Een Neonatale Mouse Spinal Cord Injury Compressie Model
27 maart 2016
Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van een reproduceerbare spinale cord compressie letsel (SCI) in de neonatale muis. Het model biedt een voordelige platform voor het bestuderen van mechanismen van adaptieve plasticiteit die ten grondslag liggen aan spontane functionele herstel.
Het algemene doel van deze procedure is het reproduceerbaar veroorzaken van een compressieletsel van het ruggenmerg bij een pasgeboren muis. Dit wordt bereikt door de muis eerst diep onder narcose te brengen en vervolgens een dorsale laminectomie uit te voeren om het ruggenmerg bloot te leggen.
En tot slot door het veroorzaken van het compressieletsel. Onlangs hebben we een neonataal muismodel voor ruggenmergletsel ontwikkeld en we hebben aangetoond dat neonatale muizen een verbazingwekkende mate van adaptieve plasticiteit vertonen. Het bestuderen van dit mechanisme dat ten grondslag ligt aan het herstel kan belangrijke inzichten verschaft, die gebruikt kunnen worden bij de behandeling van ruggenmergletsel.
In deze video demonstreren we hoe een compressieletsel van het ruggenmerg kan worden veroorzaakt bij een muis van één dag oud. Deze chirurgische procedure omvat anesthesie, laminectomie en twee epidurale compressies met behulp van clips. Voorbereiding op de operatie.
De operatie wordt uitgevoerd onder een stereomicroscoop. Plaats een warmtemat onder de microscoop. Het is cruciaal om de pup warm te houden om plotselinge dood tijdens de operatie te voorkomen.
Plaats een chirurgisch laken of een groot vel schoon, zacht laboratoriumpapier over het warmtekussen. Bereid voor de presurgische analgesie een insulinespuit voor (0,3 milliliter, 30 gauge), gevuld met het lokale anestheticum Marcaine, verdund met steriele PBS tot een eindconcentratie van 2,5 milligram per milliliter. Gebruik voor de huidincisie, spierverwijdering en laminectomie een micronmes, fijne pincetten en fijne iridectomieschaaren.
Let op dat we hier ook een pincet gebruiken waarvan we de punten hebben verbogen om tanden te vormen. Deze werken beter dan commercieel verkrijgbare getande pincetten omdat de tanden zeer klein moeten zijn. Gebruik voor de compressie van het ruggenmerg een speciaal aangepaste Yasargil Temporary Aneurysm Miniclip, die we later zullen beschrijven.
Een kort stukje plastic capillaire buis is ook nodig om een stop te maken die voorkomt dat de clip volledig sluit, evenals een clip-applicator voor het plaatsen van de clip. Gebruik voor het hechten een naaldvoerder en een klein schaartje om de draad door te knippen. Verdun voor de pijnbehandeling Temgesic in steriele PBS tot 0,03 mg/mL.
Het ruggenmergletsel wordt veroorzaakt door compressie met een klem, waarbij een Yasargil Temporary Aneurysm Miniclip wordt gebruikt. Voor gebruik moet de klem mechanisch worden aangepast door de dikte van de bladen met een slijpsteen te verminderen tot 150 micrometers. Vlak voor de operatie wordt een kort stukje plastic slangetje afgesneden en over een van de klembladen geplaatst.
De slang dient als stop om te voorkomen dat de clip volledig sluit. Anesthesie en analgesie. Voor gasanesthesie gebruiken we een suprane-vaporisator die is aangesloten op een zuurstoftank.
Isoflurane is het anestheticum dat wordt verdampt in zuivere zuurstof. Om het mengsel van Isoflurane en zuurstof aan de muis toe te dienen, moet u een neusmasker maken dat is aangepast aan neonaten. Neonatale muizen zijn zo klein dat het masker kan worden gemaakt van de punt van een spuit, die dient als inlaat voor de plastic slang die is verbonden met de uitlaat van de verdamper.
Boor aan de zijkant van het masker een klein gaatje om een afvoerslang aan te sluiten die eindigt in een gereguleerde vacuümpomp met een opvangeenheid, of simpelweg in een zuurkast. Maak een overdrukkamer voor anesthesie met behulp van een plastic petrischaal van 150 bij 25 milliliter. Maak aan één zijde een gat dat groot genoeg is voor de kop van de muis.
Maak aan de tegenovergestelde zijde twee kleinere gaten met dezelfde diameter als de plastic slang. Maak tot slot bovenaan de schaal een evacuatiegat dat kleiner is dan de overige gaten. Knip de punt van een 250 µL pipetpunt af en plaats deze in dit laatste gat.
De pipetpunt fungeert als connector voor de vacuümbuis die is aangesloten op een vacuümapparaat dat is ingesteld op een lichte onderdruk. Bevestig het masker met Plasticine net binnen het gat voor de kop van de muis. Bevestig de plastic slang met tape of Plasticine aan het plafond van de kamer, waarbij u ervoor zorgt dat de slangen goed gepositioneerd zijn in de juiste gaten.
Plaats de kamer op het chirurgische laken onder de microscoop. Het gehele systeem is in dit schema weergegeven. Een driewegkraan is geplaatst op de uitlaat van de vaporizer.
Hier is het pad naar de slaapkamer open, terwijl het pad naar het masker geblokkeerd is, waardoor de muis in de slaapkamer kan worden geplaatst om de sedatie te initiëren. Door de driewegkraan naar rechts te draaien, kan het gas naar het masker stromen en wordt het pad naar de slaapkamer geblokkeerd. In deze configuratie kan de muis naar het masker worden overgebracht.
Gaslekkage wordt door middel van vacuüm uit de overloopkamer verwijderd. Selecteer een muizenwelp die onlangs melk heeft gedronken, wat zichtbaar is aan de witte kleur door de huid. Plaats de welp in de slaapkamer en voeg 4% verdampt Isoflurane toe om een snelle sedatie te bereiken.
Plaats de pup in het masker. Positioneer de snuit van de muis zorgvuldig diep in het masker om voldoende blootstelling aan het anesthesiegas te garanderen. Draai aan de driewegkraan om het gas naar het masker te leiden.
Injecteer subcutaan 50 µL Marcaine met een concentratie van 2,5 mg/mL op de gewenste chirurgische plaats. Let erop dat u niet te diep injecteert, aangezien bloedvaten gemakkelijk kunnen worden geraakt en de introductie van Marcaine in een vat letaal is. Veeg het overtollige Marcaine af met een klein steriel kompres.
Dorsale laminectomie. Verlaag de isofluraanconcentratie naar één tot twee procent. Doorboor na enkele minuten de huid met een micro-mesje en maak een transversale opening van acht tot negen millimeter door de huid voorzichtig in rostrale-caudale richting opzij te trekken.
Een transversale opening is veel praktischer en biedt betere laterale toegang voor het uitvoeren van de laminectomie. Retraheer de randen van de huidincisie van het onderliggende weefsel door stukjes spongistatin subcutaan rostraal en caudaal van de incisie in te brengen. Snijd de prevertebrale spieren door met een dunne schaar om de wervelkolom bloot te leggen.
Houd er rekening mee dat het spinale proces bij de neonatus niet volledig is ontwikkeld. Bepaal de middellijn en knip de lamina transversaal door met de dunne schaar. Let erop dat u niet te diep knipt, aangezien dit potentieel de dura en zelfs het ruggenmerg kan beschadigen.
Plaats voorzichtig één blad van een dunne pincet tussen de lamina en de dura. Pak de lamina vast door de pincet te sluiten en til deze voorzichtig op totdat deze loslaat, waarbij de dura intact blijft. Herhaal deze stap twee tot drie keer om een laminectomie van één tot twee segmenten te verkrijgen.
Beheers de bloeding met kleine stukjes spongistatine. Gebruik de dunne pincet als rongeur om bilateraal delen van de facetgewrichten te verwijderen, zodat er voldoende ruimte ontstaat om de gemodificeerde aneurysma-miniclip in het wervelkanaal te plaatsen. Deze stap resulteert vaak in bloedingen die kunnen worden beheerst met kleine stukjes spongistatine.
Om de zichtbaarheid te verbeteren is het soms voordelig om te spoelen met warme steriele PBS, 37 °C. Het veroorzaken van de compressieletsel van het ruggenmerg. Open de klem en plaats de bladen aan weerszijden van het ruggenmerg in de ruimtes tussen de facetgewrichten en het merg.
Zorg ervoor dat de klembladen diep genoeg zijn ingebracht om het ventrale deel van het ruggenmerg te omvatten. Sluit de clip snel terwijl de applicator op zijn plaats wordt gehouden, om te voorkomen dat de clip naar achteren glijdt. Laat de clip na 15 seconden snel los.
Reinig de wond met spongistatin. Om een symmetrische compressie te verkrijgen, worden de klembladen omgedraaid en wordt een tweede compressie van 15 seconden in de tegenovergestelde richting uitgevoerd. Hechten. Verwijder de stukjes spongistatin die aan het begin van de operatie onder de huid zijn geplaatst en sluit de huid met 6.0 hechtingen.
Injecteer 0,05 milliliters Temgesic, met een concentratie van 0,03 milligrams per milliliter, subcutaan met een insulinespuit van 30 gauge en plaats de pup in een temperatuurgecontroleerde omgeving bij 30 degrees centigrade gedurende enkele uren. Om agressief maternaal gedrag jegens de geopereerde pup tijdens de eerste nacht na de operatie te verminderen, dient een oplossing van Diazepam, verdund in schoon PBS tot 0,1 milligrams per milliliter, te worden bereid voor intraperitonele injectie bij een dosering van acht grams per kilogram. Resultaten.
Zoals te zien is in deze grafiek, zijn zes uur na compressie van het ruggenmerg, op de lagere thoracale niveaus, de achterpoten van de gewonde muizen verlamd, terwijl de voorpoten dat niet zijn. In het geval van de sham-controledieren, die alleen een laminectomie ondergingen, zijn zowel de achterpoten als de voorpoten zeer mobiel. De sectie van het ruggenmerg laat residueel bloed zien op de plaats van het letsel.
Daarnaast is het weefsel doorschijnend, wat duidt op weefselverlies, wat vaak enkele dagen later leidt tot de vorming van een caviteit. Conclusie. Na deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een compressieletsel van het ruggenmerg kunt veroorzaken bij een neonatale muis. Het voordeel van het gebruik van neonatale muizen is dat we specifieke methoden kunnen toepassen om adaptieve plasticiteit aan te pakken, die niet kunnen worden gebruikt bij volwassen muizen.
Daarnaast biedt het model een platform voor het testen van therapeutische benaderingen, zoals stamceltransplantatie.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van een reproduceerbare compressieletsel van het ruggenmerg (SCI) bij pasgeboren muizen. Dit model is voordelig voor het bestuderen van de mechanismen van adaptieve plasticiteit die ten grondslag liggen aan spontaan functioneel herstel.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Neurobiologie
- Letselmodellen
Achtergrond
- Dwarslaesies kunnen leiden tot aanzienlijke functionele beperkingen.
- Neonatale muizen vertonen een opmerkelijk herstelvermogen.
- Inzicht in adaptieve plasticiteit is cruciaal voor de ontwikkeling van behandelingen.
- Dit model maakt gecontroleerde experimenten naar SCI mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om een reproduceerbaar model van compressieletsel aan het ruggenmerg vast te stellen.
- Om de herstelmechanismen bij neonatale muizen te onderzoeken.
- Om inzichten te verschaffen voor potentiële therapeutische benaderingen.
Gebruikte methoden
- Diepe anesthesie van neonatale muizen.
- Dorsale laminectomie om het ruggenmerg bloot te leggen.
- Compressieletsel met behulp van een gemodificeerde Yasargil Temporary Aneurysm Miniclip.
- Postoperatieve analgesie voor pijnbestrijding.
Belangrijkste resultaten
- Het model induceert succesvol een compressieletsel van het ruggenmerg.
- Neonatale muizen vertonen significante adaptieve plasticiteit na het letsel.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstige behandelingen voor ruggenmergletsel informeren.
- Een gedetailleerd chirurgisch protocol waarborgt de reproduceerbaarheid van het model.
Conclusies
- Dit model is een waardevol instrument voor het bestuderen van ruggenmergletsels.
- Inzicht in herstelmechanismen kan leiden tot betere therapieën.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op dit fundamentele werk.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Dit model voor compressie van het ruggenmerg bij pasgeboren muizen maakt mechanistisch onderzoek naar adaptieve plasticiteit bij herstel na letsel op vroege leeftijd mogelijk en biedt een ziekte-relevant systeem om therapeutische hypothesen te valideren. Door de dynamiek van spontaan functioneel herstel vast te leggen, ondersteunt het model doelwitvalidatie en fenotypische screening in preklinische neurowetenschappelijke programma's. De relevantie voor pediatrisch ruggenmergletsel en de potentiële translationele continuïteit naar indicaties bij volwassenen verbeteren de besluitvorming op portfolioniveau bij de ontdekking van neurotherapeutica.
Strategische toepassingen in biofarma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken die verband houden met mechanismen van adaptieve plasticiteit bij dwarslaesies.
- Operationele waarde: Biedt een biologisch relevant systeem voor functionele targetvalidatie via gedragsmatige en elektrofysiologische read-outs.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door plasticiteitsroutes uit de vroege levensfase te koppelen aan potentiële therapeutische targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert een gestandaardiseerd, reproduceerbaar letselmodel dat geschikt is voor het screenen van verbindingen en het testen van therapeutische interventies.
- Kwantitatieve output: Faciliteert metingen van afhankelijke variabelen, waaronder de mobiliteit van de achterpoten, synaptische connectiviteit en elektrofysiologische activiteit.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt high-throughput optische registratie en ex vivo fysiologische analyse voor verdere ontwikkeling van assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Modelleert pediatrisch dwarslaesie met bewijs van acute uitval van de achterpoten en functioneel herstel binnen twee weken.
- Translationele continuïteit: Maakt gebruik van gedeelde plasticiteitsmechanismen tussen het neonatale en het volwassen ruggenmerg voor het verkrijgen van inzichten over verschillende leeftijden.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt evaluatie van therapeutische kandidaten mogelijk met functioneel herstel en synaptische herverbinding als predictieve biomarkers.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het model past binnen het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot preklinische effectiviteitsstudies, in het bijzonder voor neuroprotectieve en neurorestauratieve benaderingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing naar adaptieve plasticiteit en mechanismen voor functioneel herstel na compressie van het ruggenmerg.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk voor de evaluatie van verbindingen met behulp van kwantificeerbare gedragsmatige en fysiologische eindpunten.
- Analytics: Genereert metingen van afhankelijke variabelen, zoals elektrofysiologische signalering en optische registratie van synaptische connectiviteit.
- Translationeel onderzoek: Verbindt bevindingen over plasticiteit in de vroege levensfase met ruggenmergletsel bij volwassenen via geconserveerde biologische mechanismen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor iteratieve toetsing van therapeutische interventies in de discovery- en preklinische fasen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van het target door mechanismen van spontaan herstel en adaptieve plasticiteit te verduidelijken.
- Operationele waarde: Levert een reproduceerbaar chirurgisch model met gestandaardiseerde compressieparameters en postoperatieve zorg.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege efficiëntiesignalen te bieden in een letselmodel met een hoge plasticiteit.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van neurotherapeutica mogelijk op basis van functioneel herstel en biomarkers voor synaptisch herstel.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in de omgang met neonatale muizen, microchirurgie en elektrofysiologische registratietechnieken.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder een stereomicroscoop, een applicator voor aneurysma-miniclips en temperatuurgecontroleerde herstelsystemen.
- Vereist standaardisatie tussen chirurgische teams voor een consistente laminectomie en het toedienen van het compressietrauma.
- Omvat overwegingen met betrekking tot adaptatie bij het vertalen van bevindingen van neonatale naar adulte contexten of menselijke contexten van het ruggenmerg.
- Praktische beperkingen omvatten de specificiteit van het model voor vroege postnatale stadia en potentiële variabiliteit in de ernst van het letsel als gevolg van de plaatsing van de clip.
