Een muismodel voor Laser-geïnduceerde Choroïdale Neovascularisatie
27 december 2015
Hier presenteren we het protocol voor laser-geïnduceerde choroïdale neovascularisatie (CNV) bij muizen, een experimenteel model dat de vasculaire kenmerken van neovasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) nastreeft. Eenmaal onder de knie, kan het op betrouwbare en effectieve wijze CNV induceren als modelsysteem om verschillende experimentele maatregelen te testen.
Het algemene doel van deze procedure is om de kenmerken van neovasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie of een MD na te bootsen in een gemakkelijk te bestuderen diermodel. Deze methode kan worden gebruikt om verschillende facetten van neovasculaire A MD-onderzoek te bestuderen, inclusief hoe genetische veranderingen of farmaceutische behandelingen de ziekte kunnen beïnvloeden of hoe de ziekte zich kan manifesteren onder verschillende beeldvormingsmodaliteiten. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze, eenmaal beheerst, gemakkelijk kan worden gereproduceerd, waardoor experimenten snel en efficiënt kunnen worden uitgevoerd.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat ze de fijne behendigheid en coördinatie missen om succesvol te zijn, die allebei verbeteren met oefening. Om de positie van de laserstation te voorbereiden, zet de laser en de spleetlamp in een positie waar deze gemakkelijk toegankelijk is, zet de laser aan en stel hem in op de vooraf bepaalde parameters. Hier worden de instellingen 75 micrometer, spotgrootte, 100 milliwatt vermogen en 100 milliseconden duur gebruikt.
Plaats vervolgens de anesthesie-dierverwarmingsdoekjes en oogdruppels binnen gemakkelijk bereik van de laseroperator. Nadat de eerste muis is geanesthetiseerd, plaats deze gedurende ongeveer drie tot vijf minuten op de dierverwarming. Voer een teenprik uit om volledige anesthesie te garanderen.
Gebruik vervolgens een opgerolde doekje om nasale aspiratie van vloeistofdruppel te voorkomen. Plaats een druppel van 30 microliter tetracainehydrochloride in elk oog. Wacht twee minuten tot de oplossing zijn werking heeft.
Breng vervolgens één druppel topische tropic aide aan op elk oog om de pupillen te verwijden. Wacht twee minuten tot de oplossing zijn werking heeft. Plaats nu snel de muis op de muizenstandaard en zet vervolgens de standaard op de kinsteun van de spleetlamp.
Schakel de spleetlamp in en stel deze in op de laagste lichthelderheid. Beoordeel de pupilverwijding van de muis. Als de pupil geen 2,5 tot drie millimeter verwijding heeft bereikt.
Breng de muis terug naar de dierverwarming of breng een extra druppel tropic aide aan na de pupilverwijding. Orienteer de muis op het platform zodat deze horizontaal en haaks op de spleetstraal ligt. Draai de muis lichtjes zodat deze zich niet op een hoek van ongeveer 170 graden bevindt.
Met de kop dichter bij de laseroperator, positioneer de muis zo dicht mogelijk bij de spleetlamp terwijl de stabiliteit van het platform wordt gehandhaafd en er genoeg ruimte wordt gelaten voor de operator om fijne motorische manipulaties uit te voeren. Zodra de muis correct is gepositioneerd, breng één druppel kunsttranenoplossing aan op een glazen deksel van 25 millimeter bij 25 millimeter. Plaats ook één druppel van deze oplossing op het ondoelwitte oog van de muis om uitdroging te voorkomen.
Grijp een hoek van het deksel vast tussen de duim en wijsvinger en wikkel de overige drie vingers om de muis heen om zowel het dier als de hand van de operator te ondersteunen en te stabiliseren. Druk vervolgens voorzichtig het deksel in. Glijd op het oog van de muis om het hoornvlies plat te maken.
Positioneer het deksel haaks op de laserstraal om verstrooiing of reflectie van de straal te voorkomen. Kijkend door de spleetlamp, gebruik de vrije hand om de focus aan te passen tot de retina in beeld komt. De retina zou lichtgeel tot rood moeten zijn met duidelijke rode bloedvaten. Beweeg langzaam en voorzichtig het hoofd of het deksel van de muis totdat de oogzenuw wordt waargenomen.
De oogzenuw zal geel zijn met meerdere bloedvaten die ervan uitstralen. Schakel vervolgens de laserfocusstraal in en manoeuvreer deze om zich te concentreren op het retinale pigmentepitheel of RPE van de fundus oculi. Als de focusstraal eivormige of onscherpe lijkt, pas dan de focus van de spleetlamp of het deksel aan.
Wanneer de focusstraal correct is aangepast, gebruik de voetschakelaar om lasertoediening te starten. Er zou direct na de lasertoediening een bubbel moeten ontstaan. Lesies met wazige randen of ogen met hemorragische laesies moeten worden uitgesloten van analyse. Zorg ervoor dat u de bubbelvorming en een duidelijke, scherp gedefinieerde cirkelvormige zone observeert die een gerichte laserbrand aangeeft.
Lesies die geen bubbel produceren, kunnen mogelijk geen geschikte CNV induceren. Maak extra laesies op alle gewenste posities van choroïdale neovasculaire of CNV. Schakel de laser naar standby-modus wanneer deze niet in gebruik is en noteer in een laboratoriumnotitieboek de locatie en het resultaat van elke lasertoediening.
Herhaal de lasertoediening voor het tweede oog van de muis met behulp van een nieuw deksel en de andere hand om de muis te stabiliseren. Na het voltooien van alle toediening, zet de laser en de spleetlamp uit, gooi het deksel weg en plaats de muis op de dierwarmer. Macroscopisch.
Inspecteer het oog op eventuele schade aan het hoornvlies of cataract. Breng de muis na herstel terug naar zijn kooi. CNV's werden gekwantificeerd via analyse van plat gemonteerde choroïden na immunofluorescente kleuring hier.
Labeling met FITC-dextran werd gedaan via perfusie onmiddellijk vóór het doden van het dier. Dit werd gevolgd door oppervlaktekwantificering via drempelstelling in Image J. Hier werd postmortem immunokleuring met de endotheliale celmarker ISO selectine GS IB vier uitgevoerd, gevolgd door beeldvorming via confocale microscopie.
3D-reconstructies van de CNV-laesie op FOSS en zijkant werden gegenereerd. Ook optische coherentietomografie-beeldvorming werd gebruikt om de CNV-laesies in vivo te visualiseren. Hier wordt een dwarsdoorsnede van de retina getoond met een CNV-laesie omcirkeld in geel.
Een en FOSS-beeld van de laesie wordt ook getoond, omcirkeld in geel. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 10 minuten worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het dier goed is geanesthetiseerd en om uw handen zo te positioneren dat het wordt
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het induceren van choroidale neovascularisatie (CNV) bij muizen, waarbij de vasculaire kenmerken van neovasculaire maculadegeneratie (AMD) door ouderdom worden nagebootst. De methode is ontworpen om reproduceerbaar en efficiënt te zijn voor diverse experimentele studies.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Oogheelkunde
- Experimentele Modellen
Achtergrond
- Neovasculaire AMD is een belangrijke oorzaak van visusverlies.
- Diermodellen zijn essentieel voor het bestuderen van ziektemechanismen.
- Het CNV-model maakt het mogelijk om genetische en farmaceutische interventies te testen.
- Een goede fijne motoriek is cruciaal voor een succesvolle uitvoering van het protocol.
Doel van de studie
- Om de kenmerken van neovasculaire AMD in een muismodel te reproduceren.
- Om onderzoek naar de effecten van behandelingen en genetische factoren te faciliteren.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van de ziekteprogressie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van het laserstation met specifieke instellingen.
- Gebruik van een laser en spleetlamp voor het induceren van CNV.
- Monitoring van de geïnduceerde neovascularisatie.
- Beoordeling van de reproduceerbaarheid en efficiëntie van het model.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol induceert effectief CNV bij muizen.
- Zodra de methode onder de knie is, maakt deze snelle experimentatie mogelijk.
- Er is variabiliteit in het succespercentage waargenomen bij onervaren gebruikers.
- Het model kan worden gebruikt om verschillende onderzoeksrichtingen voor AMD te verkennen.
Conclusies
- Het muismodel voor CNV is een waardevol instrument voor onderzoek naar AMD.
- Beheersing van de techniek is essentieel voor consistente resultaten.
- Deze methode kan het begrip van AMD en potentiële behandelingen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het laser-geïnduceerde muismodel voor choroidale neovascularisatie (CNV) biedt een reproduceerbaar en kosteneffectief systeem voor het bestuderen van neovasculaire maculadegeneratie (AMD) gerelateerd aan leeftijd, waardoor een snelle evaluatie van genetische en farmacologische interventies mogelijk is. Het nut ligt in het modelleren van angiogene routes die relevant zijn voor targetvalidatie en preklinische risicoreductie bij de ontdekking van oogheelkundige geneesmiddelen. Het model ondersteunt mechanistische studies en therapeutische screening, en biedt translationele continuïteit van ontdekking tot lead-optimalisatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar angiogene paden en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van CNV.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via genetische manipulatie en fenotypische read-outs.
- Strategische waarde: Faciliteert hypothesetoetsing en biologische risicoreductie van targets die betrokken zijn bij vasculaire dysregulatie.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare CNV-laesies via immunofluorescentiekleuring en ImageJ-thresholding voor dosis-responsanalyse.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde inductie van laesies mogelijk met reproduceerbare laserparameters (75 µm spotgrootte, 100 mW vermogen, 100 ms duur).
- Strategische waarde: Maakt high-throughput evaluatie mogelijk van de effecten van verbindingen op vasculaire lekkage en neovascularisatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert ziekterelevante angiogenese om de therapeutische effectiviteit in een levend systeem te beoordelen.
- Operationele waarde: Compatibel met beeldvormingsmodaliteiten zoals optische coherentietomografie (OCT) en confocale microscopie voor longitudinale monitoring.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door targetmodulatie te koppelen aan fenotypische uitkomsten in een preklinisch AMD-model.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Het model past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetidentificatie tot lead-optimalisatie en biedt fenotypische read-outs die bijdragen aan beslissingen over preklinische voortgang.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en targetvalidatie via induceerbare CNV-vorming in wild-type en transgene muizen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantificeerbare angiogene resultaten die geschikt zijn voor screening van compound-bibliotheken.
- Analytics: Maakt kwantificering van het laesieoppervlak en 3D-reconstructie mogelijk voor comparatieve analyse over verschillende experimentele condities.
- Translational Research: Verbindt moleculaire interventies met vasculaire pathologie, ter ondersteuning van preklinische evaluatie op basis van biomarkers.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor iteratieve tests van genetische en farmacologische modifiers van CNV.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid over target-engagement door angiogene responsen in vivo te modelleren.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbaarheid en schaalbaarheid zodra technische bekwaamheid is bereikt, waardoor experimentele variabiliteit wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door snelle iteratie en vroege detectie van falen in AMD-programma's mogelijk te maken.
- Impact op de portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van hun modulatie van CNV-fenotypes.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microchirurgie, laser-weefselinteractie en retinale visualisatie onder begeleiding van een spleetlamp.
- Afhankelijk van een precieze laserkalibratie en een stabiele positionering van het dier om een consistente laesievorming te garanderen.
- Standaardisatie tussen verschillende operators is noodzakelijk om variabiliteit bij de inductie en kwantificering van CNV te minimaliseren.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten transgene achtergronden en alternatieve imaging-eindpunten voor pathway-specifieke read-outs.
- Praktische beperkingen omvatten de acute, door letsel geïnduceerde aard van angiogenese, die de chronische pathofysiologie van AMD mogelijk niet volledig repliceert.
