zodra het licht wordt uitgeschakeld. Deze signalen zijn toegeschreven aan een variatie in de membraancapaciteit als gevolg van lokale opwarming na lichtabsorptie.Bij langdurige belichting gaat de initiële depolarisatie over in een hyperpolarisatie van de cel. Dit fenomeen heeft wederom een thermische oorsprong, maar is in dit geval gerelateerd aan een variatie in het equilibriumpotentiaal van het membraan als gevolg van een verandering in de geleidbaarheid van de ionkanalen, geïnduceerd door de verhoogde temperatuur. Het is belangrijk om op te merken dat deze techniek zeer flexibel is en kan worden aangepast aan de specifieke behoeften van een experiment, bijvoorbeeld door het photoxische polymeer, het fabricatieproces of het belichtingsprotocol te wijzigen.Voordat het protocol echter wordt gewijzigd, moet men eerst de belangrijke eigenschappen van het actieve polymeer verifiëren, zoals de biocompatibiliteit, de geschiktheid voor het sterilisatieproces, en de elektrochemische en temporele stabiliteit. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe een hybride interface tussen geleidende polymeren en levende cellen kan worden gerealiseerd en hoe deze kan worden gebruikt voor optische controle van celactiviteit. Wij geloven dat deze techniek ook veelbelovend is als aanvullend instrument in de neurowetenschappen voor in vitro onderzoek en dat het nieuwe perspectieven opent voor in vivo toepassingen.Om het protocol te verfijnen is echter een sterke en gezamenlijke inspanning van materiaalkundigen, neurowetenschappers, natuurkundigen en artsen noodzakelijk.

optical-control-living-cells-electrical-activity-conjugated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol beschrijft hoe de tijdelijke verwarming die geassocieerd is met de optische absorptie van gouden nanostaafjes, kan worden gebruikt om differentiatie en intracellulaire calciumactiviteit in neuronale cellen te stimuleren. Deze resultaten openen mogelijk nieuwe toepassingen in neurale prothesen en fundamentele studies in de neurowetenschappen.

Goud nanorod-bijgestaan ​​Optische Stimulatie van neuronale cellen

Hier wordt een procedure gepresenteerd om selectief een neuronaal eiwit te activeren met een korte lichtpuls door genetisch een foto-reactieve onnatuurlijke aminozuur te coderen in een doelneuronaal eiwit dat tot expressie wordt gebracht in neuronen in cultuur of in vivo.

Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

Een protocol voor de analyse van gelen gevormd uit de opto-elektronische geconjugeerd polymeer poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl) (P3HT) met behulp van kleine en ultrakleine hoek neutronen verstrooiing in zowel de aanwezigheid en de afwezigheid van verlichting wordt gepresenteerd.

Monitoring van de gevolgen van de verlichting op de structuur van geconjugeerd polymeer Gels met behulp van Neutron Scattering

Hier presenteren we een protocol te analyseren van cel naar cel overdracht van oscillerende informatie door optogenetic control en live monitoring van genexpressie. Deze aanpak biedt een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

Hier beschrijven we optische acquisitie en karakterisering van actiepotentiaalen van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten met behulp van een snel modulair fotometriesysteem.

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Het betrouwbaar controleren van lichtgevoelige zoogdiercellen vereist de standaardisatie van optogenetische methoden. In de richting van dit doel schetst deze studie een pijplijn van gencircuitconstructie, celtechnologie, optogenetische apparatuur en verificatietests om de studie van door licht geïnduceerde genexpressie te standaardiseren met behulp van een negatief feedback optogenetisch gencircuit als casestudy.

Betrouwbare engineering en controle van stabiele optogenetische gencircuits in zoogdiercellen

Het hier gepresenteerde protocol maakt geautomatiseerde fabricage van micropatterns mogelijk die de celvorm standaardiseert om cytoskeletstructuren in zoogdiercellen te bestuderen. Deze gebruiksvriendelijke techniek kan worden opgezet met in de handel verkrijgbaar beeldvormingssystemen en vereist geen gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk is voor standaard celbiologielaboratoria.

Controle van celgeometrie door infrarood laserondersteunde micropatterning

Hier presenteren we de fabricagemethode van een optrode-systeem met optische vezels voor lichtafgifte en een elektrode-array voor neurale opname. In vivo experimenten met transgene muizen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen, tonen de haalbaarheid van het systeem voor gelijktijdige optogenetische stimulatie en elektrofysiologische registratie.

Optrode Array voor gelijktijdige optogenetische modulatie en elektrische neurale opname

Dit protocol omvat het transfecteren van cAMP-sensoren en bPAC-nLuc, een optogenetisch eiwit, om nauwkeurig de cellulaire verdeling en respons op lichtstimulatie te volgen. De innovatieve aanpak van het creëren van een cAMP-responskaart met behulp van een puntscansysteem biedt het potentieel om onderzoek met optogenetische eiwitten op verschillende gebieden te bevorderen.

De cellulaire distributie van een optogenetisch eiwit in kaart brengen met behulp van een lichtstimulatieraster

Dit protocol beschrijft de toepassing van een gemanipuleerd blauw-licht-geactiveerd allosterisch schakelaar (LightR) domein voor omkeerbare spatiotemporele controle van eiwitactiviteit. Door gebruik te maken van Src-tyrosinekinase als model, biedt deze studie een uitgebreid protocol voor het ontwikkelen en karakteriseren van lichtgereguleerde Src (LightR-Src). Het demonstreert de veelzijdigheid van deze aanpak in alle enzymklassen.

Spatiotemporele controle van eiwitactiviteit door optogenetische allosterische regulatie

Het gebruik van licht om hartcellen en -weefsel te controleren, maakt contactloze stimulatie mogelijk, waardoor de natuurlijke staat en functie van de cellen behouden blijven, waardoor het een waardevolle benadering is voor zowel fundamenteel onderzoek als therapeutische toepassingen.

Een cardiaal microfysiologisch systeem voor het bestuderen van Ca2+ propagatie via niet-genetische optische stimulatie

Leer optische controle van celmembraanpotentiaal met lichtgevoelige geconjugeerde polymeren als alternatief voor optogenetica. Deze niet-invasieve methode biedt hoge ruimtelijke en temporele resolutie zonder gentransfer.

Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Meer video's verkennen